董 碩，姜璐瑤，聶 巖，翟 婧，張 冉，李文軍，唐志紅

(1.煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005；2.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003)

1 引言

藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)是存在于多種藻類的重要捕光色素蛋白。在紅、藍(lán)藻中，根據(jù)光譜性質(zhì)和起源的不同，將PE分為四類：R-PE，B-PE，C-PE和b-PE[1,2]。PE含有藻膽素，因此呈熒光紅色。藻膽素通過特定的半胱氨酸殘基，共價連接在脫輔基蛋白上。紅藻和藍(lán)藻的PE中通常存在兩種色基，包括藻尿膽素(Absmax=495 nm, phycouroblilin, PUB)和藻紅膽素(Absmax=540～550 nm, phycoerythrobilin, PEB)。PE是易溶于水的色素蛋白，可用作食品、化妝品領(lǐng)域[3]；PE還具有高熒光強(qiáng)度能用于醫(yī)藥領(lǐng)域，并制成熒光試劑用于免疫疾病的診斷[4]；同時PE有抗氧化和抗炎活性[5～7]。在不同領(lǐng)域使用PE時對其純度(Amax/A280)的要求不同，Amax/A280大于0.7為食品級，大于3.0為醫(yī)藥級，大于4.0為試劑級。一般而言，藻紅蛋白的光譜學(xué)純度越高，售價越高[8～10]。

國內(nèi)外已有較多關(guān)于PE分離純化的相關(guān)報(bào)道，例如：馬海樂等[11]以條斑紫菜為原料，采用硫酸銨鹽析、超濾、羥基磷灰石層析和DEAE-52陰離子交換層析獲得純化的R-PE，最高純度(A561/A280)分別為2.76和1.74；付曉蘋等[12]采用硫酸銨分級沉淀、離子交換和凝膠過濾柱層析從紅毛藻中純化得到純度為5.0的PE；Niu等[13]采用硫酸銨鹽析、擴(kuò)展床吸附和離子交換層析3種分離純化方法相結(jié)合，從條斑紫菜純化得到R-PE純度為3.2；刁海平等[14]以海生紅藻多管藻為材料，采用超濾結(jié)合離子交換等3種層析方法分離純化得到試劑級的PE；趙麗等[15]采用2次雙水相層析分離純化方法，以條斑紫菜為原料純化得到R-PE的純度為1.55；郭子葉等[16]以條斑紫菜為原料，采用多次硫酸銨鹽析和兩次羥基磷灰石層次得到R-PE的純度為高于4.5。這些制備方法一般采用多步層析技術(shù)以獲得高純度的PE，其工藝復(fù)雜，得率偏低，生產(chǎn)成本較高，從而使高純度的PE價格居高不下，極大地限制了其應(yīng)用。

我國是紫菜養(yǎng)殖生產(chǎn)大國，條斑紫菜細(xì)胞中含有豐富的藻紅蛋白，但是目前對紫菜的利用僅限于初級產(chǎn)品的加工，深加工技術(shù)落后。本研究以條斑紫菜作為原料，目的是得到快速、高效分離純化藻紅蛋白的方法，采用一步疏水層析法分離純化得到試劑級的R-PE，并對其穩(wěn)定性進(jìn)行考察，為條斑紫菜R-PE的大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料與設(shè)備

條斑紫菜購于江蘇南通；Phenyl-sepharose FF 購于美國GE公司，SDS-PAGE電泳試劑盒及蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為分析純。電熱恒溫水浴鍋(DK-98-1，常州市偉嘉儀器制造有限公司)；分析天平(TE313S-DS，德國賽多利斯集團(tuán))；超微量分光光度計(jì)(NanoOne，賽默飛世爾公司)；臺式高速冷凍離心機(jī)(CT15RT，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司)；高壓雙穩(wěn)電泳儀(DYY-4C，北京六一生物科技有限公司)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 條斑紫菜R-PE的分離純化

