鄭硯學(xué)，張 悅，王 艷，聶麗麗，喬瑞芳，賀銀鳳

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特 010018）

乳酸菌是一類可發(fā)酵糖產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性菌，其作為公認(rèn)的食品級(jí)益生菌，對(duì)人體有多種益生功能，在營(yíng)養(yǎng)健康和食品保藏與發(fā)酵方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[1]。乳酸菌在一定的環(huán)境中通常以生物膜形式生存，生物膜是指細(xì)菌附著在一些物體表面后分泌胞外黏性聚合物，并在其中生長(zhǎng)繁殖，最終形成的菌落聚集體[2-3]。有研究報(bào)道生物膜狀態(tài)下的乳酸菌比浮游態(tài)的乳酸菌存活能力更強(qiáng)，具有更強(qiáng)大的耐環(huán)境脅迫能力和免疫調(diào)節(jié)能力[4-5]。加強(qiáng)對(duì)乳酸菌生物膜研究對(duì)闡明益生菌益生機(jī)理以及未來研究益生菌制劑具有重要意義。

現(xiàn)有研究表明，群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）在細(xì)菌生物膜形成的過程中起重要作用，QS系統(tǒng)是指細(xì)菌通過向周圍環(huán)境釋放一種特殊的化學(xué)信號(hào)分子來感知環(huán)境變化，從而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，以激活特定的行為并進(jìn)行信息交流[6]。在自然界中，大多數(shù)細(xì)菌都以生物膜形式生存，QS系統(tǒng)也普遍存在于不同細(xì)菌中，乳酸菌也不例外[7]。LuxS/AI-2 型QS 系統(tǒng)在乳酸菌種間信號(hào)交流中發(fā)揮著重要作用，在LuxS/AI-2 型QS 系統(tǒng)中，由luxS 基因介導(dǎo)的信號(hào)分子AI-2 在革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌中廣泛存在，信號(hào)分子AI-2 也是乳酸菌形成生物膜的重要因素[8]。

群體感應(yīng)抑制劑（Quorum sensing inhibitors，QSIs）是指通過抑制細(xì)菌群體感應(yīng)中一些特定基因的表達(dá)來阻止細(xì)胞的通訊交流，而對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響小的物質(zhì)[9]。目前QSIs 可通過抑制信號(hào)分子合成、傳遞和接受等途徑來抑制細(xì)菌的QS[10]。AI-2 系統(tǒng)是細(xì)菌最普遍存在的一種QS 系統(tǒng)，一般可通過抑制AI-2 合成過程中酶的活性，干擾信號(hào)分子AI-2 的接受或轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制AI-2 系統(tǒng)[11]?，F(xiàn)有研究表明，乳酸菌利用LuxS/AI-2 型QS 系統(tǒng)與周圍環(huán)境中的其它細(xì)菌進(jìn)行交流，利用AI-2 信號(hào)分子反饋的信號(hào)來調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，如生物膜的形成[12]。目前對(duì)于AI-2 介導(dǎo)的QS 與生物膜的研究多集中于致病菌，對(duì)乳酸菌的QS 和生物膜研究還較少，在實(shí)際生產(chǎn)加工和進(jìn)入腸道后，乳酸菌大多以生物膜形式存在[13-14]，因此有必要加強(qiáng)對(duì)乳酸菌QS 系統(tǒng)對(duì)生物膜調(diào)控的研究。

乳酸菌作為人體腸道內(nèi)的有益微生物，通常以生物膜形態(tài)來提高其對(duì)外界不良環(huán)境的抗性?，F(xiàn)有研究表明，群體感應(yīng)可以調(diào)控乳酸菌生物膜的形成，然而，AI-2 作為群體感應(yīng)的信號(hào)分子是否參與乳酸菌生物膜形成的過程還有待研究。本試驗(yàn)以課題組前期篩選出的2 株高產(chǎn)信號(hào)分子AI-2 的發(fā)酵乳桿菌為研究對(duì)象，選擇D-半乳糖、D-核糖和呋喃酮作為QSIs，通過添加不同種類以及不同濃度的QSIs，測(cè)定其對(duì)菌株AI-2 活性、生長(zhǎng)量和生物膜形成量的影響。選擇抑制信號(hào)分子AI-2 活性最好的抑制劑及最適濃度，測(cè)定其對(duì)菌體形態(tài)和生物膜形態(tài)的影響，探究乳酸菌生物膜的形成與信號(hào)分子AI-2 活性之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究乳酸菌群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)生物膜的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 試驗(yàn)菌株2-1 和211 均為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），分別分離自錫盟地區(qū)酸馬奶和西藏地區(qū)牦牛乳制品中，現(xiàn)保存于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)團(tuán)隊(duì)。

