張華 綜述 龐繼景 審校

1四川大學華西第二醫(yī)院西部婦幼醫(yī)學研究院，成都 610041；2沈陽何氏眼科醫(yī)院遺傳門診，沈陽 110000

表觀遺傳是指在基因核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達和功能發(fā)生了可遺傳的變化，并最終導致表型的變化。雖然生物遺傳信息主要受DNA序列調控，但也受表觀遺傳修飾調控，表觀遺傳調控方式多樣，機體中DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)調控是常見的表觀遺傳調控基因表達方式[1]。隨著人類表觀基因組計劃的深入研究，表觀遺傳學得到了飛速發(fā)展，目前已成為生物醫(yī)學研究的一個熱點領域。表觀遺傳修飾發(fā)生在癌癥、神經系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、眼部疾病等多種人類疾病[2]。廣義的視網膜變性類疾病是一組以視網膜色素上皮細胞和光感受器細胞等視網膜神經元變性凋亡為主要特征的致盲性眼底疾病，包括視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)、糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)、青光眼等。表觀遺傳調控在視網膜變性疾病中起重要作用。本文將對主要表觀遺傳調控方式在視網膜變性疾病中的研究現(xiàn)狀及未來展望做一介紹。

1 表觀遺傳調控機制

DNA甲基化是指在DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，CpG二核苷酸胞嘧啶5'端共價結合1個甲基基團，形成5-甲基胞嘧啶的生物學過程。DNA甲基化是目前研究較深入的表觀遺傳調控機制之一，也是哺乳動物主要的表觀遺傳調控方式。機體DNA甲基化主要通過DNMT催化實現(xiàn)，哺乳動物主要有2類DNMT，DNMT1維持DNA甲基化酶，主要在DNA復制過程中維持DNA甲基化水平；DNMT3是重新DNA甲基化酶，主要形成新的甲基化位點。真核生物中CpG二核苷酸集中的區(qū)域稱為CpG島，CpG島是甲基化的主要作用部位，大多數基因啟動子區(qū)域含有CpG島。DNA甲基化功能取決于CpG二核苷酸的密度及其在基因的精確位置。

組蛋白(histone，H)是染色質的最主要蛋白質組分，染色質的基本結構單元——核小體由2個H2A、2個H2B、2個H3、2個H4組成的八聚體和147 bp纏繞在外面的DNA組成。組蛋白修飾方式多樣，乙?；悄壳把芯枯^深入的組蛋白修飾方式，組蛋白乙?；饕l(fā)生在H3、H4的N端比較保守的賴氨酸位置上，由組蛋白乙酰轉移酶和組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)協(xié)調進行，組蛋白乙?；梢哉{節(jié)染色體組裝、基因轉錄和翻譯后修飾過程。HDAC抑制劑(HDAC inhibitor，HDACi)能引起組蛋白和非組蛋白的高乙?；?，對神經系統(tǒng)損傷具有神經保護作用，可以減少細胞凋亡，提高細胞存活率，調節(jié)各種神經營養(yǎng)因子的表達，增強抗炎反應[3]。DNA甲基化和組蛋白修飾可以相互作用，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b與HDAC2或HDAC1可以發(fā)生協(xié)同抑制作用[4]。

NcRNA是指不編碼蛋白質或肽的RNA統(tǒng)稱，主要包括微小RNA(microRNA，miRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。MiRNA是一類高度保守、長度為18～24個堿基的小ncRNA，miRNA可與靶點mRNA的3'非翻譯區(qū)特異結合，進而剪切靶點mRNA并促其降解，抑制轉錄；lncRNA是一類長度大于200個堿基的ncRNA，可與蛋白質形成RNA-蛋白質復合體，也可與靶基因轉錄本形成互補鏈干擾mRNA剪切，主要在表觀遺傳、轉錄或轉錄后水平調節(jié)基因表達[5]。MiRNA和lncRNA表達異?？梢砸l(fā)各種病理過程，如癌癥、心血管疾病、神經系統(tǒng)疾病及免疫系統(tǒng)疾病等。

2 表觀遺傳調控與視網膜變性疾病

2.1 DNA甲基化與視網膜變性

DNA甲基化是眼部基因表達的重要調節(jié)因子，其在基因表達調控中起著關鍵作用，是視網膜神經元正常發(fā)育和有絲分裂后存活所必須的。異常的甲基化模式與RP、AMD、視網膜細胞氧化應激易感性增強等多種視網膜疾病或病理基礎相關[6]。DNA甲基化與遺傳因素、環(huán)境因素、生活習慣密切相關，嗜煙AMD患者DNA甲基化程度明顯升高[5]。

