蔡維震，張 雷，丁 寧，王慶慧，胡 煒，王靜鳳*

（1 中國海洋大學(xué) 山東青島266000 2 青島墨爾文中學(xué) 山東青島266000 3 山東好當(dāng)家海洋發(fā)展股份有限公司 山東威海 264200）

胃腸道疾病屬于全球衛(wèi)生流行病之一，據(jù)統(tǒng)計，全球有5%～10%的人群患有從胃炎到胃癌等不同程度的疾病[1]。胃潰瘍是常見的胃腸道疾病，病理原因復(fù)雜，并且隨著生活中酗酒、暴飲暴食、壓力、藥物等因素，胃潰瘍發(fā)病率在逐年提高。流行病學(xué)顯示，飲酒人群消化道相關(guān)疾病的發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非飲酒人群，且急性酒精性胃潰瘍的發(fā)病率更為顯著[2]。研究表明，乙醇對胃黏膜的影響與其濃度相關(guān)[3-4]。胃組織吸收乙醇含量（14 mg/mL）時就可直接造成小鼠胃黏膜出血；當(dāng)小鼠被給予75%的酒精時，發(fā)現(xiàn)小鼠胃組織病變嚴(yán)重，胃黏膜充血、壞死。乙醇作為胃損傷的侵襲因子之一不可忽視，盡管臨床有質(zhì)子泵抑制劑、抗酸劑、抗組胺劑等藥物，但具有的肝腎損傷、造血功能異常等副作用阻礙了胃潰瘍藥物的有效使用。亟需尋找到一種安全有效、副作用小的物質(zhì)來預(yù)防、治療胃潰瘍等胃腸道疾病。

歷代本草文獻記載海參有抗凝血、抗腫瘤、降血脂、抗疲勞等多種生理功效。近期研究發(fā)現(xiàn)海參及海參提取物對黏膜免疫也有一定的保護作用[5]。海參硫酸軟骨素被證明可以明顯降低大鼠胃出血情況，保護胃黏膜的完整性[6]。Li 等[7]研究表明海參腸可以增強大鼠胃黏膜保護因子水平，降低吲哚美辛引起的胃黏膜損傷。海參在加工過程中會產(chǎn)生大量廢液，稱為海參蒸煮液，富含多糖、皂苷、氨基酸、膠原蛋白等多種營養(yǎng)物質(zhì)[8]。隨著海參產(chǎn)量逐年增加，海參蒸煮液的產(chǎn)量也越來越多。目前海參蒸煮液一般作為廢液排放，污染環(huán)境。據(jù)統(tǒng)計，1 t 海參蒸煮液經(jīng)濟價值可高達(dá)20 多萬元，每年排放的海參蒸煮液估值在100 億元以上[9]。目前研究表明，海參蒸煮液所含的多肽、多糖具有降血壓[10]、抗炎[11]、調(diào)節(jié)免疫[12]等功效，然而，海參蒸煮液在預(yù)防治療胃潰瘍等疾病方面鮮有報道。為實現(xiàn)海參蒸煮液的高值化利用，本研究探討其對急性酒精性胃潰瘍小鼠的預(yù)防保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 實驗動物及原料 本實驗采用SPF 級雄性ICR 小鼠，動物合格證號：SCXK（魯）20 190003；小鼠周齡：4～5 周。動物實驗期間自由攝食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～24 ℃，濕度為40%～50%，晝夜12 h 交替。海參蒸煮液干粉，由山東好當(dāng)家海洋發(fā)展股份有限公司提供。

1.1.2 試劑與藥品 前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）等試劑盒，南京建成生物工程研究所；無水乙醇，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，美國Promega 公司；引物，上海生工生物工程有限公司合成；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.1.3 儀器與設(shè)備 Mili-Q Synthesis 超純水系統(tǒng)，美國Milipore 公司；GL-20M 型高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器公司；680 型酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad 公司；SZ61 型解剖鏡，日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型建立 24 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機分為正常組（N），模型組（M），海參蒸煮液低劑量組（SCCL-L，50 mg/kg），海參蒸煮液高劑量組（SCCL-H，100 mg/kg）。正常、模型組灌胃生理鹽水，灌胃體積均為10 mL/kg bw，預(yù)灌胃15 d，期間小鼠自由攝食和飲水。

末次灌胃前1 d 禁食22 h 后，同時再禁水4 h，進行灌胃海參蒸煮液，正常、模型組灌胃生理鹽水。1 h 后模型組、海參蒸煮液組分別灌胃10 mL/kg bw 的85%乙醇建立急性酒精性胃潰瘍模型；再經(jīng)1 h 后小鼠麻醉后摘眼球取血，分離血清，用于生化指標(biāo)測定。摘取胃部，沿胃大彎剪開，生理鹽水漂洗干凈，取部分置于10%的中性甲醛固定，部分置于-80 ℃保存待用。