2.2.1.1 細(xì)胞的破碎

將新鮮藻體稱重，按照1∶10的比例懸浮于磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH7.2)中，使用組織搗碎機(jī)將藻體破碎后反復(fù)凍融4次。細(xì)胞破碎完全后進(jìn)行離心(10000 r/min，10 min)處理，去除沉淀，所得上清液即為粗提液。

2.2.1.2 硫酸銨分級沉淀

取一定體積細(xì)胞破碎后的粗提液，進(jìn)行硫酸銨分級沉淀，使得蛋白進(jìn)一步分離。加入硫酸銨至飽和度為20%，使得蛋白質(zhì)沉淀。緩慢加入硫酸銨固體粉末，邊加邊攪拌，防止硫酸銨過多造成蛋白質(zhì)局部變性，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝髮⒌鞍讟悠吩? ℃下靜置10 h，樣品進(jìn)行離心處理(1000 r/min，10 min)，上清液進(jìn)行二步鹽析，加入硫酸銨至飽和度為40%，攪拌均勻后在4 ℃靜置10 h，離心(10000 r/min，10 min)處理，棄上清，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液溶解。樣品進(jìn)行全波長掃描，計(jì)算R-PE的純度和回收率。

2.2.1.3 疏水柱層析

疏水層析是利用蛋白質(zhì)表面某一部分具有疏水性，與帶有疏水性的載體在高鹽濃度下結(jié)合，在洗脫時，采用逐漸降低鹽離子濃度，利用其疏水性不同逐個的先后被洗脫下來而純化。硫酸銨分級沉淀所得蛋白純度不能達(dá)到試劑級，因此需要采用層析法進(jìn)一步分離純化，使得樣品純度達(dá)到4.0以上。本實(shí)驗(yàn)采用疏水層析介質(zhì)Phenyl-sepharose FF(Vt=2.5 cm×10 cm)對R-PE粗提液進(jìn)一步分離純化，進(jìn)行梯度洗脫，控制流速，使得流速為2 mL/min，使用逐漸降低鹽離子濃度的磷酸鹽緩沖液(20 mmoL/L，pH7.2)進(jìn)行洗脫，根據(jù)洗脫峰圖譜變化收集R-PE組分，進(jìn)行全波長掃描計(jì)算蛋白純度和回收率。

2.2.2 R-PE含量和回收率(T)的計(jì)算

2.2.2.1 含量計(jì)算

[R-PE]=0.123×A565-0.07×A616+0.015×A650(mg/mL)

(1)

2.2.2.2 回收率計(jì)算

T=(nV[R-PE]/G)×100%

(2)

式(1)、(2)中：[R-PE]為R-PE的含量；A565為R-PE在565 nm處的特征吸收值；A616為R-PE在616 nm處的特征吸收值；A650為R-PE在650 nm處的特征吸收值；n為提取液的稀釋倍數(shù)；V為提取液的總體積；G為粗提液中R-PE含量。

2.2.3 條斑紫菜R-PE的性質(zhì)研究

2.2.3.1 光譜特性

對純化后的R-PE溶液分別進(jìn)行全波長掃描、熒光光譜掃描及圓二色譜測定，根據(jù)圖譜分析R-PE的最大特征吸收峰、最大發(fā)射峰和二級結(jié)構(gòu)主要組成部分。

2.2.3.2 分子量測定

采用SDS-PAGE法，配制濃縮膠的濃度為4%，分離膠的濃度為12%，對粗提液和層析純化后的R-PE樣品進(jìn)行亞基分子量的測定，對所得條帶分析蛋白純化結(jié)果。

2.2.4 條斑紫菜R-PE的穩(wěn)定性研究

2.2.4.1 溫度對條斑紫菜R-PE穩(wěn)定性的影響

取純化后相同濃度的R-PE溶液各1 mL，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃下恒溫水浴處理30 min，進(jìn)行穩(wěn)定性研究。因PE具有很強(qiáng)的熒光性，因此在實(shí)驗(yàn)過程中樣品要進(jìn)行避光保存。對處理后的樣品進(jìn)行全波長掃描，分析不同溫度條件下對R-PE穩(wěn)定性的影響。

