左立康，黃 榮，羅 康，王同浩，董洪圣，王長法，馬青山

(聊城大學 農(nóng)學院、山東省黑毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)工程技術研究中心、山東省驢產(chǎn)業(yè)科技協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 聊城 252059)

0 引言

目前，我國畜牧業(yè)正處于“飼料禁抗”的關鍵時刻，對“替抗”、“減抗”相關技術和產(chǎn)品具有旺盛的需求。益生菌因其能夠促進動物生長、提高飼料利用率[1]，調(diào)節(jié)動物腸道菌群和免疫機能[2]，預防腹瀉發(fā)生[3，4]，且具有綠色、安全等方面特點，被認為是畜禽飼料中極具潛力的促生長抗生素替代品。養(yǎng)殖中常用的益生菌菌種包括乳酸細菌、芽孢桿菌和酵母菌類等，其中以乳酸細菌為主。然而，實驗室篩得的菌種在養(yǎng)殖試驗驗證過程中，其功能往往不能較好的重現(xiàn)，這主要是由于實驗室篩選益生菌的條件或許同其應用的環(huán)境有所區(qū)別，從而使益生菌應用后在靶位點難以生長、定植及發(fā)揮功能[5]，因此，篩選來自同源動物的腸道土著益生菌種就顯得尤為重要。

驢產(chǎn)業(yè)是我國的特色畜牧業(yè)，也是關鍵的扶貧民生產(chǎn)業(yè)，然而，在集約化養(yǎng)殖模式下腹瀉是影響犢驢駒成活率的主要因素之一，也已成為驢養(yǎng)殖業(yè)中的一大難點[6]。應用抗生素僅對大腸桿菌引起的腹瀉有治療效果但對應激源等因素引發(fā)的腹瀉效果不佳，且存在產(chǎn)生耐藥菌及二次感染的風險[7]，通過應用益生菌制劑，尤其是乳酸菌制劑能夠減少應用抗生素帶來的負面影響[8-10]，但源自驢腸道的益生菌菌種資源還較為匱乏，制約了驢用益生菌制劑的開發(fā)和應用。因此，本研究基于原位/宿主益生菌策略(Autochthonous/Host-associated probiotic)從健康驢腸道中篩選乳酸細菌，并對其生物特性進行研究，為開發(fā)驢用微生態(tài)制劑提供候選菌種資源。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及供試菌株

試驗樣品來自山東省德州市禹城惠民驢場2歲德州驢直腸內(nèi)容物。試驗選用的指示菌株由聊城大學農(nóng)學院分離并保存，2種供試菌株為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。

1.2 主要培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉粉8 g，葡萄糖20 g，酵母粉4 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.2 g，檸檬酸氫二銨2 g，硫酸錳0.04 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌30 min；

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎上加入2%的瓊脂，121 ℃滅菌30 min。

水解淀粉酶培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基1000 mL，可溶性淀粉2 g，瓊脂20 g。

Tween-80培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g，酵母膏0.5 g，CaCl20.01 g，NaCl 0.5 g，Tween-80 1.0 g，瓊脂1.5～2.5 g。

1.3 乳酸菌的分離與純化及形態(tài)觀察

取1 g驢腸道內(nèi)容物樣品于離心管中，加入9 mL無菌蒸餾水，振蕩搖勻。10倍稀釋，稀釋梯度為10-1～10-8。取不同稀釋度稀釋液100 μL均勻涂布于MRS平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取表面光滑、菌落凸起、四周平整、乳白色、菌落直徑1.0～1.5 mm的單菌落，分區(qū)劃線接種于MRS平板上。純化3代，獲得菌種加入30%甘油，-80 ℃冰箱保存。

挑取純化培養(yǎng)24 h的單菌落涂片，革蘭氏染色觀察細菌形態(tài)特征，根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》選取革蘭染色為陽性、形態(tài)為桿狀或者球狀的菌株進行后續(xù)研究。

1.4 乳酸菌的分子生物學鑒定及安全性分析

純化的菌種采用正向引物P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物P2：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海立菲生物技術有限公司(北京)合成，進行16S rDNA擴增。PCR反應體系：2× PCR mix 30 μL，引物各2.5 μL，菌液2 μL，ddH2O 23 μL。PCR程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，PCR擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠(含有萬分之一濃度的SYBR?Green I)上電泳30 min，紫外燈下觀察，確定產(chǎn)物PCR成功并達到要求后，將PCR產(chǎn)物送交上海立菲生物技術有限公司(北京)進行序列測定。測序結(jié)果在NCBI中進行同源性分析。

將受試菌點接于哥倫比亞兔血瓊脂平板(青島，海博生物)，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，觀察是否有溶血圈以及溶血圈類別。