1.2.2 血清抗氧化酶、氧化產(chǎn)物等生化指標(biāo)測定

血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）等測定方法均按相應(yīng)試劑盒說明書進行。

1.2.3 胃組織TNF-α、IL-1β、PGE2、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等生化指標(biāo)測定 使用生理鹽水按料液比1∶9 制備10%的胃組織勻漿液，離心，收集上清液。采用試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、PGE2含量，用普通商品試劑盒測定GSH-Px、SOD等活性。

1.2.4 胃形態(tài)學(xué)觀察 胃組織摘取后，沿胃大彎剪開胃壁，生理鹽水涮洗干凈，4%的多聚甲醛固定24 h。SZ61 型解剖鏡觀察固定后的胃組織形態(tài)并成像；以O(shè)lympus Image Pro Plus 圖像處理軟件統(tǒng)計胃潰瘍面積占比[6]；采用魏晴等[13]的方法計算潰瘍指數(shù)：觀察胃黏膜出血區(qū)域、潰瘍面狀態(tài)，測量各個潰瘍面長徑，長徑≤1 mm 者計為1 分；>1～2 mm 者計為2 分；>2～3 mm 者計為3 分；>3～4 mm 者計為4 分；>4 mm 者計為5 分，各潰瘍面計分之和為潰瘍指數(shù)。胃組織H&E 染色，用BH-2型顯微鏡觀察組織形態(tài)并成像。

1.2.5 qRT-PCR 法檢測胃組織TNFR1、NF-κB 等基因表達(dá) 使用TRIzol 提取胃組織總RNA。以β-actin 為內(nèi)參基因來表征目的基因相對表達(dá)量，引物序列見下表。

表1 反轉(zhuǎn)錄PCR 引物序列Table 1 Oligonucleotide primer sequences for quantitative RT-PCR

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 結(jié)果采用SPSS 24.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，LSD 法進行組間差異比較，以P＜0.05具有顯著性意義，每組檢測指標(biāo)n≥3，n 為小鼠只數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 SCCL 對急性酒精性胃潰瘍小鼠潰瘍指數(shù)的影響

通過觀察各組小鼠胃組織病變情況及計算胃潰瘍指數(shù)，評估SCCL 對酒精性胃潰瘍的預(yù)防保護作用。由圖1 可知，正常組小鼠胃組織胃壁形態(tài)正常，平整，無出血性病變。模型組胃黏膜出血點明顯，腫脹，潰瘍面積占比41.8%，潰瘍指數(shù)為26.67±4.37。SCCL 干預(yù)組小鼠胃組織潰瘍病變明顯改善，胃黏膜光滑、平整，無大面積出血現(xiàn)象，潰瘍面積及胃潰瘍指數(shù)顯著下降（P＜0.01），其中SCCL-H 組胃黏膜保護率高達(dá)62%，顯示出良好的胃黏膜保護作用。

圖1 各組胃組織（部分）解剖圖（8×，n=6）Fig.1 Anatomical diagram of gastric tissue（part）of mice in each group（8×，n=6）

2.2 SCCL 對急性酒精性胃潰瘍小鼠胃組織病理變化的影響

小鼠胃組織H&E 染色切片如圖2 所示，正常小鼠胃黏膜上皮細(xì)胞完整、連續(xù)性好，腺體排列整齊；固有層細(xì)胞排列致密有序，層次清晰。模型組胃黏膜組織正常結(jié)構(gòu)喪失，出現(xiàn)柱狀上皮細(xì)胞脫落和炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，固有層壁細(xì)胞排列稀疏，凌亂，黏膜層受損較為嚴(yán)重。SCCL 組胃黏膜損傷明顯減輕，上皮細(xì)胞正常有序，固有層壁細(xì)胞排列致密，其中SCCL-H 組胃黏膜狀態(tài)與正常組無明顯差異，表明SCCL 預(yù)先灌胃對乙醇攝入后小鼠胃組織具有一定的保護作用。

圖2 各組胃黏膜組織形態(tài)學(xué)（100×）Fig.2 Histological morphology of gastric mucosa of mouse（100×）

