白惠玲，朱曉燕，劉 勤,，張延英，康萬(wàn)榮，張 書(shū)

0 引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見(jiàn)的眼部并發(fā)癥，是導(dǎo)致失明的重要原因。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是貫穿DR整個(gè)病理過(guò)程的關(guān)鍵特征，DR患者的視力損害主要由該兩種途徑引起[1-2]。血清胱抑素C(Cystatin C, Cys C)是機(jī)體有核細(xì)胞合成的一種非糖基化堿性蛋白，主要由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分泌[3-4]，近年來(lái)有研究表明，血清Cys C是DR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[5]，因此血清Cys C的分泌情況可能與DR的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。二甲雙胍是目前治療2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的首選口服藥物。近期研究表明，二甲雙胍還可以通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的損傷，抑制視網(wǎng)膜新生血管生成來(lái)延緩DR進(jìn)程[6-7]。本研究通過(guò)觀察二甲雙胍對(duì)T2DM大鼠視網(wǎng)膜血管、組織病理學(xué)改變及血清Cys C的影響，旨在探討二甲雙胍通過(guò)對(duì)血清Cys C調(diào)控，預(yù)防T2DM大鼠DR的發(fā)生，同時(shí)對(duì)已經(jīng)發(fā)生DR的大鼠病情轉(zhuǎn)歸的干預(yù)作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物模型的構(gòu)建及分組給藥選取6周齡雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量約為130～170g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)：SYXK(甘)2020-0009]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(倫理審查編號(hào)：2020-298)。120只大鼠中隨機(jī)抽取30只分為空白對(duì)照組A(10只)，T2DM組(10只)和二甲雙胍干預(yù)組A(10只)；其余90只再次隨機(jī)分為三組，分別為空白對(duì)照組B(30只)，DR組(30只)和二甲雙胍干預(yù)組B(30只)。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后給予空白對(duì)照組A、B普通飼料喂養(yǎng)，其余組均給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)4wk給空白對(duì)照組A、B左下腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液，將其余組大鼠按30mg/kg左下腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，給藥后所有大鼠均改為普通飼料喂養(yǎng)，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。注藥72h后測(cè)量尾靜脈血糖濃度，記錄體質(zhì)量、飲水量和尿量，當(dāng)血糖>16.7mmol/L，尿糖>+++，且有多飲、多食、多尿時(shí)即認(rèn)為T2DM模型成功。

造模成功后給予二甲雙胍干預(yù)組A大鼠二甲雙胍灌胃[第1wk劑量為150mg/(kg·d)，第2wk為300mg/(kg·d)，第3wk調(diào)整為400mg/(kg·d)，該劑量一直保持到3mo]，空白對(duì)照組A和T2DM組大鼠給予生理鹽水灌胃[2mL/(kg·d)，每日1次，連續(xù)3mo]，干預(yù)3mo后三組大鼠進(jìn)行觀察：測(cè)量各組大鼠空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)和空腹血清胰島素(fasting serum insulin, FINS)指標(biāo)，計(jì)算并分析胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)，心臟采血測(cè)各組大鼠血清Cys C、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8, IL-8)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平，并行眼底熒光造影(fundus fluorescein angiography, FFA)觀察各組大鼠眼底血管變化，HE染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)和厚度，透射電鏡觀察大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管超微形態(tài)。

在T2DM病程3mo后，二甲雙胍干預(yù)組B大鼠開(kāi)始給予二甲雙胍灌胃[400mg/(kg·d)，每日1次，連續(xù)3mo]，空白對(duì)照組B和DR組大鼠均給予生理鹽水灌胃[2mL/(kg·d)，每日1次，連續(xù)3mo]。按干預(yù)時(shí)長(zhǎng)不同，分別于第4、5、6mo各組取10只大鼠進(jìn)行觀察：測(cè)各組大鼠血清Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS水平，并行FFA觀察各組大鼠眼底血管變化，HE染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)和厚度，透射電鏡觀察大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管超微形態(tài)(圖1)。