2.2.4.2 pH值對條斑紫菜R-PE穩(wěn)定性的影響

取純化后相同濃度的R-PE溶液各1 mL，分別將pH值調(diào)至3、4、5、6、7、8、9，在4 ℃下避光放置24 h，進(jìn)行穩(wěn)定性研究。對處理后的樣品進(jìn)行全波長掃描，分析不同pH值條件下對R-PE穩(wěn)定性的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 條斑紫菜R-PE的分離純化

3.1.1 硫酸銨分級沉淀

在蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子會和蛋白質(zhì)競爭水分子，引起蛋白質(zhì)表面的水化膜的破會，造成蛋白質(zhì)溶解度的降低，使其從溶液中沉淀析出。由于硫酸銨溫度系數(shù)小，溶解度大，且不易引起蛋白變性，因此應(yīng)用最為廣泛。硫酸銨分級沉淀能夠從大量樣品粗提液中濃縮和純化部分目標(biāo)蛋白質(zhì)，且不會引起蛋白質(zhì)的變性，是PE初步純化常用的方法。在本實(shí)驗(yàn)中分別采用20%和40%飽和度的硫酸銨，對R-PE含量為0.39 mg/mL、純度(A565/A280)為0.37的藻細(xì)胞破碎液進(jìn)行分級沉淀，R-PE的純度(A565/A280)達(dá)到0.83，回收率為75.36%。

3.1.2 疏水層析純化

將R-PE粗提液經(jīng)硫酸銨鹽析后離心，用少量磷酸鹽緩沖液溶解沉淀。采用Phenyl-sepharose FF疏水層析介質(zhì)進(jìn)行純化，經(jīng)洗雜、洗脫后，得到純化的R-PE，洗脫曲線如圖1所示。大多數(shù)雜蛋白在較高濃度的硫酸銨條件下流出，而R-PE在含低鹽的磷酸緩沖液洗脫時流出，說明條斑紫菜R-PE的表面疏水性較強(qiáng)。經(jīng)過一步疏水層析后，條斑紫菜R-PE純度(A565/A280)為5.47，達(dá)到試劑純，總回收率為56.92%。

圖1 條斑紫菜R-PE洗脫圖譜

3.2 條斑紫菜R-PE的鑒定

3.2.1 光譜特性

對純化的R-PE樣品進(jìn)行全波長掃描，如圖2所示。結(jié)果顯示，R-PE在498 nm和565 nm處有2個完全吸收峰，544 nm處有一肩峰，最大吸收峰位于565 nm，這與方勇等[17]報(bào)道的R-PE可見光光譜特性基本一致。565 nm處特征吸收峰是由藻紅膽素引起的，498 nm處特征吸收峰是由藻尿膽素引起的，說明條斑紫菜R-PE中含有藻紅膽素和藻尿膽素2種藻膽素。

圖2 條斑紫菜R-PE全波長掃描

對純化的R-PE樣品進(jìn)行熒光光譜掃描，如圖3所示。從圖3a可以看出，R-PE的激發(fā)光譜在496 nm、540 nm和560 nm處有峰出現(xiàn)，最大熒光激發(fā)峰位于560 nm處；由圖3b可以看出，R-PE的最大熒光發(fā)射峰位于576 nm處左右，這與臧帆等[18]報(bào)道的研究結(jié)果基本一致，說明本研究所采用的純化方法不會影響R-PE結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

圖3 條斑紫菜R-PE熒光光譜

對純化的R-PE樣品進(jìn)行圓二色譜測定，如圖4所示。250 nm以下為遠(yuǎn)紫外光譜區(qū)，主要反映的是蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)[19]，例如α-螺旋和β-折疊。通過色譜帶能夠反映出蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)信息，R-PE紫外光區(qū)的圓二色譜在218 nm和221 nm處有兩個負(fù)峰，在219 nm處可見一個明顯缺口，這是α-螺旋占主導(dǎo)位置的圓二色譜，說明純化R-PE的二級結(jié)構(gòu)元件主要為α-螺旋。