哈維氏弧菌（Vibrio harveyii）BB170，購(gòu)買自美國(guó)菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.1.2 培養(yǎng)基 試驗(yàn)所用到的AB 培養(yǎng)基參考燕彩鈴[15]的方法配制。MRS 肉湯培養(yǎng)基，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；D-半乳糖、D-核糖、呋喃酮，購(gòu)自Aladdin 公司；結(jié)晶紫、氯化 鈉、MgSO4·7H2O、乙酸，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇，購(gòu)自天津永晟精細(xì)化工有限公司；酸水解酪蛋白，購(gòu)自Coolaber 公司；無(wú)水乙醇，購(gòu)自天津福晨化學(xué)試劑有限公司；叔丁醇，購(gòu)自麥克林公司；試驗(yàn)中使用的水均為去離子水。

1.1.3 儀器與設(shè)備 HF-SAFE 1500 型生物安全柜、SMART-N 純水機(jī)，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；SX-500 型全自動(dòng)高壓滅菌鍋，日本TOMY 公司；PB 10 型酸度計(jì)，德國(guó)Sartorius 公司；5810R 型高速低溫離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；BioTek Epoch 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek 公司；TM4000 形桌上顯微鏡，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)那珂事業(yè)所。

1.2 方法

1.2.1 供試菌液的制備 將2 株發(fā)酵乳桿菌以體積分?jǐn)?shù)2.0%接種量接種于MRS 培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)二代后，8 000 r/min 離心5 min，棄上清液后加入0.85%的生理鹽水，吹打混勻后離心3 次以洗滌菌體，洗滌后加入0.85%的生理鹽水調(diào)節(jié)菌液的吸光度OD595nm值在1.0 左右。此時(shí)細(xì)菌的細(xì)胞濃度為1×107CFU/mL，由此制得試驗(yàn)菌株的供試菌液[16]。

1.2.2 無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液的制備 將試驗(yàn)菌株待測(cè)培養(yǎng)液于8 000 r/min 離心5 min（4 ℃），使用0.22 μm 水系濾膜對(duì)上清液過濾除菌，即得到試驗(yàn)菌株的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液（Cell-free fermentation supernatant，CFS）。將哈維氏弧菌BB170 培養(yǎng)3代至OD595nm為1.0 左右后，8 000 r/min 離心5 min（4 ℃），使用0.22 μm 水系濾膜對(duì)上清液過濾除菌，即得到陽(yáng)性對(duì)照。AB 培養(yǎng)基過濾除菌即陰性對(duì)照，MRS 培養(yǎng)基過濾除菌即介質(zhì)對(duì)照。無(wú)菌CFS或?qū)φ諛悠酚?80°C 保存[17]。

1.2.3 信號(hào)分子AI-2 活性的測(cè)定 將哈維氏弧菌BB170 以2.0%接種量接種到AB 培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)3 代至OD595nm為1.0 左右后，按1∶5 000（體積比）將菌液和AB 培養(yǎng)基混合稀釋，稀釋后哈維氏弧菌BB170 菌液約為105CFU/mL。將試驗(yàn)菌株的CFS、陽(yáng)性、陰性、介質(zhì)對(duì)照與稀釋后的哈維氏弧菌BB170 菌液以1∶100（體積比）混合后，30 ℃振蕩培養(yǎng)。在0～6 h 內(nèi)，每隔30 min 在化學(xué)發(fā)光模式下測(cè)定其熒光強(qiáng)度值。當(dāng)陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度值達(dá)到最低點(diǎn)時(shí)，測(cè)定待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度，計(jì)算樣品相對(duì)熒光強(qiáng)度用以代表菌株信號(hào)分子AI-2 的活性[18]。

1.2.4 QSIs 的篩選 在滅菌后的MRS 液體培養(yǎng)基中添加用0.22 μm 水系濾膜過濾的QSIs，使QSIs 終濃度分別為50，100，150，200，500，1 000，2 000，10 000，20 000 μmol/L，對(duì)照組為不添加QSIs（0 μmol/L）。將活化好的試驗(yàn)菌株接入已添加QSIs 的MRS 液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)到待測(cè)時(shí)間后用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)菌體密度（OD595nm），同時(shí)8 000 r/min 離心5 min（4 ℃），收集上清液，對(duì)各上清液進(jìn)行AI-2 活性檢測(cè)。計(jì)算不同種類以及不同濃度的QSIs 對(duì)乳酸菌信號(hào)分子AI-2 的抑制率，計(jì)算公式如下：