1.1.2試劑與儀器鹽酸二甲雙胍片：中美上海施貴寶制藥有限公司(批號(hào)：ABT8279)；鏈脲佐菌素：北京索萊寶科技有限公司(批號(hào)：616S0212)；熒光素鈉注射液：美國(guó)Alcon Research LLC(批號(hào)：314040F)；眼底血管熒光造影機(jī)：德國(guó)海德堡公司(型號(hào)：SpectralisHRA+Multicolor)；大鼠胰島素、Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF ELISA試劑盒：江蘇菲亞生物科技有限公司；大鼠ROS ELISA試劑盒：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1模型的觀察指標(biāo)測(cè)量空白對(duì)照組A、T2DM組和二甲雙胍干預(yù)組A大鼠的FBG和FINS指標(biāo)，比較各組的FBG值、FINS變化并計(jì)算分析HOMA-IR(=FBG×FINS/22.5)。

1.2.2FFA檢查大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉50mg/kg進(jìn)行麻醉，雙眼滴復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后，將大鼠固定于眼底血管造影機(jī)前，腹腔注射10%熒光素鈉0.5mL/kg，觀察各組大鼠眼底有無(wú)病變及熒光素有無(wú)滲漏。

1.2.3ELISA實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)2%的戊巴比妥鈉50mg/kg麻醉后行心臟采血5mL，靜置30min后4000r/min離心15min，取上清分別檢測(cè)各組大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量，并且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和吸光度值計(jì)算各組大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS的濃度。

1.2.4HE染色大鼠處死后迅速取出兩個(gè)眼球，左眼置于眼球固定液行HE染色。

1.2.5透射電鏡每組大鼠的右眼放入2.5%戊二醛溶液用于透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1T2DM大鼠成模及死亡率T2DM造模大鼠一次成模69只，二次累加成模11只，總成模率100%。T2DM大鼠共死亡4只，死亡率5%，分別于病程5mo(2只)、病程6mo(2只)時(shí)死亡?？瞻讓?duì)照組大鼠無(wú)死亡。

2.2各組大鼠FBG和FINS及HOMA-IR比較三組間FBG、FINS和HOMA-IR差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=205.708、171.955、321.631，均P<0.01),見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組A比較，T2DM組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示T2DM大鼠造模成功；與T2DM組比較，二甲雙胍干預(yù)組A大鼠FBG、FINS和HOMA-IR顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物處理流程。

表1 各組大鼠FBG和FINS及HOMA-IR比較

2.3各組大鼠FFA檢查結(jié)果空白對(duì)照組A大鼠視網(wǎng)膜血管管徑均勻一致，走行規(guī)則，以視盤為中心呈放射狀分布，未見(jiàn)黃斑樣結(jié)構(gòu)(圖2A1)；T2DM組大鼠眼底可見(jiàn)由稀疏的分支小動(dòng)脈形成的淺層毛細(xì)血管網(wǎng)，毛細(xì)血管迂曲并可見(jiàn)熒光滲漏(圖2A2)；二甲雙胍干預(yù)組A大鼠眼底血管粗細(xì)均勻一致，走行規(guī)則，未見(jiàn)熒光滲漏(圖2A3)。提示T2DM病程3mo時(shí)大鼠眼底血管已出現(xiàn)DR的改變，而二甲雙胍干預(yù)可以預(yù)防T2DM大鼠眼底血管發(fā)生病變。

圖2 各組大鼠FFA檢查結(jié)果 A1～A3：病程3mo；A1：空白對(duì)照組A；A2：T2DM組；A3：二甲雙胍干預(yù)組A；B1～B3：病程4mo；B1：空白對(duì)照組B M4組；B2：DR組 M4組；B3：二甲雙胍干預(yù)組B M4組；C1～C3：病程5mo；C1：空白對(duì)照組B M5組；C2：DR組 M5組；C3：二甲雙胍干預(yù)組B M5組；D1～D3：病程6mo；D1：空白對(duì)照組B M6組；D2：DR組 M6組；D3：二甲雙胍干預(yù)組B M6組。

