張高博，謝承乾，陳曉敏

（武漢華夏理工學(xué)院，湖北武漢 430223）

野櫻莓，學(xué)名黑果腺肋花楸，薔薇科腺肋花楸屬[1]，其果實(shí)富含蛋白質(zhì)、糖類、有機(jī)酸、微量元素和多酚類物質(zhì)等，其中黃酮、花青素、原花青素、酚酸等多酚類物質(zhì)是其主要的抗氧化成分，對(duì)自由基有很強(qiáng)的清除作用[2]。綠原酸是野櫻莓多酚類物質(zhì)的主要成分[3]，具有抗菌、抗病毒、保肝利膽的功效，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[4]。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)野櫻莓中綠原酸的研究以及綠原酸的測(cè)定方法較少，主要為溶劑提取法、超聲波輔助提取法和超臨界萃取法等，提取方法多集中于優(yōu)化單一提取工藝[5]。本文采用酶-超聲聯(lián)合提取法，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定提取野櫻莓中綠原酸的最佳工藝，摸索野櫻莓中綠原酸含量測(cè)定的方法，為提高野櫻莓的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、擴(kuò)大其應(yīng)用范圍提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

野櫻莓果干（市售，產(chǎn)地為遼寧丹東）；乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、氯化鐵、三水合乙酸鈉、過硫酸鉀，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH粉末、ABTS粉末、TPTZ粉末，合肥巴斯夫生物科技有限公司；綠原酸對(duì)照品（98.5%），上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；β-糖苷水解酶，實(shí)驗(yàn)室自制。

TU-1900紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FA2004N電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-25 pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BILON10-300A超聲波清洗器，上海比朗儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 野櫻莓綠原酸的提取工藝

提取工藝流程：稱取0.12 g β-糖苷酶溶解于80 mL pH 5.0的70%乙醇溶液中，30 ℃條件下活化10 min；加入4 g野櫻莓果干，50 ℃冷凝回流提取60 min，超聲提取25 min，冷卻過濾，濾液定容至250 mL，即得綠原酸提取液。

1.2.2 野櫻莓綠原酸含量測(cè)定

（1）最大吸收峰確定

取一定量綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用紫外可見分光光度計(jì)在200～600 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)。

（2）綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，70%乙醇定容至10 mL作為母液，倍比稀釋。在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度（A）值，以綠原酸濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）綠原酸含量測(cè)定

取一定量粗提液，倍比稀釋，使其吸光度在0.2～0.8。在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求出提取液中的綠原酸質(zhì)量濃度（mg/mL）。

（4）綠原酸提取率計(jì)算

綠原酸提取率按公式（1）計(jì)算。

式中：V為提取液定容體積，mL；C為綠原酸濃度，mg/mL；D為提取液稀釋倍數(shù)；M為野櫻莓果實(shí)質(zhì)量，g。

1.2.3 野櫻莓綠原酸抗氧化活性測(cè)定

（1）ABTS自由基清除能力

取100 μL綠原酸提取液和100 μL無水乙醇分別與3.9 mL ABTS試劑混合，避光反應(yīng)10 min，測(cè)定混合液在734 nm處的吸光值，分別記為A1和A2。按照式（2）計(jì)算自由基清除率。

（2）DPPH自由基清除能力

將2 mL綠原酸提取液和2 mL DPPH試劑混合，2 mL綠原酸提取液和2 mL蒸餾水混合，2 mL蒸餾水和2 mL DPPH試劑混合，避光反應(yīng)30 min，測(cè)定在517 nm處的吸光值，分別記為A3、A4和A5。按照式（3）計(jì)算自由基清除率。

（3）FRAP自由基清除能力

使用濃度0.1～0.8 mmol/L的硫酸亞鐵溶液代替野櫻莓綠原酸試樣繪制FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為y=2.941 7x+0.124 3，R2=0.999 7。