2.3 SCCL 對酒精性胃潰瘍小鼠氧化應(yīng)激的影響

SOD、GSH-Px 是機體內(nèi)重要的抗氧化物酶；MDA 可反應(yīng)體內(nèi)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物水平，本研究以上述3 個指標(biāo)來評估SCCL 對酒精誘導(dǎo)胃潰瘍小鼠氧化應(yīng)激的影響。由圖3 可知，酒精干預(yù)后，模型組血清及胃黏膜組織的SOD、GSH-Px 活力較正常組顯著下降（P＜0.01），MDA 含量明顯升高（P＜0.01）。SCCL 組SOD、GSH-Px 酶活力顯著改善，其中高劑量組血清、胃勻漿SOD 酶活力值較模型組分別增加了50.10%，65.91%（P＜0.01）；血清MDA含量較模型組降低了43.47%，與正常組相比無顯著性差異，提示SCCL 可以改善酒精對胃黏膜組織的氧化應(yīng)激。

圖3 SCCL 對血清及胃組織SOD、GSH-PX 活力和MDA 含量的影響Fig.3 Effects of SCCL on activity of SOD，GSH-PX and MDA contents in serum and gastric tissue

2.4 SCCL 對急性酒精性胃潰瘍小鼠胃組織PGE2 和TNF-α、IL-1β 的影響

胃潰瘍發(fā)生的主要原因為胃黏膜的侵襲因子與胃黏膜防護因子的失衡。PGE2是重要的胃黏膜防護因子之一，可以抑制胃酸分泌，促進受損胃黏膜修復(fù)等。如圖4 所示，與正常組相比，模型組小鼠胃組織PGE2含量顯著減少（P＜0.01），下降了37.35%；SCCL 預(yù)灌胃15 d，可以顯著改善酒精誘導(dǎo)的胃組織PGE2水平，低、高劑量組PGE2含量較模型組分別增加了24.87%（P＜0.05）、53.93%（P＜0.01），呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系且高劑量組PGE2含量趨于正常水平。

圖4 SCCL 對胃組織PGE2、TNF-α、IL-1β 的影響Fig.4 Effects of SCCL on PGE2，TNF-α and IL-1β in gastric tissue

TNF-α、IL-1β 作為重要的促炎介質(zhì)參與胃潰瘍的發(fā)生，在胃黏膜損傷過程中扮演著重要角色。與正常組相比，大量酒精攝入會造成胃組織產(chǎn)生大量炎癥因子，TNF-α、IL-1β 分泌顯著增加（P＜0.01）。SCCL 組胃組織炎癥因子水平顯著下降；與模型組相比，SCCL-H 組TNF-α、IL-1β 含量分別下降了36.45%（P＜0.01）、36.90%（P＜0.01），其中IL-1β 的含量與正常組無明顯差異。

2.5 SCCL 對急性酒精性胃潰瘍小鼠胃組織MAPK/NF-κB 信號通路的影響

胃潰瘍炎癥反應(yīng)的發(fā)生與MAPK/NF-κB 的激活有關(guān)。本研究通過qRT-PCR 測定了胃組織中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。如圖5 所示，大量酒精攝入，模型組胃組織中P38、ERK、JNK、TNFR1、TRAF2、NF-κB、IKK 等基因表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；而SCCL 干預(yù)15 d，上述炎癥相關(guān)基因表達(dá)較模型組明顯降低（P＜0.05）；其中SCCL-H 組TNFR1、IKK 基因表達(dá)分別下降了48.03%，66.62%，提示SCCL 能夠顯著抑制胃潰瘍炎癥相關(guān)基因表達(dá)。

圖5 SCCL 對胃組織MAPK/NF-κB 信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of SCCL on gene expression of gastric MAPK/NF-κB signaling pathway

3 討論

酒精是常見胃腸疾病的誘導(dǎo)因素之一，其攝入過量可以直接損傷胃黏膜組織，誘導(dǎo)胃黏膜充血、水腫、缺氧、甚至糜爛性病變形成潰瘍。研究表明，氧化應(yīng)激在胃潰瘍等胃腸疾病中起著重要作用，NF-κB 在介導(dǎo)上述事件中扮演著關(guān)鍵角色[14]，調(diào)節(jié)MAPK/NF-κB 信號通路可能是預(yù)防治療酒精性胃潰瘍的有效措施。海參蒸煮液可能為胃潰瘍的新型治療候選物，有證據(jù)表明海參蒸煮液具有潛在的抗炎和抗氧化特性[15-16]。酒精誘導(dǎo)的小鼠急性胃潰瘍模型可以模擬人類飲酒過量導(dǎo)致的胃潰瘍疾病，經(jīng)常被用來篩選具有抗?jié)兓钚缘乃幬铩１狙芯客ㄟ^小鼠急性酒精性胃潰瘍模型驗證了SCCL 對胃黏膜具有較好的保護作用。