1.5 乳酸菌生長曲線與產(chǎn)酸能力測定

生長曲線測定：將菌液在MRS液體培養(yǎng)基中按1%比例接種，37 ℃培養(yǎng)，每2 h取樣一次，分光光度計測其OD600值，繪制生長曲線。

產(chǎn)酸能力測定：將菌液在MRS肉湯中按1%比例接種，37 ℃培養(yǎng)，每6 h取樣一次，通過pH儀測其pH值，繪制菌株產(chǎn)酸曲線。

1.6 乳酸菌的產(chǎn)酶能力分析

產(chǎn)淀粉酶試驗：將受試菌接種于水解淀粉酶培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。滴加碘液，顯色，為防止光分解，5 min內(nèi)觀察。

脂肪酶試驗：將受試菌接種于Tween-80培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)，室溫再培養(yǎng)1～2天。觀察是否有沉淀圈。

1.7 乳酸菌的耐受性研究

耐酸性試驗：利用0.5 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基pH值，分別為2、3、4、5、6、7、8、9，121 ℃滅菌30 min后，按1%比例接入待測乳酸菌種子液，設置3個重復。37 ℃培養(yǎng)24 h，分光光度計測其OD600值。

耐膽鹽性試驗：配制含豬膽鹽的質(zhì)量分數(shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%的MRS液體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min后，按1%比例接入待測乳酸菌種子液，設置3個重復。37 ℃培養(yǎng)24 h，分光光度計測其OD600值。

1.8 乳酸菌的抑菌性試驗

以實驗室保藏的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，采用國標濾紙片法進行乳酸菌的抑菌試驗[11]。指示菌為經(jīng)過37 ℃培養(yǎng)過夜培養(yǎng)，與生理鹽水 1∶9稀釋，渦旋器混勻后涂布LB平板，加入載有待測乳酸菌的濾紙片。37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察指示菌生長情況，游標卡尺測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果

分離菌株在MRS平板上37 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落呈不透明灰白色、表面光滑凸起、邊緣整齊、直徑1 mm左右大小的圓形(圖1)。革蘭氏染色陽性，顯微鏡鏡檢觀察菌株HR-03為圓形或橢圓形(圖2)。

圖1 菌株HR-03在MRS平板上的菌落形態(tài)

圖2 菌株HR-03革蘭氏染色結(jié)果

2.2 分子生物學鑒定結(jié)果

測序結(jié)果在NCBI Blast網(wǎng)站上進行同源性比較，菌株HR-03同屎腸球菌同源性高于99%，結(jié)合進化樹分析可知(圖3)，菌株HR-03鑒定為屎腸球菌。

圖3 通過16SrDNA核酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

2.3 分離菌的安全性試驗

如圖4所示，點接分離的四株受試菌于兔血瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，無溶血圈，菌株具有較好的安全性。

圖4 分離菌在兔血瓊脂平板上產(chǎn)生溶血圈情況

2.4 生長特性和產(chǎn)酸能力試驗結(jié)果

如圖5、6所示，屎腸球菌HR-03在0～6 h迅速生長，6 h后進入對數(shù)生長期，pH值迅速下降；12 h后進入生長平緩期，pH值也逐步趨于穩(wěn)定，最終菌珠HR-03發(fā)酵上清液pH值為4.57。

圖5 菌株HR-03的生長曲線

2.5 乳酸菌的產(chǎn)酶能力分析

將受試菌分別接種于水解淀粉培養(yǎng)基和Tween-80培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，未觀察到透明圈和沉淀圈，菌株HR-03無產(chǎn)淀粉酶和脂肪酶能力。

圖6 菌株HR-03的產(chǎn)酸曲線

2.6 乳酸菌的耐受性研究

2.6.1 耐酸性。由圖7可知，菌株HR-03在pH值為2～9的MRS肉湯中均能存活，其中在pH 6～7之間OD600值最高，表明屎腸球菌HR-03最適生長pH值為6～7。在pH值為2～5之間菌株HR-03的OD600值隨著pH值的降低而明顯下降，表明酸性環(huán)境對菌株HR-03的生長有抑制作用，但仍有細菌生長。由此可見，菌株HR-03具有較強的耐酸性能。

圖7 不同pH值對菌株HR-03生長的影響

2.6.2 耐膽鹽性。由圖8可知，屎腸球菌HR-03能夠耐受質(zhì)量分數(shù)為0.10%的豬膽鹽，其OD600值也隨著膽鹽質(zhì)量分數(shù)的增加而下降，表明高濃度的膽鹽對菌株HR-03的生長有抑制作用，當膽鹽質(zhì)量分數(shù)為0.30%時，菌株的OD600值仍在0.7左右，由此可見，菌株HR-03具有良好的耐膽鹽能力。

