李鵬川 梁艷 張林西 吳雪瓊

迄今為止，卡介苗是世界上唯一獲得許可的結(jié)核病疫苗，但它對(duì)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)人群不能產(chǎn)生有效的預(yù)防和保護(hù)作用[1]。因此，研究針對(duì)LTBI人群的疫苗對(duì)于結(jié)核病的控制十分重要。目前國(guó)內(nèi)外新型結(jié)核病疫苗的種類主要有滅活疫苗、活疫苗和亞單位疫苗。亞單位疫苗只用結(jié)核分枝桿菌(Mycombacteriumtuberculosis, MTB)的一部分成份引起機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，主要包括DNA疫苗、重組蛋白疫苗或多肽疫苗(加佐劑)、多肽以外的其他純化的主要成份(如枝菌酸、糖脂，等)，可作為卡介苗的加強(qiáng)疫苗。

W541是由MTB增殖期抗原Ag85A和Ag85B及潛伏相關(guān)抗原Rv3407和Rv1733c四種抗原串聯(lián)起來(lái)的新型多抗原表位融合DNA疫苗編碼的蛋白。Ag85復(fù)合物是MTB和卡介苗的主要分泌性蛋白，在H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株中占分泌蛋白總量的30%，是一組重要的分枝桿菌分泌蛋白。Ag85復(fù)合物是由Ag85A、Ag85B和Ag85C 3個(gè)蛋白組成。有研究表明，Ag85A和Ag85B可誘導(dǎo)較強(qiáng)的輔助性T淋巴細(xì)胞1型(Th1型)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(IL-2)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)升高，而Ag85C卻無(wú)此效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，Rv3407是存在于H37Rv菌株全細(xì)胞裂解液中的1個(gè)LTBI激活相關(guān)的蛋白；對(duì)Rv3407蛋白抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它是1個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原表位都較豐富的蛋白抗原[2]；Rv3407 DNA疫苗可明顯誘導(dǎo)小鼠體液和Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)小鼠結(jié)核模型具有明顯的免疫治療作用[3]。Rv1733c是MTB在休眠期表達(dá)量比較高的一種保守的跨膜蛋白。Black等[4]在南非、岡比亞和烏干達(dá)等3個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中研究了7個(gè)經(jīng)典的MTB重組蛋白抗原和51個(gè)休眠調(diào)節(jié)子編碼的MTB重組蛋白抗原刺激人機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答情況，發(fā)現(xiàn)Rv1733c抗原是被識(shí)別頻率最高的一個(gè)潛伏相關(guān)蛋白抗原，并且應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)全血中分泌的IFN-γ量也較高；Rv1733c DNA疫苗對(duì)小鼠結(jié)核模型有一定的治療作用[5]。因此，筆者選擇這4種蛋白的抗原表位串聯(lián)構(gòu)建重組蛋白和DNA疫苗，應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)MTB W541蛋白的結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，為研究新型結(jié)核病疫苗提供理論依據(jù)。

材料和方法

一、W541蛋白的氨基酸序列

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的多表位串聯(lián)DNA疫苗編碼蛋白W541的氨基酸序列為：FSRPGLPVEYLQVP

SPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQD

DFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSF

YSDWYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWL

QANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHP

QQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDA

GGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIA

NNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFV

RTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSW

EYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQG

AGSGGGSGGRRLMIGTAAAVVLPGLVGLAGG

AATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQF

QSGGNNSPAVYLLDGLRAQDDYNGWDINTPA

FEWYYQSGLSIVMPVGGQSSFYSDWYSPACGK

AGCQTYKWETFLTSELPQWLSANRAVKPTGS

AAIGLSMAGSSAMILAAYHPQQFIYAGSLSAL

LDPSQGMGPSLIGLAMGDAGGYKAADMWGPS

SDPAWERNDPTQQIPKLVANNTRLWVYCGNG

TPNELGGANIPAEFLENFVRSSNLKFQDAYNA

AGGHNAVFNFPPNGTHSWEYWGAQLNAMKG

DLQGPGPGLRQHASRYLARVEAGGPGPGSGV

LIPARRPQNLLDVTAEPARGRKRTLSDVLNEM

RGPGPGIPFAAAAGTAVQDSRSHVYAHQAQT

RHP。

二、W541蛋白的序列分析

分別應(yīng)用在線軟件ProtParam(https://web.expasy.org/Protparam)預(yù)測(cè)分析蛋白的理化性質(zhì)；應(yīng)用Protscale(https://web.expasy.org/protscale)預(yù)測(cè)分析蛋白的親(疏)水性；應(yīng)用TMHMM(TMHMM Server v.2.0)(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)預(yù)測(cè)分析蛋白的跨膜區(qū)域。