乙醇具有較強的腐蝕性和脫水性，可直接破壞胃黏膜屏障，降低胃黏膜血流量，引發(fā)胃黏膜微循環(huán)障礙、胃黏膜上皮細(xì)胞病變等。阮研碩等[17]發(fā)現(xiàn)預(yù)灌胃巖藻多糖可以改善酒精誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜組織，降低胃潰瘍指數(shù)，與本研究結(jié)果一致。通過胃組織外觀形態(tài)及胃組織切片H&E 染色發(fā)現(xiàn)，小鼠一次性攝入大量酒精可以明顯造成胃黏膜破壞、黏膜上皮細(xì)胞損傷等；猜測可能為海參蒸煮液中的巖藻多糖降低了酒精對胃黏膜的直接刺激，減少酒精對胃黏膜的氧化損傷，進而使胃黏膜損傷程度及潰瘍指數(shù)顯著降低。胃黏膜上皮細(xì)胞氧化損傷是酒精性胃潰瘍的重要特征之一，胃組織的首過代謝作用會生成部分乙醛，乙醛會在黃嘌呤氧化酶的作用下生成大量ROS，導(dǎo)致胃黏膜細(xì)胞氧化受損[18]。MDA 是脂質(zhì)的過氧化產(chǎn)物，反映細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜的氧化損傷程度。SOD、GSH-Px為重要的抗氧化酶，可以清除體內(nèi)的氧自由基，平衡機體氧化應(yīng)激水平。Wang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)海參巖藻聚糖硫酸酯可以顯著改善酒精導(dǎo)致胃黏膜組織SOD、GSH-Px 等酶活力下降的現(xiàn)象；Xu 等[20]發(fā)現(xiàn)不同分子質(zhì)量的海參巖藻多糖均對胃黏膜有一定的保護作用，可降低酒精性胃潰瘍胃組織中MDA的含量。

PGE2是胃黏膜重要的防御因子，能刺激胃黏液分泌，增加胃黏膜血流量，促進胃組織再生[21-22]。本研究表明乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍組PGE2含量顯著降低，用SCCL 預(yù)處理顯著增加了PGE2水平，改善了胃黏膜穩(wěn)態(tài)，從而發(fā)揮對胃黏膜的保護作用。胃組織TNF-α、IL-1β 含量反映了胃黏膜細(xì)胞炎癥程度，TNF-α 等會進一步引起級聯(lián)反應(yīng)加重酒精對胃黏膜的損害[23]。本研究通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)試驗發(fā)現(xiàn)酒精會誘導(dǎo)胃組織分泌TNF-α、IL-1β等炎性因子，而SCCL 干預(yù)可以明顯降低炎性因子含量，改善機體炎癥水平。

為了進一步說明SCCL 是如何調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、改善機體的炎癥水平，采用qRT-PCR 法測定了MAPK/NF-κB 信號通路關(guān)鍵基因的表達(dá)。先前的研究表明活性氧介導(dǎo)乙醇誘導(dǎo)的胃組織炎癥中MAPK 級聯(lián)反應(yīng)[24]，MAPK 通路是由ERK、JNK、P38 組成的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在調(diào)控細(xì)胞和組織損傷觸發(fā)的炎癥進程中起著關(guān)鍵作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)攝入乙醇可顯著增加MAPK 相關(guān)基因等表達(dá)，相反，SCCL 預(yù)處理顯著抑制了ERK/JNK/P38等mRNA 的表達(dá)；SCCL 對上述MAPK 機制的調(diào)節(jié)與其對酒精引發(fā)胃黏膜損傷的保護作用相一致。眾多研究表明，MAPK 級聯(lián)激活和NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是炎癥調(diào)節(jié)所必需的[26-28]，TNF-α 作為胃潰瘍常見的炎性攻擊因子之一，作用糖基化受體TNFR1 后募集接頭蛋白TRAF2，然后促使Iκ-Bα 降解并磷酸化NF-κB 激活入核，誘導(dǎo)一系列炎癥因子TNF-α、IL-1β 的表達(dá)，引起級聯(lián)放大反應(yīng)，加重胃黏膜的損傷，影響潰瘍愈合進程。結(jié)果表明，SCCL 可顯著抑制TNF-α 刺激后胃黏膜組織TNFR1/TRAF2/IKK/NF-κB 的mRNA 表達(dá)，提示SCCL 可能是通過抑制MAPK/NF-κB 信號通路的激活進而減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而起到預(yù)防保護酒精性胃潰瘍作用。

4 結(jié)論

海參蒸煮液預(yù)防胃潰瘍的作用機制可能是通過增強機體胃黏膜完整性、改善氧化應(yīng)激和炎癥水平，從而減少酒精直接對胃組織造成的氧化損傷及炎癥級聯(lián)反應(yīng)，提示海參蒸煮液具有開發(fā)為預(yù)防保護胃潰瘍食品或藥品的潛能。