陳輔葉，劉永紅，董國(guó)娟，麥麥提江·莫明，阿力木尼亞孜·亞森，伍健

1.莎車縣人民醫(yī)院病理科，新疆 莎車 844700；

2.莎車縣人民醫(yī)院省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 莎車844700；

3.浦東新區(qū)浦南醫(yī)院病理科，上海 200125

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)為食管癌最常見的病理類型，約占食管癌的95%。ESCC預(yù)后較差，五年生存率低于10%，嚴(yán)重威脅人民群眾的身體健康。新疆是ESCC的高發(fā)地區(qū)，其中以哈薩克族人群發(fā)病率最高，可能和當(dāng)?shù)厝孙嬍沉?xí)慣和環(huán)境因素有關(guān)[1]。新疆常住漢族人群ESCC的發(fā)病率為13/10萬，而哈薩克族發(fā)病率可達(dá)到155.9/10萬，是漢族人群的10余倍[2]。新疆莎車縣是維吾爾族人口最多的地區(qū)，ESCC是當(dāng)?shù)氐某Ｒ姴『透甙l(fā)病。

腫瘤的免疫微環(huán)境在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用越來越受到人們的重視。程序性死亡-配體1(programmed death-ligand 1，PD-L1)信號(hào)通路的激活可以產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫逃逸作用，其已成為免疫治療新的熱點(diǎn)。然而，對(duì)于惡性腫瘤組織中PD-L1表達(dá)的臨床預(yù)測(cè)也有一些自相矛盾的研究結(jié)果[3-4]。CD4+或CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltration lymphocytes，TIL)代表了宿主對(duì)惡性腫瘤的免疫能力，對(duì)于評(píng)估機(jī)體抗腫瘤的免疫能力有重要意義[5]。本研究采用免疫組化方法對(duì)ESCC腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)和CD8+TIL密度進(jìn)行檢測(cè)，分析它們與臨床病理特征或患者總體生存時(shí)間(overall survival，OS)間的相關(guān)性，以期探討PD-L1表達(dá)和CD8+TIL密度在ESCC預(yù)后和腫瘤免疫治療中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集新疆莎車縣人民醫(yī)院病理科2016年6月至2021年6月ESCC標(biāo)本167例(活檢標(biāo)本110例及根治標(biāo)本57例)進(jìn)行回顧性研究。其中男性116例，女性51例；平均年齡(64.99±9.09)歲；發(fā)生在食道上段31例、中段48例和下段88例。57例ESCC根治標(biāo)本中，腫瘤平均(4.89±1.84)cm，其中Ⅰ~Ⅱ期38例，Ⅲ~Ⅳ19例。入組病例臨床病理資料均完整，病理切片均經(jīng)過兩名高年資病理醫(yī)師獨(dú)立復(fù)片，有診斷分歧的切片經(jīng)第三名病理醫(yī)師閱片后協(xié)商決定。所有患者術(shù)前均未實(shí)施放化療等其他方案治療，其中142例患者(110例活檢標(biāo)本和32例手術(shù)根治標(biāo)本)有隨訪資料。本研究經(jīng)新疆莎車縣人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)與制備組織芯片組織芯片由蘇州百道醫(yī)療公司制備并提供技術(shù)支持。選取符合入選標(biāo)準(zhǔn)的食管癌根治標(biāo)本的蠟塊，采用雙盲法由病理醫(yī)師對(duì)石蠟標(biāo)本中有代表性的部位進(jìn)行標(biāo)記。設(shè)計(jì)為10個(gè)組織陣列，用直徑1.5 mm的細(xì)針打孔，將供體蠟塊中標(biāo)記好的組織芯取出后整齊排列到受體蠟塊上，制成組織芯片蠟塊。

1.2.2 免疫組化將符合入選標(biāo)準(zhǔn)的ESCC活檢組織蠟塊及根治標(biāo)本組織芯片進(jìn)行4μm厚切片后行HE及免疫組織化學(xué)染色。切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，滴加一抗PDL-1(美國(guó)，Abcam公司，兔抗人，貨號(hào)：ab228415)和CD8(蘇州百道，兔抗人，貨號(hào)：PA577)，37℃水浴箱孵育2 h后加二抗，DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色，常規(guī)脫水，透明和封片。

