葉媛麗，吳章橋，何欣，王東博，孫杰，朱曉霞

（1 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010；2 四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，四川綿陽 621010）

竹屬禾本科竹亞科植物，廣泛分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)，溫帶和寒帶地區(qū)也有少量分布[1]。我國是竹類資源最豐富的國家，在北起遼寧、南到海南的領(lǐng)土上分布著大面積的竹類植物。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界共有127屬約1680 種竹類植物，其中中國特有竹類植物23 屬371 種[2]，約占22%。大多數(shù)植物產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)效益幾乎都是通過新品種持續(xù)選育來實(shí)現(xiàn)的，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法在親緣關(guān)系鑒定、遺傳多樣性探索等方面準(zhǔn)確性較低，且對(duì)數(shù)量性狀的鑒定具有一定的局限性，使植物新品種創(chuàng)制受到限制。因此，DNA 分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。DNA 分子標(biāo)記是根據(jù)個(gè)體或種群間的核苷酸序列的差異作為遺傳標(biāo)記，直觀明了地從DNA 水平上反映出生物的多樣性[3]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展和完善，到21 世紀(jì)初，DNA 分子標(biāo)記技術(shù)已在水稻、玉米、小麥等多種禾本科植物的遺傳多樣性研究、分子遺傳圖譜與指紋圖譜構(gòu)建等研究中得到成功應(yīng)用。

1 DNA 分子標(biāo)記的類型和特點(diǎn)

分子標(biāo)記是根據(jù)個(gè)體或種群間的核苷酸序列的差異作為遺傳標(biāo)記，直觀明了地從DNA 水平上反映出生物的多樣性。與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記相比，分子標(biāo)記更具優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面[4-5]：①存在形式為DNA，在生物的各組織、各發(fā)育階段都可進(jìn)行標(biāo)記分析；②具有區(qū)分顯性純合以及雜合體的功能；③不僅標(biāo)記的類型豐富多樣，而且僅用簡單高效手段就可將其檢測出來。目前，分子標(biāo)記主要分為3 類[6]：以雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，主要是限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）；以PCR 為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，主要是隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）、簡單重復(fù)序列（SSR）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）、內(nèi)部簡單重復(fù)序列（ISSR）；以單核苷酸變異為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，主要包括單核苷酸多態(tài)性（SNP）。接下來對(duì)幾種常用的分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行介紹。

1.1 AFLP 分子標(biāo)記

AFLP 分子標(biāo)記利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA片段，基因組DNA 首先需要用限制性內(nèi)切酶切割，接著將雙鏈的接頭與DNA 片段的末端相連，其引物由接頭、酶切位點(diǎn)和幾個(gè)核苷酸組成[7]。在PCR 擴(kuò)增時(shí)，引物與接頭特異性識(shí)別，擴(kuò)增出片段大小不一的DNA 片段。但此項(xiàng)技術(shù)成本相對(duì)較高，對(duì)所用DNA 的純度也有一定的要求。

1.2 SSR 分子標(biāo)記

SSR 分子標(biāo)記是利用微衛(wèi)星DNA 兩端的重復(fù)序列具有相對(duì)保守的單拷貝序列的特點(diǎn)來設(shè)計(jì)引物，利用此引物擴(kuò)增出串聯(lián)重復(fù)序列，再通過電泳分析技術(shù)獲得其DNA 的長度多態(tài)性。所謂的微衛(wèi)星DNA 就是指分布在整個(gè)基因組的不同位置、以1～6 個(gè)核苷酸為基本單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，是SSR 分子標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)[8]。該分子標(biāo)記方法具有較好的重復(fù)性和可靠性。

1.3 ISSR 分子標(biāo)記

ISSR 分子標(biāo)記是針對(duì)SSR 的局限性而開發(fā)的，該技術(shù)不需要預(yù)先知道目標(biāo)基因的序列就可以擴(kuò)增出序列相同、方向相反的基因片段。與SSR 相比，ISSR 成本更低、操作也更加簡單，加之其所用的引物較長，實(shí)驗(yàn)也具有較高的重復(fù)性[9]。

1.4 RAPD 分子標(biāo)記

RAPD 分子標(biāo)記利用由8～10 個(gè)堿基組成隨機(jī)引物，通過非定點(diǎn)擴(kuò)增DNA 片段，接著凝膠電泳成像，利用條帶結(jié)果進(jìn)行DNA 片段的多態(tài)性分析，根據(jù)片段多態(tài)性來推測該種生物內(nèi)DNA 的多態(tài)性和表型性狀的規(guī)律。該技術(shù)也不需要預(yù)先知道DNA 的序列，DNA 的用量少、反應(yīng)靈敏[10]。但是該技術(shù)在區(qū)分純合子和雜合子方面具有一定的困難，且其重復(fù)性和穩(wěn)定性都比較差。

1.5 SCoT 分子標(biāo)記

SCoT 分子標(biāo)記是2009 年由Collard 和Mackill 共同開發(fā)的一種新的分子標(biāo)記技術(shù)，根據(jù)植物基因中以ATG 翻譯起始位點(diǎn)的側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計(jì)出可同時(shí)充當(dāng)上下游的單引物，并對(duì)生物基因組進(jìn)行擴(kuò)增[11]。SCoT 有效地產(chǎn)生與性狀連鎖的標(biāo)記，可有效避免獲得的多態(tài)性位點(diǎn)與目標(biāo)性狀基因相隔太遠(yuǎn)。