視網膜細胞程序性死亡過程中光感受器發(fā)生高甲基化，DNA甲基化改變可以調節(jié)視網膜變性過程中的基因表達[7]。視網膜中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B特異性敲除，引起視網膜整體甲基化水平明顯降低，外叢狀層變薄，外節(jié)缺失，視網膜電圖(electroretinogram，ERG)異常，基因表達整體失調，光感受器細胞明顯減少，突觸前部和突觸后部標志物表達減少[8]。DNMT1缺失引起出生后小鼠視網膜快速變性，影響視網膜神經元的生成，視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGC)明顯減少，顯著降低光感受器細胞分化和存活[9]。

RP模型rd1小鼠光感受器染色質異常，甲基化明顯增加，DNMT3A表達顯著升高，rd1小鼠視網膜中參與細胞死亡、存活和細胞形態(tài)及神經發(fā)育的基因高甲基化，抑制DNMTs可延緩rd1小鼠視網膜外植體光感受器細胞變性[10]。AMD患者IL17RC低甲基化，導致視網膜和血液中IL17RC蛋白和mRNA水平顯著升高[11]。AMD患者DNMT1和DNMT3b表達明顯增加，長散布核元件1作為老年相關疾病全局甲基化的替代標記，其甲基化水平明顯升高[12]。AMD患者視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞中谷胱甘肽s-轉移酶亞型mu1(glutathione S-transferase isoform mu1，GSTM1)啟動子高甲基化，GSTM1和GSTM5的mRNA表達水平明顯降低，GSTM1和GSTM5在RPE細胞中的表觀遺傳抑制可能增加AMD患者視網膜對氧化應激的敏感性[13]。

氧化應激和炎癥能夠降低人RPE細胞的活性，其中氧化應激可以降低人RPE細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b及SIRT1的表達和DNMTs的活性，炎癥可以降低DNMT1及SIRT1的表達和DNMTs及SIRT1的活性[14]。同型半胱氨酸可顯著增加人RPE細胞和小鼠視網膜的DNA甲基化和組蛋白去乙?；剑珼NMT和HDAC活性顯著增強，抑制DNA甲基化和組蛋白去乙?；娠@著降低高同型半胱氨酸血癥對視網膜的影響[15]。

2.2 組蛋白修飾與視網膜變性

RP、DR、青光眼、視網膜神經缺血性損傷等實驗模型中均觀察到組蛋白修飾的變化。組蛋白乙?；侵饕慕M蛋白修飾方式，HDACi根據不同的化學結構，可以分為羥肟酸類、環(huán)肽類、苯甲酰胺類和脂肪酸類；其中視網膜變性疾病中研究較多的是脂肪酸類(如丙戊酸鈉)和羥肟酸類(如曲古抑菌素A)。HDACi在神經退行性疾病的預防和治療中起重要作用，RP小鼠模型中組蛋白乙?；黠@減少，光感受器變性之前，Ⅰ類和Ⅱ類HDAC過度激活，凝集素在AMD病理過程中起抗炎和抑制血管生成作用，HDACi可顯著提高RPE細胞中凝集素的表達[16]。在視網膜疾病中，HDACi治療可上調抗凋亡基因，如熱休克蛋白70的表達，下調促凋亡基因，如凋亡蛋白酶活化因子-1和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase 3)的表達，抑制蛋白激酶B、細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，Erk)活化，提高細胞存活率，減少細胞凋亡過程；也可以改變神經營養(yǎng)因子的基因表達，進一步調節(jié)視網膜光感受器細胞的凋亡[17-19]。

丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)是一種廣譜HADCi，目前作為抗驚厥藥物廣泛使用，VPA可以改善RP患者視野，延緩視力下降[17]，也可以抑制AMD血管生成和炎癥反應[16]。大量研究表明VPA對RGC具有保護作用[3]。VPA通過刺激神經元TrkB受體信號阻止N-甲基-D-天門冬胺酸(N-methyl-d-aspartate，NMDA)誘導的RGC死亡、視網膜變性及視覺功能損傷[20]。谷氨酸/天冬氨酸轉運體基因缺失的小鼠在不升高眼壓的情況下發(fā)生進行性RGC凋亡和視神經變性，表現(xiàn)為青光眼特征，VPA治療可抑制此過程，改善視覺損傷，降低氧化應激水平[21]。在缺血-再灌注大鼠模型中，VPA可減輕視網膜神經元凋亡及RGC軸突損傷[18]。大鼠視神經損傷后，VPA治療可以增加RGC存活率和pERK1/2的表達，抑制caspase 3活性；也可以激活腦源性神經營養(yǎng)因子和TrkB信號，抑制RGC凋亡[19,22]。

曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)是一種羥肟酸類，可以抑制類型Ⅰ和Ⅱ HDAC，是視網膜疾病中研究較多的HDACi之一。TSA可以調節(jié)rd1小鼠過氧化物酶體增生物激活受體活性，減少rd1小鼠光感受器變性[23]；可以顯著增加cpfl1小鼠視錐光感受器存活率，抑制其變性[24]；可以延緩缺血-再灌注損傷模型視網膜厚度變薄，提高RGC存活率，減少RGC變性[25]；可以減少缺血導致的視網膜內層變性，改善ERG a波和b波振幅，降低腫瘤壞死因子α的表達[26]。脈絡膜新生血管是AMD的一種致盲性并發(fā)癥，TSA可以抑制脈絡膜新生血管生成。此外，TSA可以抑制RPE細胞在G1期的細胞周期進程進而抑制RPE細胞的增生，促進RPE細胞對纖粘蛋白的黏附，抑制色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)誘導的RPE細胞遷移及轉化生長因子β誘導的α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表達，下調促血管生成的缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達，上調抗血管生成和保護神經的血小板源性生長因子的表達，進而抑制新生血管生成[27]。

其他HDACi也具有廣泛的神經保護作用。丁酸鈉(sodium butyrate，NaB)廣泛用作動物飼料添加劑，在預防和治療神經退行性疾病方面發(fā)揮著重要作用。大鼠視神經損傷后，NaB治療可促進RGC存活，增加ERG反應，上調Akt和Erk的磷酸化水平，增加組蛋白H3K14的乙?；絒19]。Ms-275是一種合成的苯甲酰胺衍生物，選擇性抑制HDAC1、2和3，對小鼠視神經損傷后RGC的分化和存活具有保護作用[28]。

2.3 NcRNA與視網膜變性

NcRNA在視網膜發(fā)育及視網膜相關疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。在RP、AMD、DR、眼部炎癥、病理性血管生成等病變中，特異性miRNA的表達水平發(fā)生改變[6]。Rd10小鼠桿體中磷酸二酯酶基因β亞基(β subunit of the rod phosphodiesterase gene，Pde6g)第13個外顯子發(fā)生自發(fā)突變，引起大量miRNA變化顯著，1 900多個miRNA中，152個在rd10小鼠視網膜中差異表達，在變化最顯著的19個miRNA中，7個miRNA與視網膜營養(yǎng)不良有關，其中miR-3473b、miR-7035-5p和miR-762對應Pde6g的靶點[29]。淀粉樣-β低聚物可引起視網膜變性，其miRNA圖譜中61個miRNA變化顯著[30]。AMD的確切病因尚不清楚，目前較認可的分子機制有炎癥、氧化應激和病理性新生血管生成[31]。MiRNA在AMD免疫炎癥反應、氧化應激反應、病理性血管生成等多種生理病理過程發(fā)揮重要作用，miR-133、miR-222、miR-889、miR-4258等可以調節(jié)多種生長因子，miR-20、miR-23、miR-24、miR-103等可以調節(jié)多種血管生成因子，miR-9、miR-146、miR-155、miR-661、miR-3121等可以調節(jié)炎癥反應，進而調控AMD的發(fā)生及發(fā)展過程[32]。AMD患者視網膜中miR-9、miR-125b、miR-146a、miR-155上調，可導致補體因子H和炎癥調節(jié)改變，進而導致與炎癥和AMD相關的巨噬細胞數量、位置和表型的改變[31]。MiR-25、miR-184等參與氧化應激反應，氧化應激可提高miR-25的表達，進而抑制整合素αV和PEDF的表達，導致RPE吞噬功能紊亂，引起RPE凋亡和視力損害[33]；抑制miR-184可提高RPE細胞ezrin蛋白的水平，也可導致溶酶體相關膜蛋白1下調，降低RPE吞噬功能[34]。AMD與缺氧密切相關，AMD患者HIF-1明顯上調，HIF-1可以活化VEGF的表達。MiR-17可以調節(jié)HIF-1和VEGF的基因表達；AMD患者玻璃體液中miR-152下調，miR-152可以調節(jié)VEGF的表達；miR-126是維持血管結構的必要條件；miR-150可以調節(jié)細胞遷移、增生和成管過程[31,33,35]。MiRNA目前已成為AMD的潛在治療靶點，其中，miR-889、miR-4258、miR-661、miR-3121等可能成為臨床上AMD的生物學標志物[32]。