根據(jù)對(duì)信號(hào)分子AI-2 活性的抑制率得出最佳QSIs 以及最佳濃度。

1.2.5 QSIs 對(duì)菌株生物膜形成量的影響 將活化好的試驗(yàn)菌株以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接入到添加了不同濃度QSIs 的MRS 液體培養(yǎng)基中，96 孔酶標(biāo)板中每孔加入200 μL 后37 ℃靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)到到待測(cè)時(shí)間后，用結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物膜形成量（OD595nm）[19]。

1.2.6 QSIs 對(duì)乳酸菌菌體形態(tài)和生物膜形態(tài)的影響 將活化二代的試驗(yàn)菌株接入已添加不同濃度QSIs 的MRS 液體培養(yǎng)基中，制備浮游和被膜態(tài)菌株[20]，培養(yǎng)到待測(cè)時(shí)間后，浮游態(tài)菌株8 000 r/min離心5 min，棄上清留菌泥，被膜態(tài)菌株棄培養(yǎng)液，分別使用終體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛固定，置于4℃過夜后使用乙醇梯度脫水，使用叔丁醇梯度脫乙醇后干燥，使用掃描電鏡觀察菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物膜結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 23.0 和Origin 2018 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳桿菌信號(hào)分子分泌規(guī)律以及生物膜形成規(guī)律的探究

2 株發(fā)酵乳桿菌在37 ℃下培養(yǎng)25 h，從4 h開始，每隔3 h 取樣測(cè)定菌體生長(zhǎng)量、生物膜形成量以及信號(hào)分子AI-2 的活性。

圖1 為2 株發(fā)酵乳桿菌在不同培養(yǎng)時(shí)間下信號(hào)分子AI-2 的活性。由圖可知，與陽(yáng)性相對(duì)熒光強(qiáng)度相比，從7 h 開始，2 株發(fā)酵乳桿菌的信號(hào)分子活性均高于陽(yáng)性相對(duì)熒光強(qiáng)度，說明2 株發(fā)酵乳桿菌具備分泌信號(hào)分子AI-2 的能力，同時(shí)發(fā)酵乳桿菌2-1 7 h 的AI-2 活性遠(yuǎn)高于其它時(shí)間的AI-2 活性，發(fā)酵乳桿菌211 13 h 的AI-2 活性高于其它時(shí)間的AI-2 活性，所以選擇培養(yǎng)7 h 的發(fā)酵乳桿菌2-1 和培養(yǎng)13 h 的發(fā)酵乳桿菌211 用于后續(xù)篩選QSIs 及其對(duì)乳酸菌生物膜形成的影響。

圖1 發(fā)酵乳桿菌信號(hào)分子AI-2 的活性Fig.1 The active secretion of signal molecule AI-2 of L.fermentum

圖2 為2 株發(fā)酵乳桿菌生長(zhǎng)量與生物膜形成的關(guān)系圖。由圖可知，4～10 h 為2 株發(fā)酵乳桿菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，10 h 以后菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定；2 株發(fā)酵乳桿菌在4～13 h 的生物膜形成量呈遞增趨勢(shì)，在13 h 生物膜形成量達(dá)到最大。發(fā)酵乳桿菌2-1的生物膜在13 h 后呈先下降再上升類似波浪的趨勢(shì)，發(fā)酵乳桿菌211 生物膜的生成是一個(gè)先增長(zhǎng)后降低再增長(zhǎng)的過程。

圖2 發(fā)酵乳桿菌生物膜的形成Fig.2 The biofilm formation of L.fermentum

2.2 QSIs 對(duì)發(fā)酵乳桿菌產(chǎn)信號(hào)分子AI-2 的影響

2.2.1 D-半乳糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌產(chǎn)信號(hào)分子AI-2的影響 有研究報(bào)道，D-半乳糖的結(jié)合蛋白與信號(hào)分子AI-2 受體具有一定的結(jié)構(gòu)相似性，D-半乳糖可能會(huì)與信號(hào)分子AI-2 競(jìng)爭(zhēng)AI-2 受體，影響AI-2 與AI-2 受體的結(jié)合率，從而降低AI-2 發(fā)揮的作用[21-23]。