三、W541蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

應(yīng)用在線軟件SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對(duì)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；應(yīng)用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org)分析其三級(jí)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行同源建模。

四、W541蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

應(yīng)用PSORT Prediction (https://psort.hgc.jp/)和SingnalP 5.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)預(yù)測(cè)分析W541蛋白的亞細(xì)胞定位及信號(hào)肽。

五、W541蛋白質(zhì)翻譯后的修飾預(yù)測(cè)

應(yīng)用NetNGlyc 1.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)和NetOGlyc 4.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0)預(yù)測(cè)蛋白的糖基化修飾位點(diǎn)；應(yīng)用NetPhos 3.1 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)預(yù)測(cè)蛋白的磷酸化位點(diǎn)。

六、W541蛋白抗原表位的預(yù)測(cè)

1．B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)：應(yīng)用在線軟件IEDB(http://tools.iedb.org/bcell/)對(duì)該蛋白的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。輸入氨基酸序列，通過(guò)KarpIus&Schulz分析柔韌性、Kolaskar和Tongaonkar預(yù)測(cè)抗原性、Emini預(yù)測(cè)抗原表面可及性、Parker預(yù)測(cè)親水性，Chou和Fasman法預(yù)測(cè)氨基酸編碼蛋白質(zhì)的β轉(zhuǎn)角，對(duì)B細(xì)胞表位進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測(cè)分析；最后選取親水性與表面可及性良好、柔韌性強(qiáng)、抗原性好、最好為卷曲和轉(zhuǎn)角這種可能性大的區(qū)域作為候選B細(xì)胞表位，盡量避開a螺旋、β折疊結(jié)構(gòu)。

2．Th表位的預(yù)測(cè)：(1)應(yīng)用SYFPEITHI超基序法預(yù)測(cè)Th表位，登陸網(wǎng)址(http://www.syfpeithi.de/)，點(diǎn)擊EPITOPEPREDICTION進(jìn)入表位預(yù)測(cè)界面，輸入W541蛋白氨基酸序列，對(duì)MHC類型為HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301(DR17)、HLA-DRB1*0401(DR4Dw4)、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1501(DR2b)進(jìn)行遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)，選多肽長(zhǎng)度為15aa，取分值≥18分的序列為候選Th表位。(2)應(yīng)用RANKPEP軟件預(yù)測(cè)Th表位，登陸網(wǎng)址(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)，輸入W541蛋白氨基酸序列，在MHCII中選擇亞型為HLA-DR1(DRB1*0101)、HLA-DR17(DRB1*0301)、HLA-DR4(DRB1*0401)、HLA-DR7(DRB1*0701)、HLA-DR8(DRB1*0801)、HLA-DR11(DRB1*1101)及HLA-DR15(DRB1*1501)的限制性Th細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，記錄有紅色標(biāo)記的為候選表位序列。綜合分析上述兩種軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，將得分均較高的序列選為候選Th表位。

