王曉燕 張亞楠 韓晶 李洋 王萌萌 王琳

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 1針灸推拿學(xué)院，山東 濟南 250355；2中醫(yī)學(xué)院；3附屬醫(yī)院針灸科；4教務(wù)處)

Effects of electroacupuncture at different acupoints on 5-HT3R and 5-HT4R in functional diarrhea model rats

WANG Xiao-Yan, ZHANG Ya-Nan, HAN Jing,etal.

College of Acu-moxibustion and Massage of TCM of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong, China

【Abstract】ObjectiveTo observe the expression of 5-hydroxytryptamine 3 receptor (5-HT3R) and 5-hydroxytryptamine 4 receptor(5-HT4R) mRNA in hypothalamus, spinal cord, stomach and intestine of model rats with functional diarrhea (FDr), to explore the mechanism of electroacupuncture in treating FDr, and to analyze the correlation of acupoints.Methods48 male SD rats were randomly divided into normal group, model group, Zusanli group, Yinlingquan group, Yingu group, non-meridian and non-acupoint group, with 8 rats in each group. FDr models were prepared by comprehensive method such as binding, cold stimulation and dietary disorders for 14 consecutive days. After successful replication of the model, Zusanli group, Yinling quan group and Yingu group,non-meridian and non-acupoint group were given electroacpuncture intervention, 20 minutes each time, once a day, for 7 days. The gastric residual rate and intestinal propulsion rate were measured in rats, and the expression of 5-HT3R and 5-HT4R mRNA in hypothalamus, spinal cord, stomach and intestine were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.ResultsCompared with normal group, the gastrivc residual rate and intestinal propulsion rate were significantly increased after modeling(P<0.05). In model group, the expression of 5-HT3R mRNA in hypothalamus, spinal cord,stomach and intestine were significantly increased, while the expression of 5-HT4R mRNA were significantly decreased(P<0.05).After electroacpuncture, the residual rate in Zusanli group and Yinlingquan group were significantly lower than those in model group(P<0.05). Compared with model group, the expression of 5-HT3R mRNA in hypothalamus, spinal cord,stomach and intestine were significantly decreased, while the expression of 5-HT4R mRNA in hypothalamus, spinal cord,stomach and intestine were significantly increased in Zusanli group and Yilingquan group(P<0.05). Compared with model group, the intestinal propulsion rate and 5-HT4R mRNA expression in the colon were significantly increased in Zusanli group(P<0.05). Compared with Yingu group, non-meridian and non-acupoint group, the gastric residual rate and intestinal propulsion rate of Zusanli group were significantly reduced(P<0.05). In Zusanli group, the expression of 5-HT3R mRNA in hypothalamus, spinal cord, stomach and intestine were significantly decreased, while the expression of 5-HT4R mRNA were significantly increased(P<0.05).ConclusionsElectroacpuncture at Zusanli point and Yinlingquan point has an overall regulation effect on FDr by influencing 5-HT3R and 5-HT4R mRNA expression, suggesting that there is a specific relationship between meridian points and viscera.

【Keywords】 Functional diarrhea (FDr); Zusanli point; Yinlingquan point; 5-hydroxytryptamine 3 receptor(5-HT3R); 5-hydroxytryptamine 4 receptor(5-HT4R)

功能性腹瀉(FDr)臨床表現(xiàn)以腹瀉為主，且不伴有明顯的腹部疼痛或脹滿不適，25%以上的排便為松散樣或水樣，系統(tǒng)檢查未見器質(zhì)性病變〔1〕。有研究表明FDr的發(fā)病機制與腦-腸軸功能障礙有關(guān)〔2〕，腦-腸軸調(diào)控路徑的改變是該病發(fā)病的關(guān)鍵，而5-羥色胺(HT)及其受體是腦-腸軸調(diào)控路徑中的重要組成部分〔3，4〕。前期研究結(jié)果顯示〔5，6〕，電針足三里穴可以影響胃腸功能紊亂大鼠胃、腸、腦組織5-HT含量及表達，以改善腹瀉等癥狀。本實驗擬通過觀察FDr模型大鼠的下丘腦、脊髓、胃竇、結(jié)腸中5-羥色胺3受體(HT3R)、5-羥色胺4受體(HT4R)mRNA表達，分析電針治療FDr的作用機制，并探討經(jīng)穴臟腑相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1動物與分組 健康雄性SD大鼠，12周齡，48只，體重(180±10)g，由山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供〔許可證號為：SCXK(魯)2014 0007〕。大鼠飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心(清潔級)，自由進食與飲水。室內(nèi)空氣流通和自然晝夜光線，溫度約24℃，相對濕度約60%。本次實驗過程中對大鼠的各種處理均遵循中華人民共和國科技部于2006年頒布的有關(guān)動物的使用及倫理學(xué)規(guī)定。將大鼠隨機分為正常組、模型組、足三里組、陰陵泉組、陰谷組、非經(jīng)非穴組各8只。