不同干預(yù)時(shí)間，空白對(duì)照組B大鼠眼底血管均清晰可見(jiàn)，管徑均勻一致，走行規(guī)則，無(wú)滲出和出血(圖2B1、C1、D1)。DR組(M4組)大鼠眼底血管走行迂曲，可見(jiàn)血管串狀樣改變和無(wú)灌注區(qū)形成(圖2B2)；DR組(M5組)大鼠眼底無(wú)灌注區(qū)面積增大，并可見(jiàn)出血遮蔽熒光(圖2C2)；DR組(M6組)大鼠眼底屈光間質(zhì)混濁，可能存在玻璃體出血(圖2D2)。二甲雙胍干預(yù)組B(M4、M5、M6組)大鼠眼底屈光間質(zhì)清晰，熒光滲漏及無(wú)灌注區(qū)隨著二甲雙胍干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，至M6組時(shí)眼底病變已明顯好轉(zhuǎn)(圖2B3、C3、D3)。

2.4各組大鼠血清中CysC、TNF-α、IL-8、VEGF、ROS的濃度各組大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS濃度差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=182.128、167.362、166.013、249.265、76.803，均P<0.01)。與空白對(duì)照組A相比，T2DM組和二甲雙胍干預(yù)組A大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；二甲雙胍干預(yù)組A大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量較T2DM組均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量的變化

各組大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS在4、5、6mo差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨后用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示，在各時(shí)間點(diǎn)，與同期空白對(duì)照組B比較，DR組和二甲雙胍干預(yù)組B大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但二甲雙胍干預(yù)組B大鼠增高不如DR組明顯；與DR組比較，二甲雙胍干預(yù)組B大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著病程的延長(zhǎng)，DR組大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量也顯著增高(均P<0.05)，而二甲雙胍干預(yù)組B大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量增高不如DR組明顯，見(jiàn)表3～5。

表3 各組大鼠血清中Cys C和TNF-α含量的變化

表4 各組大鼠血清中IL-8和VEGF含量的變化

表5 各組大鼠血清中ROS含量的變化

2.5各組大鼠HE染色結(jié)果空白對(duì)照組A大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，內(nèi)界膜完整，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常(圖3A1)；T2DM組大鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞間隙明顯增寬，內(nèi)核層和外核層細(xì)胞密度明顯減少，排列稀疏，厚度變薄(圖3A2)；二甲雙胍干預(yù)組A大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常(圖3A3)。與空白對(duì)照組A比較，T2DM組大鼠視網(wǎng)膜變薄(P<0.05)；與T2DM組比較，二甲雙胍干預(yù)組A大鼠視網(wǎng)膜增厚(P<0.05，圖4)，提示二甲雙胍干預(yù)可以預(yù)防T2DM視網(wǎng)膜組織發(fā)生病變。

圖3 各組大鼠HE染色結(jié)果 A1～A3：病程3mo；A1：空白對(duì)照組A；A2：T2DM組；A3：二甲雙胍干預(yù)組A；B1～B3：病程4mo；B1：空白對(duì)照組B M4組；B2：DR組 M4組；B3：二甲雙胍干預(yù)組B M4組；C1～C3：病程5mo；C1：空白對(duì)照組B M5組；C2：DR組 M5組；C3：二甲雙胍干預(yù)組B M5組；D1～D3：病程6mo；D1：空白對(duì)照組B M6組；D2：DR組 M6組；D3：二甲雙胍干預(yù)組B M6組。

