張高博，謝承乾，陳曉敏

（武漢華夏理工學院，湖北武漢 430223）

野櫻莓，學名黑果腺肋花楸，薔薇科腺肋花楸屬[1]，其果實富含蛋白質(zhì)、糖類、有機酸、微量元素和多酚類物質(zhì)等，其中黃酮、花青素、原花青素、酚酸等多酚類物質(zhì)是其主要的抗氧化成分，對自由基有很強的清除作用[2]。綠原酸是野櫻莓多酚類物質(zhì)的主要成分[3]，具有抗菌、抗病毒、保肝利膽的功效，在醫(yī)藥、食品等領域得到了廣泛的應用[4]。目前，國內(nèi)有關野櫻莓中綠原酸的研究以及綠原酸的測定方法較少，主要為溶劑提取法、超聲波輔助提取法和超臨界萃取法等，提取方法多集中于優(yōu)化單一提取工藝[5]。本文采用酶-超聲聯(lián)合提取法，通過單因素實驗和正交試驗確定提取野櫻莓中綠原酸的最佳工藝，摸索野櫻莓中綠原酸含量測定的方法，為提高野櫻莓的經(jīng)濟價值、擴大其應用范圍提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

野櫻莓果干（市售，產(chǎn)地為遼寧丹東）；乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、氯化鐵、三水合乙酸鈉、過硫酸鉀，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；DPPH粉末、ABTS粉末、TPTZ粉末，合肥巴斯夫生物科技有限公司；綠原酸對照品（98.5%），上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；β-糖苷水解酶，實驗室自制。

TU-1900紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；FA2004N電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司；PHS-25 pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；BILON10-300A超聲波清洗器，上海比朗儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 野櫻莓綠原酸的提取工藝

提取工藝流程：稱取0.12 g β-糖苷酶溶解于80 mL pH 5.0的70%乙醇溶液中，30 ℃條件下活化10 min；加入4 g野櫻莓果干，50 ℃冷凝回流提取60 min，超聲提取25 min，冷卻過濾，濾液定容至250 mL，即得綠原酸提取液。

1.2.2 野櫻莓綠原酸含量測定

（1）最大吸收峰確定

取一定量綠原酸標準品溶液，采用紫外可見分光光度計在200～600 nm進行全波長掃描，確定綠原酸的最大吸收波長。

（2）綠原酸標準曲線繪制

稱取綠原酸標準品5 mg，70%乙醇定容至10 mL作為母液，倍比稀釋。在最大吸收波長處測定不同濃度標準品的吸光度（A）值，以綠原酸濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

（3）綠原酸含量測定

取一定量粗提液，倍比稀釋，使其吸光度在0.2～0.8。在最大吸收波長處測定樣品吸光度，根據(jù)標準曲線的回歸方程求出提取液中的綠原酸質(zhì)量濃度（mg/mL）。

（4）綠原酸提取率計算

綠原酸提取率按公式（1）計算。

式中：V為提取液定容體積，mL；C為綠原酸濃度，mg/mL；D為提取液稀釋倍數(shù)；M為野櫻莓果實質(zhì)量，g。

1.2.3 野櫻莓綠原酸抗氧化活性測定

（1）ABTS自由基清除能力

取100 μL綠原酸提取液和100 μL無水乙醇分別與3.9 mL ABTS試劑混合，避光反應10 min，測定混合液在734 nm處的吸光值，分別記為A1和A2。按照式（2）計算自由基清除率。

（2）DPPH自由基清除能力

將2 mL綠原酸提取液和2 mL DPPH試劑混合，2 mL綠原酸提取液和2 mL蒸餾水混合，2 mL蒸餾水和2 mL DPPH試劑混合，避光反應30 min，測定在517 nm處的吸光值，分別記為A3、A4和A5。按照式（3）計算自由基清除率。

（3）FRAP自由基清除能力

使用濃度0.1～0.8 mmol/L的硫酸亞鐵溶液代替野櫻莓綠原酸試樣繪制FRAP標準曲線。線性回歸方程為y=2.941 7x+0.124 3，R2=0.999 7。