1.2.3 免疫組化評(píng)分免疫組化評(píng)分參照Sinicrope等采用半定量評(píng)分法進(jìn)行，采用雙盲法對(duì)每張切片在高倍鏡(×400)下計(jì)數(shù)10個(gè)視野[6]。PD-L1的評(píng)分方法如下：染色強(qiáng)度分別計(jì)0~3分(無表達(dá)為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分)乘以陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分(＜1%為0分，1%~5%為1分，6%~25%為2分，25%~50%為3分，＞50%為4分)?？偡?~1分為PD-L1低表達(dá)組；總分2~12分為高PD-L1表達(dá)組。CD8+TIL的密度判斷方法如下：40倍鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域CD8+細(xì)胞總數(shù)，陽性細(xì)胞總數(shù)除以300后得到評(píng)分，當(dāng)CD8+細(xì)胞＜100個(gè)時(shí)，評(píng)分為0；細(xì)胞＞1 200個(gè)時(shí)，為5分?？偡?~2分為CD8+TIL低密度組；總分3~5分為CD8+TIL高密度組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示；采用χ2檢驗(yàn)分析PD-L1表達(dá)、CD8+TIL密度和臨床病理特征的關(guān)系；Kaplan-Meier單因素法分析PD-L1表達(dá)、CD8+TIL密度與OS的關(guān)系，并繪制生存曲線圖；單因素和多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型回歸分析風(fēng)險(xiǎn)因子和OS的關(guān)系；Kaplan-Meier單因素法分析不同PD-L1表達(dá)/CD8+TIL密度亞組與OS的關(guān)系。均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞PD-L1和TIL CD8免疫表達(dá)PD-L1表達(dá)主要定位在腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，見圖1。

圖1 免疫組化標(biāo)記PD-L1和CD8Figure1 Immunohistochemical markersof PD-L1 and CD8

2.2 PD-L1表達(dá)、CD8+TIL密度與臨床病理特征的關(guān)系χ2檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達(dá)在不同腫瘤浸潤(rùn)深度組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)至食道被膜時(shí)，PD-L1的表達(dá)較高。CD8+TIL密度在是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，CD8+TIL低密度組易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。同時(shí)，χ2分析顯示PD-L1表達(dá)在不同CD8+TIL密度組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，PD-L1高表達(dá)組CD8+TIL密度較高，見表1。

表1 PD-L1表達(dá)、CD8+TIL密度和臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]Table1 Relationship between PD-L1 expression,CD8+TIL density and clinicopathological features[n(%)]

2.3 PD-L1表達(dá)、CD8+TIL密度與生存的關(guān)系Kaplan Meier單因素生存分析結(jié)果顯示，PD-L1低表達(dá)組或CD8+TIL高密度組預(yù)后較好，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 食道癌患者Kaplan-Meier生存曲線Figure2 Kaplan-Meier survival curveof esophageal cancer patients

2.4 單因素和多因素COX回歸分析生存相關(guān)危險(xiǎn)因素單因素COX回歸分析結(jié)果顯示，性別、PD-L1表達(dá)和CD8+TIL密度與預(yù)后相關(guān)(P＜0.05)，女性、低PD-L1表達(dá)或高CD8+TIL密度的患者預(yù)后較好。多因素COX回歸分析結(jié)果顯示PD-L1表達(dá)和CD8+TIL密度是預(yù)測(cè)ESCC預(yù)后的有效指標(biāo)(P＜0.05)，見表2。

表2 單因素和多因素COX生存預(yù)后回歸分析Table2 Univariateand multivariate COX regression analysisof survival prognostic factors

2.5 PD-L1表達(dá)和CD8+TIL密度亞組與生存的相關(guān)性Kaplan-Meier單因素法分析不同PD-L1表達(dá)和CD8+TIL密度亞組與生存的關(guān)系結(jié)果顯示，低PD-L1表達(dá)/高CD8+TIL密度亞組預(yù)后最好，高PD-L1表達(dá)/低CD8+TIL密度亞組預(yù)后最差，各亞組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 食道癌PD-L1表達(dá)、CD8+TIL密度不同亞組生存曲線Figure 3 Survival curves of esophageal cancer patients with different PD-L1 expression and CD8+TIL density

3 討論

中國(guó)是ESCC的高發(fā)國(guó)家，男，女發(fā)病比例約為2∶1。新疆ESCC高發(fā)可能與炎癥、創(chuàng)傷、遺傳以及生活習(xí)慣等因素有關(guān)，但具體機(jī)制不詳。大部分ESCC患者為中晚期，5年生存率不足20%。隨著新輔助化療，微創(chuàng)手術(shù)和精準(zhǔn)放療等治療手段的進(jìn)步，5年生存率提升到30%左右；ESCC仍是威脅人民健康的常見惡性腫瘤。目前，基于過繼細(xì)胞療法、抗體和疫苗的免疫治療，通過防止免疫逃逸和改變免疫反應(yīng)，為多種惡性腫瘤的治療帶來新的希望[7]。

PD-L1是分子量為40 kDa的跨膜蛋白配體，與PD-1受體結(jié)合后，傳遞抑制信號(hào)，阻止T細(xì)胞活化和增殖，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡[8]。PD-L1和鱗狀細(xì)胞癌關(guān)系密切?？谘?、上頜竇、舌和宮頸等部位的鱗狀細(xì)胞癌PD-L1表達(dá)增高，并與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[9-10]。預(yù)后相關(guān)的研究也表明，PD-L1表達(dá)與皮膚和喉部鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后相關(guān)，陽性表達(dá)者預(yù)后較差[11-12]。在ESCC的研究表明，PD-L1在腫瘤組織中表達(dá)增高，表達(dá)強(qiáng)弱和腫瘤浸潤(rùn)深度、pTNM分期及預(yù)后有關(guān)[13-15]。我們?cè)谛陆S吾爾族ESCC患者中的研究表明：PD-L1表達(dá)僅和腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)，和性別、年齡、發(fā)生部位、分化程度、TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，PD-L1表達(dá)較低的患者預(yù)后相對(duì)較好。