在MRS 培養(yǎng)基中添加不同濃度的D-半乳糖來評(píng)價(jià)其對(duì)2 株發(fā)酵乳桿菌生長(zhǎng)量以及AI-2 活性的影響，對(duì)照組為不添加D-半乳糖（0 μmol/L）。如圖3 所示，添加不同濃度的D-半乳糖對(duì)2 株發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)量均無(wú)顯著影響，說明D-半乳糖對(duì)菌株的生長(zhǎng)不起能量來源的作用。

由圖3a 可知，添加不同濃度的D-半乳糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌2-1 的AI-2 活性有一定程度的抑制，終濃度為100 μmol/L 的D-半乳糖對(duì)AI-2 活性抑制效果最好，抑制率為14.68%。在100～2 000 μmol/L 范圍內(nèi)，隨著D-半乳糖終濃度的增加，其對(duì)AI-2 活性的抑制作用降低，可能是當(dāng)D-半乳糖結(jié)合蛋白和AI-2 受體濃度一定，而D-半乳糖濃度較高時(shí)，其更容易與D-半乳糖結(jié)合蛋白結(jié)合從而降低了其與信號(hào)分子AI-2 的競(jìng)爭(zhēng)作用。

如圖3b 所示，與對(duì)照組相比，隨著D-半乳糖濃度的增加，其對(duì)發(fā)酵乳桿菌211 AI-2 活性的抑制作用增加，終濃度為200 μmol/L 的D-半乳糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌211 的AI-2 活性影響最大，其抑制率為20.33%。隨著D-半乳糖濃度的增加，對(duì)AI-2活性的抑制作用降低，甚至有一定的促進(jìn)作用。

圖3 D-半乳糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌信號(hào)分子AI-2 活性的影響Fig.3 The effect of D-galactose on the activity of signal molecule AI-2 by L.fermentum

2.2.2 D-核糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌產(chǎn)信號(hào)分子AI-2 的影響 有研究顯示，D-核糖不會(huì)產(chǎn)生毒性作用且與AI-2 有一定的結(jié)構(gòu)相似性，因此，D-核糖和AI-2 可以同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)AI-2 受體來降低AI-2 的作用[24]。目前，D-核糖可被用作QSIs 來抑制致病菌的生物膜形成。

本試驗(yàn)測(cè)定了在MRS 培養(yǎng)基中添加不同濃度的D-核糖對(duì)2 株發(fā)酵乳桿菌生長(zhǎng)量及AI-2 活性的影響，對(duì)照組為不添加D-核糖（0 μmol/L）。如圖4 所示，添加不同濃度的D-核糖不影響2 株發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)。

由圖4a 可知，200 μmol/L 的D-核糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌2-1 AI-2 活性的抑制效果最好，抑制率為19.65%，而后隨著D-核糖的濃度增加，其對(duì)AI-2活性的抑制作用降低且呈現(xiàn)出負(fù)作用，可能是D-核糖作為與AI-2 的結(jié)構(gòu)相似物，一定濃度下可以與AI-2 共同競(jìng)爭(zhēng)AI-2 受體從而起抑制作用。

如圖4b 所示，與對(duì)照組相比，添加50 μmol/L的D-核糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌211 的AI-2 的活性抑制效果最好，抑制率為28.57%，而后隨著D-核糖濃度的增加，其對(duì)AI-2 的抑制效果整體呈降低趨勢(shì)。

圖4 D-核糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌信號(hào)分子AI-2 活性的影響Fig.4 The effect of D-ribose on the signal molecule AI-2 produced by L.fermentum

2.2.3 呋喃酮對(duì)發(fā)酵乳桿菌產(chǎn)信號(hào)分子AI-2 的影響 有研究報(bào)道，呋喃酮類化合物與信號(hào)分子AI-2 結(jié)構(gòu)有一定的相似性，作為AI-2 信號(hào)分子的同系物，其在控制致病菌感染和生物膜的形成方面具有良好的應(yīng)用價(jià)值[25]。在MRS 培養(yǎng)基中添加不同濃度的呋喃酮來評(píng)價(jià)其對(duì)2 株發(fā)酵乳桿菌生長(zhǎng)量及AI-2 活性的影響，對(duì)照組為不添加呋喃酮（0 μmol/L）。如圖5 所示，添加一定濃度的呋喃酮對(duì)2 株發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)量影響不明顯。

