毛聯(lián)崗

（連云港杰瑞藥業(yè)有限公司，江蘇 連云港 222006）

比卡魯胺屬于一種新型非甾體類抗雄激素藥，可用于黃體生成素釋放激素（LHRH）類似物或外科睪丸切除術聯(lián)合應用于晚期前列腺癌的治療[1,2]。目前，歐洲藥典（EP）10.0版采用HPLC法測定比卡魯胺原料藥有關物質(zhì)，但未列明其片劑的質(zhì)量控制標準[3]，而美國藥典（USP）43版所列檢測方法對片劑的雜質(zhì)分離效果一般，且檢測靈敏度偏低，中國藥典暫未收載該原料藥和片劑的質(zhì)量標準[4]。為保證藥品的質(zhì)量，并保障患者的用藥安全，進行比卡魯胺片的有關物質(zhì)檢測方法研究具有重要意義?；趨⒖嘉墨I所述方法[5-7]，本研究通過進一步優(yōu)化流動相比例、柱溫、檢測波長等色譜條件，建立高效液相色譜（HPLC）測定比卡魯胺片有關物質(zhì)的分析方法，從而為相關產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考。

1 實驗部分

1.1 試藥信息

比卡魯胺片（50mg·片-1阿斯利康制藥有限公司）；雜質(zhì)A（N-[4-氰基-3-（三氟甲基）苯基]-2-羥基-2-甲基-3-苯磺酰基丙酰胺）對照品（EP，純度99.4%）；雜質(zhì)B（N-[4-氰基-3-（三氟甲基）苯基]-3-[（2-氟苯基）磺?；鵠-2-甲基丙酰胺）對照品（EP，純度99.8%）；雜質(zhì)C（N-[4-氰基-3-（三氟甲基）苯基]-3-[（4-氟苯基）磺?；鵠-2-丙酰胺）對照品（EP，純度98.8%）；雜質(zhì)D（4-氰基-3-三氟甲基苯胺）對照品（EP，純度99.9%）；雜質(zhì)E（N-[4-氰基-3-（三氟甲基）苯基]-3-[（4-氟苯基）亞磺?；鵠-2-羥基-2-甲基丙酰胺）對照品（EP，純度97.1%）；比卡魯胺對照品（EP，純度99.5%）。

1.2 儀器與試劑

U3000型高效液相色譜儀（美國Thermo-Fisher公司）；MS204/A型分析天平（梅特勒-托利多有限公司）；CSH-111GD型光照試驗箱（重慶創(chuàng)測科技有限公司）；101-2BS型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海力辰儀器科技有限公司）。

HCl、NaOH、H2O2均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；三氟乙酸、乙腈，均為色譜純，阿拉丁試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.3 色譜條件

采用Agilent Hypersil ODSC18色譜柱（100mm×4mm，3μm）；流動相A：0.01%三氟乙酸水溶液，流動相B：0.01%三氟乙酸乙腈溶液；梯度洗脫（0min、70%A，19min、70%A，29min、40%A，34min、40%A，36min、70%A，40min、70%A）；柱溫：40℃；流速1.0mL·min-1；檢測波長270nm；進樣體積10μL。

1.4 溶液配制

稀釋劑 流動相A與流動相B的體積比為1∶2。

系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取比卡魯胺及其對照品適量（雜質(zhì)A、B、C、D、E與比卡魯胺質(zhì)量比為1∶1∶1∶1∶1∶1000）置于一定體積的容量瓶中，加入稀釋劑定容、搖勻，配制成比卡魯胺濃度為1mg·mL-1的系統(tǒng)適用性溶液。

混合對照品溶液 精密稱取雜質(zhì)A、B、C、D、E和比卡魯胺適量(雜質(zhì)A、B、C、D、E與比卡魯胺質(zhì)量比為1∶1∶1∶1∶1∶1）置于一定體積容量瓶中，加入稀釋劑定容、搖勻，配制成比卡魯胺濃度為1μg·mL-1的混合對照品溶液。

供試品溶液 取比卡魯胺片20片研細，精密稱取適量置于一定體積的容量瓶中，加入稀釋劑定容、搖勻，配制成比卡魯胺濃度為1mg·mL-1供試品溶液，測定時取續(xù)濾液。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性溶液

精密量取系統(tǒng)適用性溶液，照“1.3項”所述色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of system suitability solution

由圖1可見，出峰順序分別為雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、比卡魯胺、雜質(zhì)C，各已知雜質(zhì)與比魯卡胺色譜峰之間的分離度均大于1.5，同時比卡魯胺色譜峰理論塔板數(shù)大于5000，表明各色譜峰之間均能完全分離，系統(tǒng)適用性良好。

2.2 專屬性試驗

酸破壞 稱取比卡魯胺片粉末（相當于比卡魯胺20mg），置于20mL量瓶內(nèi)，加入1mol·L-1HCl溶液2mL后，于40℃水浴中放置6h后，加入1mol·L-1NaOH溶液2mL后，加入稀釋劑定容搖勻，即得酸破壞樣品；

堿破壞 稱取比卡魯胺片粉末(相當于比卡魯胺20mg），置于20mL量瓶內(nèi)，加入1mol·L-1NaOH溶液2mL后，于40℃水浴中放置6h后，加入1mol·L-1HCl溶液2mL后，加入稀釋劑定容搖勻，即得堿破壞樣品；

光照破壞 稱取比卡魯胺片粉末（相當于比卡魯胺20mg），置于20mL量瓶內(nèi)，加入稀釋劑定容搖勻后，置于（5000±500）Lx光照48h，即得光照破壞樣品；