腫瘤周圍炎細(xì)胞如M1巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、CD4+Th1細(xì)胞和CD8+NK細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有抑制作用。TIL能釋放大量的細(xì)胞毒性細(xì)胞因子，抑制和殺死腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，減少淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。我們的研究表明，CD8+TIL密度和ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)系，CD8+TIL高密度患者的預(yù)后較好。三陰性乳腺癌的研究表明，PD-L1表達(dá)和患者預(yù)后無關(guān)，但TIL具有預(yù)后價(jià)值，且和腫瘤PD-L1表達(dá)有相關(guān)[16]。這些研究均表明TIL可能在患者腫瘤免疫和預(yù)后方面發(fā)揮重要的作用。

研究顯示TIL的存在與黑色素瘤患者局部腫瘤PD-L1表達(dá)密切相關(guān)[17]。研究也表明PD-L1表達(dá)和CD3+或CD8+TIL密度之間存在關(guān)聯(lián)；PD-L1表達(dá)高，則TIL密度也增高[4，18]。這些研究結(jié)果和我們的研究結(jié)果一致。我們的研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)在不同CD8+TIL密度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PD-L1表達(dá)高則CD8+TIL密度高，兩者之間存在一定的關(guān)系。有研究認(rèn)為TIL釋放炎性細(xì)胞因子，尤其是干擾素-γ，會(huì)誘導(dǎo)腫瘤組織PD-L1表達(dá)上調(diào)，作為一種適應(yīng)性免疫抵抗機(jī)制，抑制局部效應(yīng)T細(xì)胞的功能以抵抗自身免疫攻擊[8]。

根據(jù)TIL和PD-L1表達(dá)的存在或不存在，可以分為四種不同類型的腫瘤微環(huán)境[19]。對(duì)膽囊癌進(jìn)行類似的免疫分型后，發(fā)現(xiàn)CD8+TIL高密度/PD-L1低表達(dá)亞型具有較好的預(yù)后[20]。一項(xiàng)非小細(xì)胞肺癌的研究表明，高PD-L1表達(dá)/高CD8+密度亞組的患者預(yù)后最好，且PD-L1表達(dá)和患者生存無關(guān)[21]。在對(duì)乳腺癌不同亞型的預(yù)后進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，高TIL密度/PD-LI高表達(dá)的病例免疫活性更高[22]。因此，腫瘤免疫在不同腫瘤發(fā)病機(jī)制中所起的作用有所不同。我們的研究表明，高TIL密度/低PD-L1表達(dá)亞組的預(yù)后較好，低TIL密度/高低PD-L1表達(dá)亞組的預(yù)后較差。目前，基于TIL密度和PD-L1表達(dá)的ESCC免疫分型的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道，在這一方面展開進(jìn)一步的研究具有積極意義。

由于ESCC的放化療效果不佳，ESCC的免疫治療被寄予厚望。腫瘤組織PD-L1高表達(dá)是對(duì)腫瘤-宿主關(guān)系的一種適應(yīng)性機(jī)制，免疫檢查點(diǎn)治療對(duì)這類腫瘤患者可能有效，并改善病程[17]。對(duì)新輔助化療和手術(shù)切除腫塊的晚期ESCC或賁門癌患者給予PD-1抑制劑納武單抗處理后，OS明顯改善，中位無病生存期由安慰劑組的11個(gè)月提高到22.4個(gè)月[7,23]?？筆D-1抗體帕博利珠單抗在晚期轉(zhuǎn)移性ESCC治療的臨床試驗(yàn)中也取得了不錯(cuò)的療效[24]。

惡性腫瘤組織中TIL的存在提示患者預(yù)后較好，也能提高一些常規(guī)療法和免疫治療的療效[25]。一般認(rèn)為，TIL高密度/PD-L1高表達(dá)亞組的免疫治療效果最好，TIL低密度/PD-L1低表達(dá)亞組的免疫治療效果最差。免疫治療已成為腫瘤的主要治療方式之一。然而，目前大多數(shù)癌癥患者沒有從免疫治療中獲益的原因是腫瘤血管的異常，其促進(jìn)了免疫逃逸[26]。因此，聯(lián)合使用抗血管生成藥物和免疫檢查點(diǎn)抑制劑，可以改善腫瘤微環(huán)境，潛在改善某些預(yù)后較差ESCC亞組患者的預(yù)后。

綜上所述，PD-L1表達(dá)和CD8+TIL密度可以作為判斷ESCC患者預(yù)后的有效標(biāo)志物，聯(lián)合使用抗血管生成藥物和免疫檢查點(diǎn)抑制劑，可能為某些免疫治療預(yù)后較差的亞組提供新的手段。