3.CTL表位的預(yù)測(cè)：(1)應(yīng)用SYFPEITHI超基序法預(yù)測(cè)CTL表位，登陸網(wǎng)址(http://www.syfpeithi.de/)，點(diǎn)擊EPITOPEPREDICTION進(jìn)入表位預(yù)測(cè)界面，輸入W541蛋白氨基酸序列，選擇HLA-A*02:01、HLA-A*03、HLA-B*07:02三類進(jìn)行遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)，選多肽長(zhǎng)度為9aa，取分值≥18分的序列。(2)應(yīng)用RANKPEP軟件預(yù)測(cè)CTL表位，登陸網(wǎng)址(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)，輸入W541蛋白氨基酸序列，在MHCI中選擇HLA-A*02:01(A2)、HLA-A*03:01(A3)、HLA-B*07:02 (B7)三類限制表型進(jìn)行遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)，記錄有紅色標(biāo)記的為候選表位序列。(3)應(yīng)用NetMHC軟件預(yù)測(cè)CTL表位，登陸網(wǎng)址(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)，輸入W541蛋白氨基酸序列，選多肽長(zhǎng)度為9aa，對(duì)MHC Ⅰ類型為HLA-A*02:01(A2)、HLA-A*03:01(A3)、HLA-B*07:02(B7)三類進(jìn)行遠(yuǎn)程預(yù)測(cè),記錄有紅色標(biāo)記的為候選表位序列。(4)應(yīng)用NetCTL軟件預(yù)測(cè)CTL表位，登陸網(wǎng)址(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)，輸入W541 DNA疫苗氨基酸序列，選擇A2、A3、B7三類表型，記錄綜合預(yù)測(cè)值(COMB)≥0.75的9肽為候選CTL表位。(5)應(yīng)用IEDB軟件預(yù)測(cè)CTL表位，登陸網(wǎng)址(http://www.iedb.org/)，輸入W541蛋白氨基酸序列，選多肽長(zhǎng)度為9aa，對(duì)MHC Ⅰ類型為HLA-A*02:01(A2)、HLA-A*03:01(A3)、HLA-B*07:02(B7)三類進(jìn)行遠(yuǎn)程預(yù)測(cè),記錄得分>0.5分的為候選表位序列。綜合分析上述5種軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，將得分均較高的序列選為候選CTL表位。

七、W541蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

應(yīng)用STRING在線軟件(https://www.string-db.org/)預(yù)測(cè)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

八、W541蛋白與人類蛋白的同源性分析

采用EXPASY在線軟件(https://web.expasy.org/blast/)BLAST分析蛋白氨基酸序列與人類蛋白的同源性。

結(jié) 果

一、W541的序列分析

1. W541蛋白的理化性質(zhì)分析：分子式為C3329H5035N923O993S24，原子總數(shù)為10 304個(gè)，由C、H、N、O、S 5種元素組成，相對(duì)分子質(zhì)量為74.64463，理論等電點(diǎn)為6.29。共由704個(gè)氨基酸構(gòu)成(圖1)，該蛋白中帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為48，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為52。計(jì)算出不穩(wěn)定指數(shù)為45.37，而將該蛋白質(zhì)歸類為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脂溶性指數(shù)為68.85，消光系數(shù)為152 095或151 720。親水性總平均值(GRAVY)為-0.294，屬于親水性蛋白質(zhì)(圖2)。

圖1 MTB W541氨基酸的種類、數(shù)目及比例

圖2 MTB W541蛋白的親(疏)水性

2．應(yīng)用TMHMM軟件預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)：結(jié)果顯示該蛋白跨膜螺旋氨基酸數(shù)為7.8724(該指標(biāo)>18提示很有可能為跨膜蛋白)，N端前60個(gè)氨基酸中跨膜氨基酸數(shù)為0.0007，N端位于膜胞質(zhì)側(cè)的總概率為0.05535。綜合分析表明W541蛋白位于膜外，沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)(圖3)。

注 橫坐標(biāo)代表蛋白氨基酸殘基序號(hào)，縱坐標(biāo)的數(shù)值代表每個(gè)氨基酸位于膜內(nèi)側(cè)、膜外側(cè)或跨膜螺旋區(qū)的概率值

二、W541的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

應(yīng)用SOPMA軟件預(yù)測(cè)W541蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果見(jiàn)圖4。該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含α-螺旋(Hh)190個(gè)(占26.99%)，β-折疊(Ee)134個(gè)(占19.03%)，β-轉(zhuǎn)角(Tt)81個(gè)(占11.51%)，無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)299個(gè)(占42.47%)。W541蛋白中α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的總含量為 57.53%，提示該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能較穩(wěn)定。

圖4 MTB W541蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

應(yīng)用SWISS-MODEL服務(wù)器總共構(gòu)建出3個(gè)W541蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型圖，本文選擇模型1(圖5A)，其序列與MTB Ag85C蛋白的一致性為67.01%，可信度范圍為0.32，待測(cè)蛋白與膜蛋白的匹配度區(qū)間為-0.82。應(yīng)用MolProbity(MolProbity version 4.4)對(duì)該三級(jí)結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行評(píng)估(圖5B)，結(jié)果顯示90%以上的氨基酸殘基位于可信區(qū)域內(nèi)，Ramachandran異常值為0.72%，只有一個(gè)氨基酸殘基SER33A出現(xiàn)C-β偏差而位于白色區(qū)域，證明該模型結(jié)構(gòu)較可靠。