圖5 呋喃酮對(duì)發(fā)酵乳桿菌信號(hào)分子AI-2 活性的影響Fig.5 The effect of furanone on the signal molecule AI-2 produced by L.fermentum

與對(duì)照組相比，隨著呋喃酮濃度的增加，其對(duì)發(fā)酵乳桿菌2-1 AI-2 活性的抑制作用逐漸增加，200 μmol/L 的呋喃酮與其它濃度相比抑制效果最好，抑制率為13.27%，后隨著呋喃酮濃度的增加，AI-2 活性增強(qiáng)，可能是呋喃酮類化合物作為AI-2信號(hào)分子的結(jié)構(gòu)相似物，在一定濃度下可以抑制AI-2 的活性，當(dāng)超過抑制濃度的閾值時(shí)，呋喃酮類化合物則會(huì)對(duì)增強(qiáng)菌株產(chǎn)AI-2 的能力。

與對(duì)照組相比，50 μmol/L 的呋喃酮對(duì)發(fā)酵乳桿菌211 AI-2 活性的抑制最明顯，抑制率為13.51%，而后隨著添加呋喃酮濃度的增高，其對(duì)AI-2 活性的抑制作用不明顯，甚至存在促進(jìn)作用。

呋喃酮類化合物可與AI-2 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合AI-2 受體蛋白從而抑制其QS[26]，而在本試驗(yàn)中呋喃酮對(duì)2 株發(fā)酵乳桿菌的AI-2 活性抑制效果并不明顯，可能是因?yàn)椴煌木闍I-2 受體的結(jié)構(gòu)不同，所以對(duì)其QS 的抑制作用也不相同。吳雅茜等[27]研究了4-羥基-2，5-二甲基-3（2H）呋喃酮（DMHF）對(duì)單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，L.monocytogenes）的生長(zhǎng)與信號(hào)分子AI-2 活性的影響，結(jié)果表明DMHF 能延遲單增李斯特菌的生長(zhǎng)，且能明顯抑制單增李斯特菌AI-2 的活性，由此可認(rèn)為DMHF 是AI-2 類QS 的抑制劑。

2.3 QSIs 對(duì)發(fā)酵乳桿菌生物膜形成量的影響

2.3.1 D-半乳糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌生物膜形成量的影響 本試驗(yàn)測(cè)定了添加不同濃度的D-半乳糖對(duì)2株發(fā)酵乳桿菌生物膜形成量的影響。由圖6 可知，與對(duì)照組（0 μmol/L）相比，添加不同濃度的D-半乳糖對(duì)2 株發(fā)酵乳桿菌生物膜形成量有不同程度的影響，其中添加50 μmol/L 的D-半乳糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌2-1 的生物膜形成量抑制作用明顯，添加2 000 μmol/L 的D-半乳糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌211 的生物膜形成量的抑制作用最強(qiáng)，這與Ryu 等[28]研究的D-半乳糖對(duì)牙周致病菌生物膜的抑制作用結(jié)果相似，即一定濃度下的D-半乳糖可以抑制牙周致病菌的生物膜形成且不影響細(xì)菌生長(zhǎng)，說明D-半乳糖可能與AI-2 競(jìng)爭(zhēng)AI-2 受體，通過降低AI-2 活性來預(yù)防細(xì)菌生物膜的形成。

圖6 D-半乳糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌生物膜形成量的影響Fig.6 The effect of D-galactose on the formation of L.fermentum biofilm

2.3.2 D-核糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌生物膜形成量的影響 本試驗(yàn)測(cè)定了添加不同濃度的D-核糖對(duì)2株發(fā)酵乳桿菌生物膜形成量的影響。由圖7 可知，與對(duì)照組（0 μmol/L）相比，添加不同濃度的D-核糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌2-1 的生物膜形成量都有一定的抑制作用，而對(duì)發(fā)酵乳桿菌211 的生物膜形成量抑制效果不明顯。Liu 等[29]研究了D-核糖對(duì)類植物乳桿菌L-ZS9 AI-2 活性的抑制作用，與外源添加AI-2 相比，一定濃度的D-核糖雖可以抑制LZS9 的AI-2 活性和生物膜形成，但外源AI-2 和D-核糖對(duì)類植物乳桿菌L-ZS9 的生長(zhǎng)沒有影響，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。

圖7 D-核糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌生物膜形成量的影響Fig.7 The effect of D-ribose on the formation of L.fermentum biofilm