圖4 二甲雙胍對(duì)T2DM大鼠視網(wǎng)膜厚度的影響 aP<0.05 vs T2DM組。

不同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組B(M4、M5、M6組)大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)均完整且連接緊密，細(xì)胞排列整齊；DR組(M4組)大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列紊亂，內(nèi)界膜斷裂、水腫，外核層結(jié)構(gòu)明顯紊亂、變薄，大量細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞并可見(jiàn)部分空泡，DR組(M5組)大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)紊亂加劇，內(nèi)界膜腫脹斷裂嚴(yán)重，可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞突破內(nèi)界膜，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞明顯減少，DR組(M6組)大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜嚴(yán)重腫脹，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞進(jìn)一步減少，內(nèi)外核層界限消失，內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層、外核層細(xì)胞數(shù)量均減少，排列稀疏，各層的毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張，管腔增粗，腔內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞，還可見(jiàn)部分紅細(xì)胞滲漏到血管外的組織中，毛細(xì)血管數(shù)量增加；二甲雙胍干預(yù)組B(M4、M5、M6組)大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列稍紊亂，少量細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，形態(tài)結(jié)構(gòu)改變較DR組各亞組均較輕，見(jiàn)圖3B、C、D。與同期空白對(duì)照組比較，DR組大鼠視網(wǎng)膜變薄(P<0.05)；與DR組比較，二甲雙胍干預(yù)組B大鼠視網(wǎng)膜增厚(P<0.05)，且隨著病程的延長(zhǎng)，DR組大鼠視網(wǎng)膜進(jìn)一步變薄(P<0.05)，而二甲雙胍干預(yù)組B大鼠視網(wǎng)膜厚度變化不明顯(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 二甲雙胍對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜厚度的影響 aP<0.05 vs DR組；cP<0.05 vs 病程4mo DR組；eP<0.05 vs 病程5mo DR組。

2.6各組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的透射電鏡結(jié)果空白對(duì)照組A大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管由基底膜、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞組成，位于管腔內(nèi)面的內(nèi)皮細(xì)胞被連續(xù)的基底膜和周細(xì)胞環(huán)繞，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞核形態(tài)正常，異染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，基底膜連續(xù)完整(圖6A1)；T2DM組大鼠內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞核的異染色質(zhì)凝聚靠邊，核膜凹陷褶皺，線粒體嵴部分消失，個(gè)別呈空泡變,內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)飲泡增多，胞質(zhì)向管腔突出，基底膜增厚(圖6A2)；二甲雙胍干預(yù)組A大鼠透射電鏡下視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核的周圍可見(jiàn)少量異染色質(zhì)，管壁的厚度基本正常，線粒體基本正常，未見(jiàn)腫脹和嵴斷裂，基底膜無(wú)增厚(圖6A3)。提示二甲雙胍干預(yù)可以預(yù)防T2DM大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管發(fā)生病變。

空白對(duì)照組B(M4、M5、M6組)大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)均清晰，線粒體結(jié)構(gòu)正常，基底膜連續(xù)完整，無(wú)增厚(圖6B1、C1、D1)；DR組(M4組)大鼠視網(wǎng)膜周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體出現(xiàn)空泡樣改變，線粒體膜中斷不連續(xù)，基底膜增厚，電子密度增加，毛細(xì)血管管腔變形(圖6B2)；二甲雙胍干預(yù)組B(M4組)大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞核的異染色質(zhì)凝聚并靠邊，內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)飲泡增多且胞質(zhì)向管腔突出以及線粒體腫脹(圖6B3)，但視網(wǎng)膜損害較DR組(M4組)輕；DR組(M5組)大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞核固縮，異染色質(zhì)邊聚，周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊，內(nèi)皮細(xì)胞向管腔突出，基底膜斷裂缺失，管腔變形(圖6C2)；二甲雙胍干預(yù)組B(M5組)大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核的周圍可見(jiàn)少量異染色質(zhì)并且核內(nèi)也可見(jiàn)散在的異染色質(zhì)，仍有管腔內(nèi)突起物，線粒體基本正常，未見(jiàn)腫脹、嵴斷裂，基底膜稍厚(圖6C3)；DR組(M6組)大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管改變較前更加嚴(yán)重，管腔狹窄閉塞，管壁周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均出現(xiàn)明顯固縮，內(nèi)皮細(xì)胞向管腔突出嚴(yán)重，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清，管腔周圍水腫明顯，基底膜缺失(圖6D2)；二甲雙胍干預(yù)組B(M6組)大鼠在視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中，細(xì)胞核周邊可見(jiàn)異染色質(zhì)聚集，細(xì)胞核內(nèi)亦可見(jiàn)異染色質(zhì)，線粒體正常，管壁厚度基本正常，管腔內(nèi)見(jiàn)少量突起物，周細(xì)胞核及線粒體內(nèi)偶見(jiàn)空化現(xiàn)象，但基底膜無(wú)增厚(圖6D3)。