取野櫻莓綠原酸提取液100 μL于試管中，加入FRAP試劑2.4 mL，測(cè)定在593 nm處的吸光值，根據(jù)FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求出所提取綠原酸的FRAP值。

（4）計(jì)算綜合抗氧化活性

將ABTS、DPPH、FRAP 3種抗氧化性檢測(cè)所得結(jié)果取平均值，即為該綠原酸提取液的綜合抗氧化活性。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取4 g野櫻莓果干，用酶-超聲聯(lián)合提取法提取綠原酸，通過改變?nèi)軇﹑H（3～7）、溶劑體積分?jǐn)?shù)（50%～90%）、料液比（1∶10～1∶50，g∶mL）、酶的用量（1%～5%）、冷凝回流時(shí)間（40～80 min）、提取溫度（50～90 ℃）和超聲提取時(shí)間（5～45 min）7個(gè)影響因素，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定綠原酸提取率和抗氧化活性。每組單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，取其平均值。以綠原酸的提取率和抗氧化活性為指標(biāo)，確定各因素的最適范圍，優(yōu)化提取工藝參數(shù)，并分析各因素對(duì)綠原酸提取率和抗氧化活性的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)

以野櫻莓中綠原酸提取率和抗氧化活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出提取溫度、溶劑體積分?jǐn)?shù)、冷凝回流時(shí)間3個(gè)主要因素，每個(gè)主要因素設(shè)置3個(gè)水平，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)。設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)各因素水平范圍見表1，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸含量測(cè)定

通過綠原酸光譜掃描曲線可以確定綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)為332 nm（圖1a）。綠原酸在0.004～0.024 mg/mL與其吸光度值具有良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=39.136x-0.017 7，R2=0.999 8（圖1b）。

圖1 綠原酸含量測(cè)定

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)（圖2B）、冷凝回流時(shí)間（圖2E）、提取溫度（圖2F）對(duì)綠原酸提取率和抗氧化活性的影響較大。這3項(xiàng)單因素的改變均能夠在較大程度上提高綠原酸提取率和自由基清除率，且綠原酸提取率維持在較高水平。其中，通過乙醇體積分?jǐn)?shù)的改變，綠原酸提取率從0.091 8%提高到0.199 4%；通過冷凝回流時(shí)間的改變，綠原酸提取率從0.116 8%提高到0.270 4%；通過提取溫度的改變，綠原酸提取率從0.206 2%提高到0.956 4%。溶劑pH（圖2A）、料液比（圖2C）、酶的用量（圖2D）對(duì)綠原酸提取率和自由基清除率的影響較小，曲線波動(dòng)較為平緩；而超聲提取時(shí)間（圖2G）雖對(duì)綠原酸提取率有較為明顯的影響，但提取率卻始終處于一個(gè)較低的范圍，且自由基清除率基本不受超聲提取時(shí)間的影響，維持在一定的值，故不將這4項(xiàng)因素納入正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖2 各因素對(duì)綠原酸提取率和抗氧化活性的影響

2.3 正交試驗(yàn)

提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、冷凝回流時(shí)間為影響因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以綠原酸提取率和綜合抗氧化活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，每組正交試驗(yàn)平行進(jìn)行3次，取平均值。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，通過極差R大小確定影響綠原酸提取率的因素主次順序?yàn)樘崛囟龋纠淠亓鲿r(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)；根據(jù)K值可知，最佳提取工藝為提取溫度80 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、冷凝回流時(shí)間90 min。進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，測(cè)得綠原酸平均提取率為1.382 4%，可確定此工藝為最優(yōu)提取工藝，且重復(fù)性好。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在超聲提取前使用65%乙醇在80 ℃下冷凝回流90 min可顯著促進(jìn)野櫻莓內(nèi)有效物質(zhì)溶出，之后進(jìn)行酶-超聲聯(lián)合提取能夠有效提高野櫻莓果實(shí)中綠原酸的提取率，為野櫻莓中綠原酸提取工藝的進(jìn)一步開發(fā)與完善奠定了基礎(chǔ)。