注 深綠色代表氨基酸殘基在最大允許區(qū)域，中綠色代表氨基酸殘基在允許區(qū)域，淺綠色代表氨基酸殘基在一般允許區(qū)域，白色為不允許區(qū)域。深綠色與中、淺綠色區(qū)域一致。(A)MTB W541蛋白同源建模的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖；(B)建模評(píng)價(jià)拉曼(Ramachandran)圖

三、 W541蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位注釋

應(yīng)用SignalP和PSORT軟件分析均顯示該蛋白無(wú)信號(hào)肽(圖6)。應(yīng)用PSORT軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，顯示該氨基酸為細(xì)菌膜蛋白質(zhì)。

圖6 MTB W541蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

四、W541蛋白質(zhì)翻譯后的修飾

1.蛋白磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)：應(yīng)用NetPhos 3.1服務(wù)器預(yù)測(cè)出W541蛋白磷酸化位點(diǎn)62個(gè)，其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)35個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)15個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)12個(gè)(圖7)。

圖7 MTB W541蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.蛋白糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)：應(yīng)用NetNGlyc 1.0 服務(wù)器預(yù)測(cè)出W541蛋白可能存在2個(gè)N型糖基化修飾位點(diǎn)，分別位于203和590(圖8)；應(yīng)用NetOGlyc 4.0 服務(wù)器預(yù)測(cè)出W541蛋白可能存在4個(gè) O型糖基化修飾位點(diǎn)，分別位于285、288、297和652位點(diǎn)。

圖8 MTB W541糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

五、 W541蛋白的表位預(yù)測(cè)

1．W541抗原蛋白的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)：通過(guò)IEDB軟件對(duì)W541蛋白的B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，柔韌性越強(qiáng)越有利于抗原與抗體結(jié)合，柔韌性參數(shù)以基線1.0為參照，高于1.0的氨基酸區(qū)段柔韌性強(qiáng)，是易形成抗原表位的區(qū)域，可及性高于基線1.0的區(qū)段易形成B細(xì)胞表位，再通過(guò)結(jié)合線性表位、β轉(zhuǎn)角、抗原性這3個(gè)方面篩選，篩選得出B細(xì)胞表位有4～16、34～42、64～72等23個(gè)(表1)。

表1 IEDB軟件預(yù)測(cè)MTB W541蛋白的B細(xì)胞抗原表位

2.W541的Th細(xì)胞表位：利用SYFPEITHI和RANKPEP在線軟件預(yù)測(cè)，分值較高的Th細(xì)胞抗原表位結(jié)果見(jiàn)表2、3，其中HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401及HLA-DRB1*1501表型的表位數(shù)目較多。結(jié)合HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*01101、表型中分值較高的表位、無(wú)法預(yù)測(cè)的HLA-DRB1*0801表型中的表位及兩種預(yù)測(cè)軟件的結(jié)果綜合分析，判定該蛋白的優(yōu)勢(shì)候選Th表位主要集中在94～108、226～240、304～318等氨基酸區(qū)段。

表2 MTB W541抗原的Th表位

3.W541的CTL細(xì)胞表位：運(yùn)用SYFPEITHI、RANKPEP、NetMHC和IEDB 4種生物信息學(xué)軟件對(duì)W541進(jìn)行預(yù)測(cè)，分值較高的CTL細(xì)胞抗原表位結(jié)果見(jiàn)表4、5。綜合分析得出該蛋白的CTL表位數(shù)量主要集中分布于HLA-A2和HLA-B7限制性T細(xì)胞表位，少部分位于HLA-A3限制性T細(xì)胞表位，推測(cè)其最佳候選CTL表位可能位于MPVGGQSSF(70～78)，AMGDAGGYK(167～175)，KLIANNTRV(199～207)等氨基酸區(qū)段。

表3 MTB W541抗原的候選Th表位

續(xù)表3

表4 MTB W541蛋白的CTL表位

圖9 MTB W541蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

六、W541蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

應(yīng)用STRING服務(wù)器對(duì)W541蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示，W541蛋白的主要組成蛋白fbpA(即Ag85A)和fbpB(即Ag85B)與10個(gè)MTB蛋白rpfC(Rv1884)、Rv1885c(即MtCM)、Rv3668c、aftB、lpqH(即Rv3763、19 kDa脂蛋白)、esxB(即Rv3874、CFP10)、esxA(即Rv3875、ESAT6)、hspX(即Rv2031c、16 kDa抗原)、esxH(即Rv0288、TB10.4)和mpt64(即Rv3036c)均存在相互作用關(guān)系(圖9)。