2 DNA 分子標(biāo)記在竹類植物中的應(yīng)用

2.1 指紋圖譜構(gòu)建

個(gè)體在DNA 水平上的差異可由指紋圖譜直觀明了地體現(xiàn)出來[12]，因此，可以對(duì)竹種的分子遺傳圖譜作圖，構(gòu)建出竹類植物的DNA 多態(tài)性，篩選出能夠反映竹種或品種特征的指紋圖譜作為竹類植物分類與鑒定的分子依據(jù)。袁金玲等[13]發(fā)現(xiàn)SSR 引物能有效地鑒定叢生竹雜交種，并且利用SSR 引物擴(kuò)增出來的位點(diǎn)可以構(gòu)建2 個(gè)雜交群體的指紋圖譜，為該品種的保護(hù)提供了保障。瞿印權(quán)等[14]為研究綠竹等30 個(gè)竹種的親緣關(guān)系，基于ISSR 標(biāo)記建立其DNA 指紋圖譜，結(jié)果表明ISSR 技術(shù)可準(zhǔn)確地分析竹種間的親緣關(guān)系。

2.2 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是指某個(gè)物種或群體內(nèi)部的個(gè)體間的遺傳變異的總稱。對(duì)于分布較廣的竹類植物來說，地理因素對(duì)其天然居群的物種分化具有深遠(yuǎn)的影響，但在兩者的相關(guān)性上，不同物種的研究結(jié)果并不一致。劉濟(jì)明等[15]利用RAPD 標(biāo)記發(fā)現(xiàn)小生境間的差異使小蓬竹具有較高的遺傳多樣性。同年該學(xué)者仍采用RAPD 標(biāo)記技術(shù)欲從分子水平上研究不同居群小蓬竹的遺傳多樣性和環(huán)境因子的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主要的遺傳變異存在于小蓬竹居群內(nèi)部而非各個(gè)天然的居群之間，同時(shí)小蓬竹居群內(nèi)部多樣性最豐富的是落灣，這可能與采樣地前一年遭遇了大旱有關(guān)[16]。復(fù)合體內(nèi)各竹種間的劃分由于形態(tài)學(xué)特征上存在著不同程度的過渡而變得十分困難。黃蕾等[17]對(duì)箭竹復(fù)合體內(nèi)不同居群的SSR 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：海拔和緯度對(duì)箭竹復(fù)合體內(nèi)遺傳多樣性雖有一定的影響，但并非二者直接導(dǎo)致，而是多種進(jìn)化因素的共同作用。李世添[18]率先嘗試?yán)肐RAP 分子標(biāo)記技術(shù)分析剛竹屬植物的種間遺傳多樣性，同時(shí)也為竹類植物的鑒別提供新思路。董文淵等[19]對(duì)筇竹11 項(xiàng)形態(tài)性狀進(jìn)行分析研究，結(jié)果顯示，10 項(xiàng)性狀在居群間差異達(dá)到了極顯著水平，從形態(tài)水平上揭示了10 個(gè)筇竹自然居群間豐富的遺傳多樣性。之后邱月群等[20]基于SSR 技術(shù)進(jìn)行同樣的研究，卻發(fā)現(xiàn)筇竹居群遺傳多樣性呈現(xiàn)中等水平，且遺傳變異主要存在于居群內(nèi)，這與之前基于形態(tài)學(xué)的研究結(jié)果有一定的出入。

2.3 親緣關(guān)系鑒定及分析

大多數(shù)竹類植物采用無性繁殖，其品種及栽培類型如果只靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定是不準(zhǔn)確的，導(dǎo)致許多竹種之間親緣關(guān)系還存在一定的爭議，這直接影響了竹類植物科學(xué)有效地利用。從分子上對(duì)親緣關(guān)系進(jìn)行鑒定，比傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定更加準(zhǔn)確。徐鵬飛[21]首次篩選出15 對(duì)適用于TP-M13-SSR 熒光毛細(xì)電泳檢測的引物，并利用此項(xiàng)技術(shù)鑒定疑似雜交種。趙琳[22]采用ISSR 對(duì)3 個(gè)屬11 個(gè)耐濕竹種進(jìn)行親緣關(guān)系的研究，利用此分子標(biāo)記技術(shù)可明顯地將11 個(gè)竹種區(qū)分開來，同時(shí)聚類分析結(jié)果與部分傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，在一定程度上支持并補(bǔ)充了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法。

3 展望

分子標(biāo)記目前已廣泛應(yīng)用于多種竹類植物，并已建立其特定分子標(biāo)記反應(yīng)體系，為后續(xù)分析奠定了基礎(chǔ)。DNA 分子標(biāo)記大多用于竹類植物遺傳多樣性研究，而在親緣關(guān)系鑒定以及指紋圖譜構(gòu)建方面研究相對(duì)較少，導(dǎo)致近緣種或野生種難以得到科學(xué)利用，分子標(biāo)記輔助選擇育種的開展受到一定的制約。為此，今后應(yīng)加強(qiáng)竹類植物DNA 分子標(biāo)記技術(shù)在以下3 個(gè)方面的利用：一是加強(qiáng)DNA 分子標(biāo)記技術(shù)在竹類植物指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定方面的應(yīng)用；二是構(gòu)建不同竹類植物高密度的分子連鎖遺傳圖譜，尋找出與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記；三是DNA 分子標(biāo)記應(yīng)用于竹類植物分子輔助育種和對(duì)突變體的鑒定。

（收稿：2022-02-17）