圖8 不同質(zhì)量分數(shù)膽鹽對菌株HR-03生長的影響

2.7 乳酸菌的抑菌試驗

如圖9所示，屎腸球菌HR-03對大腸桿菌抑菌圈直徑為12 mm，有較強抑制作用；而對金黃色葡萄球菌沒有產(chǎn)生抑菌圈，無抑制作用。

圖9 菌株HR-03對大腸桿菌抑制結(jié)果

3 討論

屎腸球菌(Enterococcusfaecium)是動物腸道中正常菌群的重要組成部分，定植于動物腸道黏膜表面可降低腸道內(nèi)pH值、抑制病原菌生長、減少體內(nèi)毒素含量，維持腸道健康、提高動物免疫能力[12-15]。屎腸球菌作為飼料添加劑應用于畜禽養(yǎng)殖已有多年歷史，其優(yōu)良性能已得到廣大畜牧生產(chǎn)者的認可。然而，在畜牧生產(chǎn)中往往出現(xiàn)乳酸菌等益生菌應用效果不穩(wěn)定等情況發(fā)生，這一方面或許是由于乳酸菌不耐高溫，導致產(chǎn)品中乳酸菌活菌數(shù)波動較大，從而影響應用效果[16]；另一方面主要是由于非同源菌株很難定植在動物腸道內(nèi)，或是定殖后因為各種因素無法發(fā)揮理想效果[5]，章文明等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，同源益生菌對動物更加安全，效果更為穩(wěn)定，由此可見，篩選動物同源益生菌菌種，并對其特性進行研究對于開發(fā)新的益生菌制劑至關重要。

本研究從健康德州驢腸道內(nèi)容物中分離純化得到一株乳酸菌HR-03，利用形態(tài)特征觀察、分子生物學手段鑒定為屎腸球菌，并對其安全性能、生長性能、產(chǎn)酸性能、產(chǎn)酶性能、耐受性能及抑菌特性等進行了初步研究，獲得安全性高、耐受性好且具有抑制病原菌性能的屎腸球菌HR-03，可作為后續(xù)開發(fā)驢源益生菌制劑的候選菌種。以往研究中，篩選驢源益生菌的研究報道較為有限，王卓等[18]從驢腸道內(nèi)分離鑒定出羅伊氏乳桿菌，并對其安全性進行了研究，結(jié)果表明分離的乳酸菌對小鼠安全，而且能夠增強小鼠免疫力，這同本試驗中篩選的屎腸球菌無潛在致病性結(jié)果一致；劉宇等[19]也從驢糞便樣本中分離出具有較好安全性的干酪乳桿菌LV1，并對其生長性能、pH耐受性進行了研究，但并未對篩選菌種的產(chǎn)酶、抑菌等性能進行分析。

作為飼喂養(yǎng)殖動物的益生菌，能否耐受胃酸和膽鹽是衡量一個菌種性能是否優(yōu)良的重要指標。以往研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌具有較好的耐酸性，Guerra等[20]研究表明屎腸球菌CECT410在pH=2.0的條件下可以存活；盧冰霞等[21]從健康雞盲腸中分離出1株屎腸球菌J4，該菌株在pH值為2.0的條件下也可存活。同以上結(jié)果一致，本試驗分離的屎腸球菌HR-03在pH值為2.0的條件下也能存活，且在pH值為4.0的MRS肉湯中培養(yǎng)24 h后，其OD600值仍在0.3以上，表明此菌株具有較好的的耐酸性。膽鹽有助于脂肪的消化，可促進脂肪酸和維生素的吸收，但對微生物具有抑殺作用。研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌對膽鹽也具有較好的耐受性，王煒宏等[22]分離出的1株屎腸球菌，用含膽鹽的質(zhì)量分數(shù)為0.3%的MRS肉湯處理后，菌株存活率仍能保持在50%以上。本試驗中分離出的屎腸球菌HR-03也具有較好的膽鹽耐受性，同以往研究結(jié)果一致。

菌種的產(chǎn)酶、抑菌等特性同益生菌制劑的能否發(fā)揮作用有重要關系。以往研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌具有較好的抑菌活性但產(chǎn)酶活性較低，Valenzuela等[23]研究發(fā)現(xiàn)，分離的屎腸球菌對金黃色葡萄球菌和李斯特菌具有較好的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)屎腸球菌HR-03對致病性大腸桿菌有明顯抑制作用，抑菌圈直徑為12 mm，但對金黃色葡萄球菌沒有抑制效果，這或許同不同屎腸球菌菌株產(chǎn)生的不同代謝產(chǎn)物有關。另外，Zeyner等[24]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬飼喂屎腸球菌SF68后，可以明顯抑制腸道內(nèi)致病性大腸桿菌的生長，這同本研究結(jié)果一致，本研究篩選的驢源屎腸球菌HR-03對致病性大腸桿菌也有明顯抑制作用，而且產(chǎn)酸性能較好，這對于防控大腸桿菌導致的驢駒腹瀉具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究從健康驢腸道內(nèi)容物中，分離篩選得到一株安全性、耐受性良好，且能夠抑制病原性大腸桿菌的屎腸球菌HR-03。作為驢源腸道菌種，有利于在驢腸道內(nèi)定植，可為后續(xù)驢用益生菌制劑研制提供菌種資源。