武 樂(lè) 黃淑娟 余騰驊 邱宇安 方義文 梁 群 何 芳 劉利艷

隨著人類生活方式的改變和環(huán)境的日益惡化，癌癥的發(fā)病率越來(lái)越高，最新的研究報(bào)告[1-4]顯示癌癥的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)成為第二大威脅人類健康的疾病。在我國(guó)，癌癥的發(fā)病率和死亡率也是呈逐年上升的趨勢(shì)[5]。中醫(yī)認(rèn)為癌癥屬于多發(fā)病、常見(jiàn)病、難治病，預(yù)后一般欠佳。癌癥屬“正虛邪實(shí)”，“正氣虧虛、毒瘀互結(jié)”是癌癥發(fā)病的重要因素[6-8]，且認(rèn)為，熱毒內(nèi)蘊(yùn)可形成腫瘤，即熱灼血凝，凝結(jié)成塊，熱灼津液，久積成塊等。熱邪可以直入，也可諸邪侵入，郁久化熱;七情不舒，郁結(jié)成熱等，同時(shí)癌癥自身也可生熱成毒。因此，清熱解毒法在癌癥治療中起著重要的作用[9]。石上柏來(lái)源于卷柏科植物深綠卷柏(Selaginella doederleinii Hieron)的干燥全草，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、抗癌、止血的功效，對(duì)于多種腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用，常配伍其他中藥用于癌癥的治療，亦可配合放化療，以減輕放化療后患者出現(xiàn)的不適癥狀[10]。有研究顯示石上柏或其提取物能對(duì)鼻咽癌、肝癌、肺癌、喉癌、卵巢癌有作用[11-14]。然目前對(duì)石上柏治療癌癥的作用機(jī)制尚不明確?；诖?，為了進(jìn)一步研究石上柏的抗腫瘤作用機(jī)制，以石上柏為研究對(duì)象，人類癌癥疾病為靶標(biāo)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，探究出石上柏在治療癌癥中的作用及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件

本研究所涉及的數(shù)據(jù)庫(kù)有:中藥活性成分查詢數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、化合物查詢數(shù)據(jù)庫(kù)PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)swisstargetprediction (http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)、疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)DisGeNET(http://disgenet.org)和Genecards(https://www.genecards.org)、數(shù)據(jù)交集數(shù)據(jù)庫(kù)Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)String(https://string-db.org/cgi/input.pl)；通路查詢數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)PDB(http://www.rcsb.org)、swissmodel(https://swissmodel.expasy.org)。所涉及的軟件有：網(wǎng)絡(luò)可視化Cytoscape3.7.1，通路富集與分子ClueGo2.5.4和CluePedia、R語(yǔ)言，分子對(duì)接軟件DISCOVERY STUDIO軟件等。

1.2 石上柏活性成分及靶點(diǎn)篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中搜集石上柏所有的活性成分；并根據(jù)化合物的類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18、口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥20%為篩選條件(若設(shè)為≥30%，活性成分芹菜素未被涵蓋，故設(shè)20%閾值)[15-17]。將納入活性成分分別在PubChem、swisstargetprediction數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，篩選物種為“homo sapiens”的靶點(diǎn)，并對(duì)各活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選(篩選條件為Probability≥0.05)，此即為石上柏的預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)篩選

在DisGeNET和Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)，以關(guān)鍵詞“Cancer”進(jìn)行檢索，篩選條件分別為:Score_gda≥0.05(DisGeNET)，Relevance score≥10(Genecards)，并將石上柏活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與癌癥疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集，得到共同的靶基因，繪制韋恩圖。

1.4 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物與活性成分靶點(diǎn)(共同靶基因)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape中，繪制藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的建立

將交集后的靶基因上傳到String數(shù)據(jù)庫(kù)，將研究物種選擇為人類(Homo sapiens)，獲取蛋白相互作用數(shù)據(jù)，結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，然后導(dǎo)至Cytoscape軟件進(jìn)行優(yōu)化構(gòu)建和分析蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，節(jié)點(diǎn)大小和顏色均按“degree”排列，edge粗細(xì)和顏色均按“combined_score”排列；根據(jù)R語(yǔ)言篩出核心靶點(diǎn)，并繪制barplot圖。

1.6 癌癥靶點(diǎn)基因通路與功能分析

將篩選的核心靶基因輸入ClueGo數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種Homo sapiens，選擇KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)富集的通路，以具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異“P<0.05”、“Kappa Score”等于1為篩選條件，對(duì)石上柏治療癌癥作用的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)功能和通路分析。并用CluePedia對(duì)所得的通路圖進(jìn)行美化。最后構(gòu)建石上柏-成分-靶基因-信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D。

1.7 活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

在上述步驟結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇靶點(diǎn)數(shù)目最多的活性成分作為配體，PPI 網(wǎng)絡(luò)中“degree”最大的靶點(diǎn)作為受體，進(jìn)行分子對(duì)接。在PDB、swissmodel數(shù)據(jù)庫(kù)下載所需蛋白結(jié)構(gòu)，與pubchem下載的三維結(jié)構(gòu)配體一一對(duì)接，使用Discovery Studio中的“Clean Protein”對(duì)蛋白進(jìn)行初步準(zhǔn)備，包括刪除水分子，雜原子，加氫等步驟，再由程序定義蛋白活性位點(diǎn)。使用LibDock對(duì)接模式進(jìn)行對(duì)接，Docking Preferences為High Quality，Conformation Methon為FAST，Number of Hotspots默認(rèn)為100，Docking Tolerance值默認(rèn)為0.25，與相應(yīng)分子開(kāi)始對(duì)接，對(duì)接完成后選取LibDockScore分值最高的分子-蛋白對(duì)接結(jié)構(gòu)(LibDockScore>100，構(gòu)象予以保留)。分析受體與配體相互作用，主要包括配體分子與蛋白間氫鍵，疏水，鹵鍵，Pi-Pi相互作用等，并保存其結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果