取野櫻莓綠原酸提取液100 μL于試管中，加入FRAP試劑2.4 mL，測定在593 nm處的吸光值，根據(jù)FRAP標準曲線的回歸方程求出所提取綠原酸的FRAP值。

（4）計算綜合抗氧化活性

將ABTS、DPPH、FRAP 3種抗氧化性檢測所得結(jié)果取平均值，即為該綠原酸提取液的綜合抗氧化活性。

1.2.4 單因素試驗設計

稱取4 g野櫻莓果干，用酶-超聲聯(lián)合提取法提取綠原酸，通過改變?nèi)軇﹑H（3～7）、溶劑體積分數(shù)（50%～90%）、料液比（1∶10～1∶50，g∶mL）、酶的用量（1%～5%）、冷凝回流時間（40～80 min）、提取溫度（50～90 ℃）和超聲提取時間（5～45 min）7個影響因素，進行單因素實驗，并測定綠原酸提取率和抗氧化活性。每組單因素實驗進行3組平行實驗，取其平均值。以綠原酸的提取率和抗氧化活性為指標，確定各因素的最適范圍，優(yōu)化提取工藝參數(shù)，并分析各因素對綠原酸提取率和抗氧化活性的影響。

1.2.5 正交試驗

以野櫻莓中綠原酸提取率和抗氧化活性為評價指標，依據(jù)單因素實驗結(jié)果，篩選出提取溫度、溶劑體積分數(shù)、冷凝回流時間3個主要因素，每個主要因素設置3個水平，設計3因素3水平正交試驗。設計的正交試驗各因素水平范圍見表1，采用L9(34)正交表進行正交試驗。

表1 正交試驗因素及水平設計表

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸含量測定

通過綠原酸光譜掃描曲線可以確定綠原酸的最大吸收波長為332 nm（圖1a）。綠原酸在0.004～0.024 mg/mL與其吸光度值具有良好的線性關系，其線性回歸方程為y=39.136x-0.017 7，R2=0.999 8（圖1b）。

圖1 綠原酸含量測定

2.2 單因素實驗

單因素實驗表明，乙醇體積分數(shù)（圖2B）、冷凝回流時間（圖2E）、提取溫度（圖2F）對綠原酸提取率和抗氧化活性的影響較大。這3項單因素的改變均能夠在較大程度上提高綠原酸提取率和自由基清除率，且綠原酸提取率維持在較高水平。其中，通過乙醇體積分數(shù)的改變，綠原酸提取率從0.091 8%提高到0.199 4%；通過冷凝回流時間的改變，綠原酸提取率從0.116 8%提高到0.270 4%；通過提取溫度的改變，綠原酸提取率從0.206 2%提高到0.956 4%。溶劑pH（圖2A）、料液比（圖2C）、酶的用量（圖2D）對綠原酸提取率和自由基清除率的影響較小，曲線波動較為平緩；而超聲提取時間（圖2G）雖對綠原酸提取率有較為明顯的影響，但提取率卻始終處于一個較低的范圍，且自由基清除率基本不受超聲提取時間的影響，維持在一定的值，故不將這4項因素納入正交實驗設計。

圖2 各因素對綠原酸提取率和抗氧化活性的影響

2.3 正交試驗

提取溫度、乙醇體積分數(shù)、冷凝回流時間為影響因素設計正交試驗，以綠原酸提取率和綜合抗氧化活性為評價指標，每組正交試驗平行進行3次，取平均值。正交試驗結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，通過極差R大小確定影響綠原酸提取率的因素主次順序為提取溫度＞冷凝回流時間＞乙醇體積分數(shù)；根據(jù)K值可知，最佳提取工藝為提取溫度80 ℃、乙醇體積分數(shù)65%、冷凝回流時間90 min。進行3次驗證性實驗，測得綠原酸平均提取率為1.382 4%，可確定此工藝為最優(yōu)提取工藝，且重復性好。

表2 正交試驗設計及結(jié)果

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在超聲提取前使用65%乙醇在80 ℃下冷凝回流90 min可顯著促進野櫻莓內(nèi)有效物質(zhì)溶出，之后進行酶-超聲聯(lián)合提取能夠有效提高野櫻莓果實中綠原酸的提取率，為野櫻莓中綠原酸提取工藝的進一步開發(fā)與完善奠定了基礎。