圖6 各組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的透射電鏡結(jié)果 A1～A3：病程3mo；A1：空白對(duì)照組A；A2：T2DM組；A3：二甲雙胍干預(yù)組A；B1～B3：T2DM病程4mo；B1：空白對(duì)照組B M4組；B2：DR組 M4組；B3：二甲雙胍干預(yù)組B M4組；C1～C3：T2DM病程5mo；C1：空白對(duì)照組B M5組；C2：DR組 M5組；C3：二甲雙胍干預(yù)組B M5組；D1～D3：T2DM病程6mo；D1：空白對(duì)照組B M6組；D2：DR組 M6組；D3：二甲雙胍干預(yù)組B M6組。

3 討論

T2DM是近年來(lái)患病率較高的一種慢性炎癥性疾病，長(zhǎng)期的高血糖可以導(dǎo)致血管的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，引發(fā)一系列并發(fā)癥。DR是T2DM最常見(jiàn)的微血管病變之一，主要表現(xiàn)為免疫、炎性反應(yīng)等多種機(jī)制共同作用引起的視網(wǎng)膜微血管瘤和眼底出血、滲出，進(jìn)而導(dǎo)致視物模糊，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)永久性視力喪失[8-9]。STZ糖尿病大鼠模型是研究DR的常用動(dòng)物模型，可以用于研究該病的病理機(jī)制以及防治策略[10]。本研究采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)4wk聯(lián)合小劑量STZ 30mg/kg腹腔注射建立T2DM大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T2DM模型大鼠多食、多飲、多尿、體質(zhì)量減輕，所有大鼠空腹血糖均≥16.7mmol/L，且HOMA-IR升高，成功復(fù)制出了大鼠胰島素抵抗模型，即T2DM模型。飼養(yǎng)3mo后，T2DM模型大鼠FFA結(jié)果顯示，眼底可見(jiàn)稀疏的分支小動(dòng)脈形成的淺層毛細(xì)血管網(wǎng)，毛細(xì)血管迂曲并可見(jiàn)熒光滲漏；HE染色結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞間隙明顯增寬，內(nèi)核層和外核層細(xì)胞密度明顯減少，排列稀疏，厚度變??；透射電鏡結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞的細(xì)胞核異染色質(zhì)凝聚并靠邊，核膜凹陷褶皺，線粒體嵴部分消失，個(gè)別呈空泡變，內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)飲泡增多且胞質(zhì)向管腔突出，基底膜增厚。這些結(jié)果均提示本研究DR模型大鼠建立成功。而DR的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在DR的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

Cys C是一類半胱氨酸蛋白酶抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)，它在大鼠玻璃體、視網(wǎng)膜的各層細(xì)胞中均有表達(dá)[4]。有研究表明，隨著DR的發(fā)展，血清Cys C水平顯著升高[11]，其參與DR的機(jī)制可能有：(1)Cys C及其降解產(chǎn)物能夠激活并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[12]。文獻(xiàn)報(bào)道Cys C與伴隨有TNF-α、IL-8和VEGF等炎性細(xì)胞因子升高的炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)[13-18]?？赡艿臋C(jī)制為，Cys C通過(guò)干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮了重要的致炎作用。IFN-γ是一種由NK細(xì)胞和活化的T細(xì)胞產(chǎn)生可溶性細(xì)胞因子，通常作為巨噬細(xì)胞的重要激活因子，也是主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ(MHC-Ⅱ)分子表達(dá)的誘導(dǎo)劑，IFN-γ異常高表達(dá)通常會(huì)導(dǎo)致自身炎癥的產(chǎn)生。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，向Cys C-/-小鼠巨噬細(xì)胞中加入Cys C會(huì)促進(jìn)誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)的激活，進(jìn)而啟動(dòng)多種細(xì)胞因子特別是TNF-α、IL-6、IL-8及VEGF等[19-21]基因的轉(zhuǎn)錄，而使炎癥反應(yīng)放大；(2)同時(shí)，糖尿病患者體內(nèi)原本就已經(jīng)存在的慢性炎癥，在Cys C水平異常升高時(shí)，反之亦可引起患者視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮出現(xiàn)損傷，并引起硬化[22-24]；(3)同型半胱氨酸具有損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、導(dǎo)致微血管病變的作用，而Cys C對(duì)同型半胱氨酸的表達(dá)及分泌可產(chǎn)生一定的激發(fā)作用[25],Cys C可通過(guò)影響蛋白水解酶的活性及對(duì)同型半胱氨酸的作用參與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管重塑、血管新生等病變過(guò)程，參與DR的發(fā)生[26]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別與空白對(duì)照組A和空白對(duì)照組B相比，對(duì)應(yīng)的T2DM組和DR組大鼠血清中Cys C含量明顯升高，同時(shí)伴有TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量均明顯升高，且隨著病程的延長(zhǎng)，DR組大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量也均逐漸升高。本實(shí)驗(yàn)與其他研究結(jié)果一致，提示血清Cys C在DR的發(fā)生和發(fā)展中都起了重要作用，并通過(guò)炎癥和氧化應(yīng)激兩者所涉及的共同通路有關(guān)，可能為DR探討新的治療策略提供思路。