1.2主要儀器和試劑 5-HT3R抗體、5-HT4R抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，PCR引物(武漢谷歌生物科技有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)，DNA聚合酶、RNA提取試劑盒TRIzol Reagent(Invitrogen，美國)。

HANS-200型電針治療儀(南京濟生醫(yī)療科技有限公司)，XSP-C204型顯微鏡(CIC，美國)，醫(yī)學(xué)圖像處理系統(tǒng)(IPP，美國)，KZ-Ⅱ型勻漿儀(武漢康濤科技有限公司)，D3024R型臺式高速冷凍型離心機(DragonLab，中國)，Stepone plus型熒光定量PCR儀(Applied biosystems，美國)，華佗牌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.3模型制備 采用束縛、冷刺激、飲食失節(jié)等綜合方法制備FDr模型。每天上午9點開始，將大鼠置于特制的木質(zhì)小板凳，以粗制棉繩束縛其前肢和前臂，使冷凍后的棒棒冰置于其腹部，持續(xù)1 h并密切觀察大鼠的生命狀態(tài)；隔日喂食，連續(xù)14 d。當大鼠出現(xiàn)神態(tài)倦怠、扎堆或蟄伏在角落，納呆、消瘦、少動、四肢無力、毛發(fā)枯澀、大便稀軟等癥狀，可判斷模型制作成功〔7〕。正常組不予任何刺激，正常喂養(yǎng)。

1.4干預(yù)方法 足三里組、陰陵泉組、陰谷組，非經(jīng)非穴組于FDr模型復(fù)制成功后給予電針干預(yù)。參照文獻〔8〕，取雙側(cè)足三里穴、陰陵泉穴、陰谷穴；非經(jīng)非穴選取足三里穴外側(cè)旁開1 cm〔9〕。操作：將大鼠固定，用0.30 mm×25 mm毫針分別直刺上述穴位，雙側(cè)連接韓氏疼痛治療儀，連續(xù)波，頻率2 Hz，強度0.5 mA，以大鼠肢體微微顫動為度，留針20 min；同時將正常組、模型組的大鼠固定20 min，固定方式同其他四組，不予針刺。上述操作1次/d，共7 d。

1.5觀察指標與檢測方法 胃內(nèi)殘留率和小腸推進率的測定：干預(yù)7 d后，各組大鼠禁食不禁水24 h，將由羧甲基纖維素鈉、活性炭末、奶粉等配制好的黑色半固體糊〔10〕以1 ml/100 g的劑量進行灌胃。30 min后腹腔注射4%水合氯醛麻醉。打開腹腔，分離腸胃。結(jié)扎胃賁門和幽門，取胃，用濾紙吸干后稱全重(M1)，然后沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物后吸干稱重(M2)。胃內(nèi)殘留率(%)=〔(M1-M2)/黑色半固體糊的重量〕×100%。同時迅速取出小腸，用直尺測量幽門至回盲腸部全長(L1)及幽門至黑色半固體糊前沿的距離(L2)。小腸推進率(%)= L2/L1×100%。

實時熒光定量(RT)-PCR技術(shù)檢測FDr大鼠模型的下丘腦、脊髓、胃竇、結(jié)腸中5-HT3R、5-HT4R mRNA表達：取凍存于-80℃冰箱中的大鼠下丘腦、脊髓、胃竇和結(jié)腸組織，分別研磨離心，采用Trizol法提取總RNA，取2.5 μl RNA樣本，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA；RT-PCR儀進行基因表達量的檢測，以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析。逆轉(zhuǎn)率條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。擴增條件：95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)。引物序列：5-HT3R：上游：5′-GTGACCGCCTGTAGCCTTGA-3′，下游：5′-TCGCCACAGGGAAATGTTGAT-3′，擴增長度114 bp；5-HT4R：上游：5′-CCATAATGCAAGGCTGGAACA-3′，下游：5′-AGGAGAAACGGGATGTAGAAGG-3′，擴增長度154 bp；GAPDH：上游：5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′，下游：5′-CATGAGGTCCACCACCCTGTT-3′,擴增長度281 bp。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進行方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1電針對FDr大鼠胃內(nèi)殘留率、小腸推進率的影響 模型組胃內(nèi)殘留率、小腸推進率較正常組明顯升高(P<0.05)，電針足三里穴后，胃內(nèi)殘留率及小腸推進率均有降低，足三里組與模型組、陰谷組、非經(jīng)非穴組比較有顯著差異(P<0.05)；陰陵泉組胃內(nèi)殘留率較模型組、陰谷組、非經(jīng)非穴組顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 電針對FDr大鼠胃內(nèi)殘留率、小腸推進率的影響