2.3.3 不同濃度的呋喃酮對(duì)發(fā)酵乳桿菌生物膜形成量的影響 本試驗(yàn)測(cè)定了添加不同濃度的呋喃酮對(duì)2 株發(fā)酵乳桿菌生物膜形成量的影響。如圖8 所示，與對(duì)照組（0 μmol/L）相比，不同濃度的呋喃酮對(duì)發(fā)酵乳桿菌2-1 的生物膜形成量有顯著的抑制作用，而發(fā)酵乳桿菌211 生物膜形成量的抑制作用并不明顯。楊維等[30]研究了3，4-二溴-2（5H）-呋喃酮對(duì)單增李斯特菌生物膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)呋喃酮對(duì)單增李斯特菌生物膜的形成有一定的抑制作用，隨著呋喃酮濃度的增加，其對(duì)生物膜形成量的抑制效果更明顯。

圖8 呋喃酮對(duì)發(fā)酵乳桿菌生物膜形成量的影響Fig.8 The effect of furanone on the formation of L.fermentum biofilm

2.4 QSIs 對(duì)發(fā)酵乳桿菌菌體形態(tài)和生物膜形態(tài)的影響

根據(jù)前期試驗(yàn)最終選擇200 μmol/L 和50 μmol/L 的D-核糖分別作為發(fā)酵乳桿菌2-1 和發(fā)酵乳桿菌211 的QSIs，并對(duì)添加了D-核糖的2 株發(fā)酵乳桿菌使用掃描電鏡觀察菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖所示。

圖9 為發(fā)酵乳桿菌2-1 培養(yǎng)24 h 細(xì)菌的生物膜狀態(tài)下的菌體形態(tài)。由圖9a 可以看出，未添加D-核糖的菌株整體形態(tài)完好，細(xì)胞表面平整光滑，多成聚集狀態(tài)，說明生物膜狀態(tài)下細(xì)菌的黏附性更高。由圖9b 可以看出，添加200 μmol/L D-核糖的細(xì)菌整體形態(tài)以及表面光滑度雖未發(fā)生改變，但細(xì)菌聚集度下降，游離細(xì)菌增多，說明一定濃度的D-核糖可以降低菌體的黏附性。

圖9 D-核糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌2-1 菌體形態(tài)的影響Fig.9 The effect of D-ribose on the morphology of L.fermentum 2-1

圖10 為發(fā)酵乳桿菌211 培養(yǎng)24 h 細(xì)菌的生物膜狀態(tài)下的菌體形態(tài)。由圖10a 可以看出，未添加D-核糖的菌整體形態(tài)完好，細(xì)胞整體聚集度較高，說明生物膜狀態(tài)下細(xì)菌之間的黏附性更強(qiáng)。由圖10b 可以看出，添加50 μmol/L D-核糖的細(xì)菌整體形態(tài)雖未發(fā)生改變，但游離細(xì)菌居多，細(xì)菌整體聚集能力下降，說明一定濃度的D-核糖可以降低菌株之間的黏附性，這與發(fā)酵乳桿菌2-1 結(jié)果相似。

圖10 D-核糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌211 菌體形態(tài)的影響Fig.10 The effect of D-ribose on the morphology L.fermentum 211

3 結(jié)論

3 種QSIs 雖對(duì)2 株發(fā)酵乳桿菌的信號(hào)分子AI-2 活性都有一定的抑制作用，但不同種類以及不同濃度的QSIs 對(duì)AI-2 活性的影響效果不同；不同種類以及不同濃度的QSIs 對(duì)菌株生長(zhǎng)量的影響效果雖不顯著，但在一定程度上都能抑制2株發(fā)酵乳桿菌生物膜的形成。最終根據(jù)3 種QSIs對(duì)2 株發(fā)酵乳桿菌AI-2 活性以及生物膜形成量篩選出200 μmol/L 的D-核糖作為發(fā)酵乳桿菌2-1 的QSIs；選擇50 μmol/L 的D-核糖作為發(fā)酵乳桿菌211 的QSIs。對(duì)添加了D-核糖的2 株發(fā)酵乳桿菌使用掃描電鏡觀察菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D-核糖對(duì)2 株發(fā)酵乳桿菌的生物膜狀態(tài)下的菌體形態(tài)雖無(wú)明顯影響，但降低了被膜態(tài)菌株的黏附性，為后續(xù)研究乳酸菌群體感應(yīng)系統(tǒng)與生物膜之間的關(guān)系提供了依據(jù)。