二甲雙胍來(lái)源于山羊豆堿，指南推薦其可以作為治療T2DM的一線和全程用藥[27]。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍不僅可以通過(guò)提高胰島素敏感性降低血糖，還可以通過(guò)減少視網(wǎng)膜損傷、抑制視網(wǎng)膜的炎癥反應(yīng)和改善胰島素抵抗等，減少或延緩DR的發(fā)生與發(fā)展[28]。近年來(lái)多篇研究已報(bào)道二甲雙胍還具有抗氧化特性，通過(guò)促進(jìn)SOD分泌，抑制超氧陰離子自由基分泌，最終改善患者的氧化應(yīng)激[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，與T2DM組比較，二甲雙胍干預(yù)組A大鼠HOMA-IR、Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量均顯著降低，F(xiàn)FA、HE和透射電鏡結(jié)果均顯示與空白對(duì)照組A基本相似，視網(wǎng)膜均未出現(xiàn)明顯的異常改變，該結(jié)果提示二甲雙胍可有效改善胰島素抵抗及炎癥反應(yīng)對(duì)視網(wǎng)膜的損傷，可預(yù)防DR的發(fā)生。在研究中還發(fā)現(xiàn)，在各時(shí)間點(diǎn)與DR組比較，二甲雙胍干預(yù)組B大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量均明顯下降，且隨著病程的延長(zhǎng)，這些指標(biāo)的增高也都不如DR組明顯，F(xiàn)FA、HE和透射電鏡結(jié)果示眼底改變較DR組各亞組均較輕，且眼底病變都明顯逐漸好轉(zhuǎn)，其機(jī)制可能是T2DM大鼠經(jīng)二甲雙胍治療后，使得NF-κB的亞單位無(wú)法從失活狀態(tài)活化，從而無(wú)法從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與相應(yīng)的炎癥相關(guān)基因結(jié)合，進(jìn)而抑制了炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄以及炎性因子或遞質(zhì)的合成和釋放[30-31]，通過(guò)抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路降低血清Cys C，延緩和改善了炎癥反應(yīng)對(duì)視網(wǎng)膜的破壞，從而達(dá)到保護(hù)視網(wǎng)膜的效果[32]，從而提示二甲雙胍可能是通過(guò)下調(diào)血清Cys C介導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激水平來(lái)預(yù)防和減緩T2DM大鼠發(fā)生DR。

綜上所述，二甲雙胍能夠有效下調(diào)血清中Cys C和其介導(dǎo)的TNF-α、IL-8、VEGF和ROS的含量，從而抑制T2DM大鼠的視網(wǎng)膜發(fā)生炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，提示二甲雙胍可能是預(yù)防和治療DR的有效藥物。本研究尚存在幾處不足：(1)本研究由于實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，設(shè)亞組較多，且采用HE和透射電鏡兩種方法將視網(wǎng)膜組織制樣，故組織樣本數(shù)量有限，無(wú)法從局部檢測(cè)，后續(xù)有條件時(shí)將從視網(wǎng)膜組織進(jìn)一步加以驗(yàn)證；(2)本研究?jī)H設(shè)立了安慰劑對(duì)照，如有條件后期將設(shè)立接受其他對(duì)DR有效的藥物治療的大鼠作為同期對(duì)照。