七、W541蛋白與人類蛋白同源性分析結(jié)果

通過(guò)BLAST分析，發(fā)現(xiàn)W541蛋白的氨基酸序列與人輸卵管相關(guān)蛋白3(tubby-related protein 3)只有3.27%(23/704)的同源性，同源性主要位于第26～92位氨基酸殘基，這段同源性達(dá)到33.82%(23/68)。與人S-甲酰谷胱甘肽水解酶也只有2.70%(19/704)的同源性。由此可見(jiàn)，W541蛋白與人類蛋白的同源性極低。

討 論

近年來(lái)生物信息學(xué)方法的迅猛發(fā)展和互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)的開發(fā)應(yīng)用，為蛋白優(yōu)勢(shì)表位的選擇和表位串聯(lián)疫苗的評(píng)估提供了有效的方法。本研究利用生物信息學(xué)方法分析MTB W541的結(jié)構(gòu)及功能，為W541疫苗的進(jìn)一步優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

信號(hào)肽不僅與蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位有關(guān)，還能決定一個(gè)蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白[6]。而跨膜區(qū)的蛋白質(zhì)有可能是膜偶聯(lián)受體，也可能是膜偶聯(lián)酶及膜離子通道等。本研究預(yù)測(cè)W541蛋白無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)，定位于細(xì)胞質(zhì)膜，提示該蛋白可能為非跨膜、不分泌的細(xì)胞質(zhì)膜蛋白，這與其構(gòu)成的4種抗原單獨(dú)預(yù)測(cè)并不完全一致，目前研究已證實(shí)Ag85A、Ag85B、Rv3407和Rv1733c均未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽[7-9]，但殷月蘭等[8]的預(yù)測(cè)顯示Ag85A和Ag85B兩者均含有一個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，并可通過(guò)其他分泌途徑釋放到菌體外；而de Souza等[7]在MTB H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的培養(yǎng)濾液和細(xì)胞壁中未能檢出Rv3407蛋白；劉靜等[9]報(bào)道Rv1733c也是一個(gè)跨膜蛋白。由此可見(jiàn)，4種蛋白部分抗原表位串聯(lián)后形成的W541融合蛋白的特性已發(fā)生了很大變化。

蛋白質(zhì)磷酸化是一種重要的翻譯后修飾，大多數(shù)蛋白質(zhì)在翻譯結(jié)束后需經(jīng)不同程度的化學(xué)修飾才能成為具有功能的成熟蛋白質(zhì)。在真核生物中，蛋白質(zhì)磷酸化通常發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和組氨酸殘基上。本研究發(fā)現(xiàn)W541蛋白含有62個(gè)磷酸化位點(diǎn)，劉靜等[9]和李小平等[2]預(yù)測(cè)Rv1733c/Rv3407也分別含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，蛋白質(zhì)通過(guò)這種修飾參與激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和環(huán)境應(yīng)激中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)多種生理功能，調(diào)控細(xì)胞過(guò)程，從細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育到細(xì)胞凋亡等[10]。因此，W541可能具有重要的調(diào)控作用。

蛋白質(zhì)糖基化也是一種重要的翻譯后修飾，使蛋白質(zhì)在成熟過(guò)程中折疊成正確構(gòu)象，可增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，而且這些蛋白通常與細(xì)胞信號(hào)的識(shí)別有關(guān)，如受體蛋白等。本研究發(fā)現(xiàn)，W541蛋白含有6個(gè)糖基化位點(diǎn)，也提示它具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能作用，對(duì)于W541蛋白作為疫苗的溶解度、穩(wěn)定性、半衰期和活性等都將具有重要的影響。