圖4 條斑紫菜R-PE的圓二色譜

3.2.2 分子量測定

將粗提液和純化后的R-PE樣品進(jìn)行SDS-PAGE，如圖5所示。結(jié)果表明，分子量在14～23 kDa之間的蛋白條帶是R-PE的α和β亞基，分子量在30 kDa附近的是γ亞基，2泳道的條帶顏色深且寬度大，說明純化后的R-PE含量和純度都很高，因?yàn)閮蓚€亞基的相對分子質(zhì)量相當(dāng)接近，因此2泳道出現(xiàn)折疊現(xiàn)象。文獻(xiàn)報(bào)道條斑紫菜R-藻紅蛋白的α、β、γ亞基分子量分別為17、19和33 kDa[20]，與本研究的結(jié)果相吻合。已知R-PE的存在形式一般為(αβ)6γ[21]，故推測條斑紫菜中R-PE的相對分子質(zhì)量約為279 kDa。

圖5 條斑紫菜R-PE的SDS-PAGE圖譜

3.3 條斑紫菜R-PE的穩(wěn)定性研究

3.3.1 溫度對條斑紫菜R-PE穩(wěn)定性的影響

對純化所得R-PE樣品經(jīng)過不同溫度水浴處理30 min后，由圖6可以看出，與對照組相比，在30～60 ℃范圍內(nèi)，R-PE的特征吸收峰沒有發(fā)生太大變化，說明此時對R-PE穩(wěn)定性沒有太大影響，基本保持不變。在70 ℃處理后最大特征吸收峰出現(xiàn)明顯下降，經(jīng)過80 ℃處理后，R-PE最大特征吸收峰消失，R-PE發(fā)生了局部變性。通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明在低于60 ℃時R-PE較為穩(wěn)定，當(dāng)溫度超過60 ℃時，藻紅蛋白的光吸收值(A565)會顯著降低，造成蛋白性質(zhì)改變。推測超過60 ℃時R-PE的空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而對其光吸收值(A565)產(chǎn)生影響，因此在保存或處理?xiàng)l斑紫菜R-PE時應(yīng)選擇低溫的環(huán)境。

圖6 不同溫度處理后R-PE的全波長掃描圖譜

3.3.2 pH對條斑紫菜R-PE穩(wěn)定性的影響

對純化所得R-PE樣品經(jīng)過不同pH條件處理后，如圖7所示,與對照組相比，當(dāng)R-PE溶液處于pH5～7時，其在565 nm處的光吸收值沒有發(fā)生明顯變化。表明在接近中性的條件時，R-PE的光譜學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定。但是當(dāng)R-PE溶液的pH值高于7或低于5時，與對照組相比，其在565 nm處的吸光值顯著降低，且分別在pH值為3、4、10時沒有出現(xiàn)最大光吸收峰，推測過酸、過堿環(huán)境能造成R-PE結(jié)構(gòu)的破壞，因此在保存條斑紫菜R-PE時應(yīng)選擇接近中性的條件。

圖7 不同pH值處理后R-PE的全波長掃描圖譜

4 結(jié)論

本研究采用硫酸銨分級沉淀結(jié)合疏水層析法純化，獲得的R-PE純度(A565/A280)達(dá)到試劑級。通過對R-PE進(jìn)行表征結(jié)果的分析，確定了其最大特征吸收峰、最大熒光發(fā)射峰、R-PE的主要二級結(jié)構(gòu)和亞基分子組成。穩(wěn)定性研究顯示R-PE在低于60 ℃、pH值在5～7條件下能保持相對穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)采用一步層析法純化得到較高純度的R-PE，操作簡單，減少了純化時間和一定的工藝成本，綠色高效，為條斑紫菜資源的后續(xù)利用提供了相應(yīng)的依據(jù)。