高溫破壞 稱取比卡魯胺片粉末（相當于比卡魯胺20mg），置于20mL量瓶內(nèi)，加入稀釋劑定容搖勻后，置于60℃水浴加熱8h，即得高溫破壞樣品；

氧化破壞 稱取比卡魯胺片粉末（相當于比卡魯胺20mg），置于20mL量瓶內(nèi)，加入30%雙氧水2mL，放置6h后，加入稀釋劑定容搖勻，即得氧化破壞樣品。

表1為破壞后樣品的專屬性試驗結(jié)果。

表1 專屬性試驗結(jié)果Tab.1 Results of specific test

從表1可知，在強酸、強堿和光照破壞下，比卡魯胺主峰面積基本不變，雜峰峰面積之和未明顯增加，但在高溫與氧化條件下，主峰峰面積下降明顯，雜質(zhì)生成量增多，表明比卡魯胺在上述條件下不穩(wěn)定，另外比卡魯胺的峰面積減小值與各有關物質(zhì)的峰面積的增多值基本達到平衡，比值均>98%，可知物料基本守恒，通過光電二極管陣列（DAD）檢測器測得主峰純度均大于980，表明主峰未包裹其他雜質(zhì)，該方法專屬性較好。

2.3 線性關系考察

精密稱取比卡魯胺5種雜質(zhì)的對照品各30.0mg置于100mL量瓶中，加入稀釋劑溶解后，定容搖勻，另取上述溶液5mL置于100mL量瓶，加入稀釋劑定容搖勻后，分別移取1、2、3、5、10mL置于100mL容量瓶中，加入稀釋劑定容搖勻后，按照“1.3項”所述色譜條件注入色譜儀，以峰面積對濃度作標準曲線，并計算線性回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 不同物質(zhì)的線性關系考察結(jié)果Tab.2 Results of linear relationship of different samples

從表2可知，各物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)與響應值呈良好的線性關系，相關系數(shù)均大于0.99，且方程截距與100%響應值的比值均在20%以內(nèi)。

2.4 檢測限與定量限

將混合對照品溶液逐步稀釋后照“1.3項”所述色譜條件進樣，以色譜峰信噪比約為3的濃度作為檢測限，信噪比約為10的濃度作為定量限，各雜質(zhì)及比魯卡胺的檢測限與定量限的結(jié)果見表3。

表3 不同物質(zhì)的檢測限與定量限（n=6）Tab.3 Results of LOD and LOQ of different samples（n=6）

從表3可知，各已知雜質(zhì)的定量限濃度均低于ICH要求的報告限濃度（0.1%），因此，可滿足定量測定的要求。

2.5 準確度考察

精密稱取5種雜質(zhì)的對照品各20.0mg置于100mL容量瓶中，加入稀釋劑溶解后，定容搖勻，另取上述溶液5mL置于100mL容量瓶，加入稀釋劑定容搖勻后，分別移取0.5mL和1mL置于100mL量瓶，移取3mL至20mL量瓶后，均加入供試品溶液定容搖勻，配制成各已知雜質(zhì)濃度分別為50%、100%、120%的加標溶液，按照“1.3項”所述色譜條件，記錄色譜圖，計算各已知雜質(zhì)的回收率，結(jié)果見表4。

表4 不同雜質(zhì)測定結(jié)果的回收率（n=3）Tab.4 Recovery results of different samples（n=3）

由表4可見，各已知雜質(zhì)的回收率結(jié)果均在96.1%～103.4%范圍內(nèi)，表明該方法對比卡魯胺雜質(zhì)的測定結(jié)果準確度較好。

2.6 精密度考察

不同實驗人員在不同時間下對供試品溶液中有關物質(zhì)進行測定，記錄色譜圖峰面積，計算各已知雜質(zhì)和含量，平行測定6次，結(jié)果見表5。

表5 精密度試驗結(jié)果Tab.5 Results of precision test

從表5可知，不同人員測得的供試品溶液中雜質(zhì)和的含量平均值分別為0.21%與0.24%，結(jié)果RSD低于10%，表明該方法測定比卡魯胺片有關物質(zhì)具有良好的精密度。

2.7 穩(wěn)定性試驗

將混合對照品溶液與供試品溶液按照“1.3項”所述色譜條件分別在0、4、8、12、16、20、24h進樣，記錄色譜圖，記錄各已知雜質(zhì)與比卡魯胺的峰面積，發(fā)現(xiàn)混合對照品溶液中比卡魯胺及雜質(zhì)A、B、C、D、E的峰面積RSD分別為1.12%、0.88%、0.63%、0.52%、0.85%、1.03%，表明其在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，同時供試品溶液中最大單個雜質(zhì)的峰面積RSD為0.66%，雜質(zhì)和峰面積的RSD為1.22%，可知在24h內(nèi)，供試品溶液的測定結(jié)果基本無明顯改變。

2.8 樣品有關物質(zhì)檢測結(jié)果

精密量取混合對照品溶液按照“1.3項”所述色譜條件進樣，調(diào)整主成分色譜峰峰高約滿量程20%后，進樣供試品溶液，記錄色譜圖，根據(jù)表1所列校正因子，按照主成分自身對照法測得各雜質(zhì)含量，結(jié)果見表6。

表6 3批比卡魯胺片的有關物質(zhì)含量（%）Tab.6 Content of related substance of samples of three batch

從表6可見，3批比卡魯胺片的有關物質(zhì)含量之和均為超過0.5%。

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜法測定比卡魯胺片的有關物質(zhì)，確定的最佳色譜條件可較好地分離比卡魯胺及其已知雜質(zhì)。從專屬性結(jié)果可知，高溫與氧化條件對產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響。該方法操作簡便，測定結(jié)果具有較好的精密度和準確度，因此，適用于測定比卡魯胺片中有關物質(zhì)的含量。