2.2電針對FDr大鼠各組織中5-HT3R mRNA表達的影響 模型組胃、腸及下丘腦、脊髓中5-HT3R mRNA表達均明顯高于正常組(P<0.05)；與模型組、陰谷組、非經(jīng)非穴組，足三里組胃、腸及下丘腦、脊髓中5-HT3R mRNA的表達明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，陰陵泉組胃、腸及下丘腦、脊髓(T5-10)中5-HT3R mRNA表達顯著降低(P<0.05)。實驗表明電針刺激足三里穴、陰陵泉穴可以明顯降低FDr大鼠各組織中5-HT3R mRNA的表達(P<0.05)，而足三里組的下丘腦中5-HT3R mRNA的表達顯著低于陰陵泉組，所以足三里穴的影響大于陰陵泉穴。見表2。

2.3電針對FDr大鼠下丘腦及各組織中5-HT4R mRNA表達的影響 模型組胃、腸及下丘腦、脊髓中5-HT4R mRNA表達均明顯低于正常組(P<0.05)；與模型組比較，足三里組、陰陵泉組的胃、腸及下丘腦、脊髓中5-HT4R mRNA表達均明顯升高(P<0.05)；與陰谷組、非經(jīng)非穴組相比較，足三里組、陰陵泉組胃、腸及下丘腦、脊髓中5-HT4R mRNA表達均明顯升高(P<0.05),實驗表明電針刺激足三里穴、陰陵泉穴可以明顯升高FDr大鼠各組織5-HT4R mRNA的表達，足三里穴優(yōu)于陰陵泉穴。見表2。

3 討 論

FDr是以腹瀉為主要癥狀的一種胃腸功能疾病，屬中醫(yī)學(xué)“泄瀉”的范疇?！毒霸廊珪分刑峒啊靶篂a之本，無不由于脾胃”。脾胃為氣機升降的樞紐，脾主升清、胃主降濁，升降失常則生本病。正如“清氣在下，則生飧泄”(《素問·陰陽應(yīng)象大論》)。足三里穴、陰陵泉穴分別為足陽明胃經(jīng)、足太陰脾經(jīng)的合穴，主“逆氣而泄”，足三里又是胃的下合穴，《靈樞·五邪》篇中有“邪在脾胃，皆調(diào)于三里”，《靈樞·四時氣第十九》也有：“飧泄，補三陰之上，補陰陵泉，皆久留之，熱行乃止”。蘇志維等〔9〕統(tǒng)計分析后認為，足三里穴和陰陵泉穴都是國內(nèi)現(xiàn)代針刺治療FDr的常用穴，足三里穴的使用頻次明顯高于陰陵泉穴。本研究表明電針足三里穴和陰陵泉穴均可明顯降低胃內(nèi)殘余率，電針足三里穴還顯著降低了小腸推進率，這均是反應(yīng)胃腸動力的重要參數(shù)〔10，11〕，因此足三里和陰陵泉穴都可以改善胃腸動力，減輕腹瀉，而但二穴對其癥狀改善的程度不同，“足三里”穴的治療效果優(yōu)于“陰陵泉”穴。其作用機制可能是由于足三里穴既是足陽明胃經(jīng)的合穴，又是胃之下合穴；《靈樞·邪氣臟府病形》也明確指出“合治內(nèi)腑”，所以足三里穴的療效優(yōu)于陰陵泉穴。

胃腸功能的神經(jīng)調(diào)節(jié)主要依賴中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)和腸道神經(jīng)系統(tǒng)，5-HT是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，不僅分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而且還在外周神經(jīng)系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)胃腸動力與胃腸感覺，其受體廣泛布于胃腸道平滑肌、腸神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)〔12〕，5-HT及其受體主要通過參與胃腸蠕動和分泌的調(diào)節(jié)，影響胃腸動力和內(nèi)臟敏感性〔13〕。其亞型受體中，5-HT3R、5-HT4R與胃腸運動及感覺關(guān)系較為密切，在胃腸功能方面的研究也較為廣泛〔14〕。Terry〔15〕，Gary〔16〕研究顯示5-HT3R可激活內(nèi)源性和外源性傳入神經(jīng)，也可刺激少量興奮性突觸后電位，引起疼痛；5-HT4R能刺激突觸前的神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿來增強胃腸道蠕動，促進胃腸動力。本實驗結(jié)果表明5-HT3R mRNA的表達下降與5-HT4R mRNA的表達升高有助于調(diào)節(jié)胃腸動力，促進胃腸正常運動。前期研究〔6〕已證實電針足三里穴可以從整體上顯著降低不同水平部位各組織中5-HT含量，本研究進一步證明電針足三里穴能從整體上明顯降低不同水平部位各組織中5-HT3R mRNA表達，顯著升高相應(yīng)各組織中5-HT4R mRNA表達。也就是說，針刺足三里穴不僅可以影響分布于胃腸部位的周圍神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT3R、5-HT4R mRNA表達，還可以影響腦、脊髓等部位的表達，以改善胃腸功能以治療FDr，符合中醫(yī)的“整體觀念”理論，這也協(xié)助進一步闡釋了電針足三里穴對FDr的作用機制。