2.1 石上柏活性成分以及靶點(diǎn)篩選

經(jīng)條件篩選，共篩出10個(gè)活性成分。在檢索預(yù)測(cè)靶點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，有2個(gè)化合物無(wú)相關(guān)作用靶點(diǎn)，余下8個(gè)活性成分，再經(jīng)檢索和篩選后，得到194個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。見(jiàn)表1。

表1 石上柏的活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選

分別從DisGeNET和Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取癌癥相關(guān)的疾病靶點(diǎn)4511個(gè)和1521個(gè)，與194個(gè)預(yù)測(cè)靶基因一起輸入Draw Venn Diagram進(jìn)行交集后，得到共同靶基因78個(gè)，即為石上柏潛在作用靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2.3 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物與活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)(共同靶基因)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape中，繪制藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可視圖(圖2)。圖2所示體現(xiàn)了石上柏治療癌癥具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。連接度為前3的潛在活性成分分別為MOL007576(6-[5-(5,7-dihydroxy-4-keto-chromen-2-yl)-2-methoxy-phenyl]-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromone)、MOL000008(apigenin)和MOL000359(sitosterol)。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的建立

將石上柏-癌癥78個(gè)共同靶基因上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)(TSV格式)，然后導(dǎo)至Cytoscape優(yōu)化構(gòu)建和分析蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)：PPI網(wǎng)絡(luò)共有78個(gè)節(jié)點(diǎn)(共同靶基因)通過(guò)622條邊發(fā)生作用，平均節(jié)點(diǎn)Degree為15.9。經(jīng)R語(yǔ)言作出barplot圖(圖3)，從圖中清楚可見(jiàn)VEGFA的Degree值為55，AKT1的Degree值為54，EGFR和ESR1的Degree值分別為47。

2.5 癌癥靶點(diǎn)基因通路與功能分析

篩選出排名前30的核心基因，共計(jì)33個(gè)。經(jīng)通路富集，得到42條信號(hào)通路，其中涉及癌癥的通路19條，激素類5條，血管生成1條，免疫方面2條，代謝相關(guān)通路3條等(圖4)，EGFR、AKT1、MMP3、GSK3B、VEGFA等基因作為cross-talk 基因參與到 2 條及以上通路中，這些通路和基因涉及癌癥發(fā)生發(fā)展如細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、血管新生等重要生物過(guò)程。拓?fù)鋱D顯示石上柏治療癌癥具有多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用。

圖1 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集韋恩圖

2.6 活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

經(jīng)分子對(duì)接，顯示活性成分(6-[5-(5,7-二羥基-4-酮-色烯-2-基)-2-甲氧基-苯基]-5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)色酮)(MOL007576)、芹菜素(MOL000008)均能與蛋白AKT1、VEGFA穩(wěn)定結(jié)合。見(jiàn)表2。

注：圈內(nèi)的8個(gè)節(jié)點(diǎn)分別代表8個(gè)活性成分，圈上和圈外均為作用靶點(diǎn)。

圖3 各靶點(diǎn)相互作用的Degree分布(排名前50)

3 討論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法對(duì)石上柏治療癌癥的作用機(jī)制進(jìn)行研究，從石上柏已知的30個(gè)成分中篩選出10個(gè)有效成分。通過(guò)對(duì)化合物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治隹梢园l(fā)現(xiàn)，(6-[5-(5,7-二羥基-4-酮-色烯-2-基)-2-甲氧基-苯基]-5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)色酮)(6-[5-(5,7-dihydroxy-4-keto-chromen-2-yl)-2-methoxy-phenyl]-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromone，MOL007576)、芹菜素(apigenin，MOL000008)和谷甾醇(sitosterol，MOL000359)可能是石上柏發(fā)揮作用的重要活性成分。 通過(guò)蛋白與蛋白之間的相互作用發(fā)現(xiàn)VEGFA、AKT1、EGFR 、ESR1、SRC、PTGS2、AR、MMP9、MMP2、IGF1R、KDR等蛋白為核心靶點(diǎn)。研究顯示，芹菜素能通過(guò)下調(diào)MMP-2、MMP-9、Bak1蛋白表達(dá)水平,上調(diào)Caspase-3表達(dá)來(lái)有效抑制腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡[18]。通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)抑制喉癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[19]；通過(guò)m-TOR/PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)抑制順鉑耐藥的腫瘤的生成[20]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA) 是一種能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖的糖蛋白，在體內(nèi)廣泛表達(dá)，與其受體 VEGFR 結(jié)合后，參與血管新生。研究顯示芹菜素能通過(guò)抑制 VEGF(A和B)表達(dá)，從而達(dá)到抑制血管生成的目的[21]。

圖4 癌癥核心靶點(diǎn)所涉及通路

表2 6-[5-(5,7-二羥基-4-酮-色烯-2-基)-2-甲氧基-苯基]-5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)色酮)(MOL007576)、芹菜素(MOL000008)與蛋白分子AKT1和VEGFA對(duì)接示意表

β-谷甾醇通過(guò)AKT/GSK-3β信號(hào)通路抑制人胰腺癌的增殖、誘導(dǎo)其凋亡,抑制其遷移和侵襲[22],并通過(guò)激活線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑和死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。研究顯示，其亦能抑制調(diào)控血管生成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[23]。我們研究與上述文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

綜上所述，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)初步驗(yàn)證了石上柏主要活性成分與潛在作用靶點(diǎn)之間的相互作用，闡述了石上柏治療癌癥具有“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的作用機(jī)制，為后續(xù)深入研究石上柏治療癌癥的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。