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與B細(xì)胞表位關(guān)系密切。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)松散，易于扭曲、盤旋，且暴露于蛋白表面，可與抗體較好的嵌合，常含有B細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)表位[11]。α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)規(guī)則不易變形，常處于蛋白質(zhì)內(nèi)部，與抗體不易結(jié)合，一般不含有B細(xì)胞表位。由于W541蛋白含有較多的Ag85A和Ag85B抗原表位，因此本研究W541蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果與殷月蘭等[8]對(duì)Ag85復(fù)合物預(yù)測(cè)的結(jié)果相似，都含有較大比例的無(wú)規(guī)則卷曲，它們大多位于蛋白分子表面，較可能成為優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位，而能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果顯示，W541蛋白具有Th表位、CTL表位和B細(xì)胞表位，是一個(gè)T細(xì)胞抗原表位占優(yōu)勢(shì)的蛋白抗原，其中許多Th表位和CTL表位均已通過(guò)試驗(yàn)證明，如陳燕等[12]研究證實(shí)GLPVEYLQV和KLIANNTRV抗原肽是MTB Ag85A中2個(gè)主要的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位。殷月蘭等[8]、liang等[13]、李小平等[2]、劉靜等[9]的研究結(jié)果已顯示W(wǎng)541蛋白的主要構(gòu)成抗原Ag85A、Ag85B和Rv3407、Rv1733c蛋白均具有誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答的效能。鄭越[14]也報(bào)道Ag85A、Ag85B DNA疫苗都具有較強(qiáng)的免疫原性，呈Th1型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。T細(xì)胞表位誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗結(jié)核免疫中發(fā)揮關(guān)鍵的作用；B細(xì)胞誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答在抗MTB感染過(guò)程中也發(fā)揮一定的免疫保護(hù)作用，如通過(guò)抗體的中和作用、調(diào)理吞噬作用、激活補(bǔ)體作用、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用等，減少病理?yè)p傷，增強(qiáng)對(duì)MTB的殺傷作用。因此，W541蛋白可能成為理想的免疫原，為疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

本研究對(duì)W541蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，W541的主要組成蛋白Ag85A和Ag85B之間不存在相互作用關(guān)系；與其存在相互作用關(guān)系的10個(gè)MTB蛋白中，大多數(shù)是分泌蛋白，而且文獻(xiàn)報(bào)道中許多蛋白為T細(xì)胞抗原，如早期分泌抗原靶-6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白-10(CFP-10)因能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈細(xì)胞免疫應(yīng)答，成為新型結(jié)核病疫苗的熱門優(yōu)勢(shì)抗原[15]。袁偉[16]將MTB休眠期抗原HspX與Ag85B和ESAT-6聯(lián)合構(gòu)建了能夠在真核細(xì)胞表達(dá)融合蛋白的重組質(zhì)粒pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX，發(fā)現(xiàn)DNA疫苗可在小鼠體內(nèi)刺激產(chǎn)生較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有較強(qiáng)的免疫原性。TB10.4含有CD8 T細(xì)胞表位，在整個(gè)MTB感染過(guò)程中均可誘導(dǎo)特異性CD8 T細(xì)胞應(yīng)答，可招募特異性CD8 T細(xì)胞到感染部位并表達(dá)CD44、TNF-α和IFN-γ，上調(diào)CD8 T細(xì)胞的FasL和LAMP-1/2(CD107A/B)的表達(dá)水平，使這兩種細(xì)胞具有強(qiáng)烈的體內(nèi)細(xì)胞溶解活性[17]。MTB MPT64 DNA疫苗免疫小鼠能誘發(fā)特異的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)小鼠抗MTB感染具有一定的免疫保護(hù)效力。rpfC蛋白[18]是一種復(fù)蘇促進(jìn)因子，作為亞單位疫苗免疫C57BL/6小鼠，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性IgG抗體，刺激T細(xì)胞分泌高水平的Th1型細(xì)胞因子(如IFN-γ和IL-12)和低水平的Th2型細(xì)胞因子(如IL-4和IL-5)，并延長(zhǎng)結(jié)核感染小鼠的存活時(shí)間，降低其肺和脾臟中MTB數(shù)量，證明該蛋白具有一定的免疫保護(hù)作用，可作為候選疫苗組分之一。因此，W541作為疫苗可能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫在抗結(jié)核感染中發(fā)揮重要作用。

W541蛋白與人類蛋白的同源性極低，若作為疫苗免疫后，不會(huì)與人類蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，不會(huì)引起自身免疫性疾病。因此，W541具有較好的安全性。

綜上所述，本研究采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)MTB W541蛋白具有多個(gè)潛在的T、B細(xì)胞抗原表位，其中以T細(xì)胞抗原表位占優(yōu)勢(shì)，作為疫苗的免疫原可能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答，并發(fā)揮重要的調(diào)控作用，可作為候選疫苗進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)價(jià)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)李鵬川：起草文章；梁艷、張林西和吳雪瓊：指導(dǎo)文章撰寫工作、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