相對于miRNA，lncRNA在視網膜變性疾病中的研究正處于起步階段，lncRNA可影響視網膜發(fā)育并參與視網膜變性疾病的發(fā)生和發(fā)展。LncRNA也調節(jié)AMD進程，早期AMD患者中共有266個差異表達基因，其中64個是lncRNA，RP11-234O6.2可以調節(jié)老化RPE細胞功能，早期AMD中RP11-234O6.2表達下調，外源性RP11-234O6.2可提高RPE細胞的存活率[36]。對lncRNA母體表達基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)的抑制可以治療光誘導引起的視網膜變性，光誘導后，MEG3表達顯著上調，MEG3沉默可降低促凋亡的caspase 3和caspase 7活性，上調抗凋亡的bcl-2表達，進而抑制光誘導引起的光感受器細胞凋亡[37]。MEG3也參與糖尿病相關的微血管功能障礙，MEG3敲除可增加毛細血管變性和炎癥，加重視網膜血管功能障礙，體外實驗中，MEG3敲除可以增加視網膜內皮細胞的增生、遷移和成管[38]。LncRNA ZNF503-AS1位于RPE細胞胞漿中，可以促進RPE細胞分化，抑制RPE細胞增生和遷移；ZNF503-AS1由ZNF503反義轉錄而來，可以抑制ZNF503表達，而ZNF503可抑制RPE細胞分化，促進RPE細胞增生和遷移[39]。

3 總結與展望

視網膜變性是致盲的主要原因之一，其發(fā)病機制比較復雜。上世紀80年代以前，一般把原因不明的視網膜變性，如RP稱為原發(fā)性或特發(fā)性變性，用以和有較明確誘因的其他視網膜變性，如AMD等相區(qū)別。在過去的30多年里，隨著分子生物學和分子遺傳學的進展，大多數原因不明的原發(fā)性視網膜變性被發(fā)現(xiàn)和基因突變及由此而產生的功能性蛋白缺失有關；這類疾病現(xiàn)在也叫遺傳性視網膜變性。雖然每年都有造成視網膜變性的新突變基因被發(fā)現(xiàn)，仍有20%以上的這類臨床表現(xiàn)相似的病人在基因層面找不到致病原因。近年來的研究發(fā)現(xiàn)在這些病例中，有一些即使基因的核苷酸序列不發(fā)生突變，其基因的表達和功能也能發(fā)生可遺傳的改變，并最終導致表型的變化，引起疾病，這是表觀遺傳學的基礎。

目前研究證實多種因素可以影響視網膜變性的進程。在所有類型的視網膜變性，包括由基因或者其表達問題造成的遺傳性視網膜變性、環(huán)境和/或遺傳等多因素造成的視網膜變性(AMD、青光眼、DR等)中均可能發(fā)生DNA甲基化、組蛋白乙?；?、ncRNA表達障礙等表觀遺傳變化；某些表觀遺傳藥物，如SAHA等臨床試驗也在進行中。表觀遺傳調控可以改善視網膜基因表達，促進細胞分化與存活，減少細胞凋亡，抑制炎癥反應及血管生成，減少光感受器變性。然而表觀遺傳調控治療突變基因明確的遺傳性視網膜變性疾病尚不是首選，因為單純表觀遺傳調控很難徹底改善由基因突變造成的蛋白缺失，需要借助基因治療等手段達到徹底糾正病因的目的[40]。其次，表觀遺傳影響或調控視網膜變性的發(fā)病機制尚不完全清楚，其在視網膜凋亡、氧化應激、炎癥、新生血管生成等方面的研究較淺，機制方面有待進一步闡明。再次，表觀遺傳存在交互調控現(xiàn)象，DNA甲基化和組蛋白修飾相互作用引起轉錄激活或沉默[4,41]，改變一種表觀遺傳調控方式，可以引起另一種表觀遺傳調控方式代償性的改變，這給視網膜變性疾病的治療帶來不確定因素。表觀遺傳交互調控視網膜變性疾病的關鍵靶點篩選是治療的關鍵所在，同時，表觀遺傳藥物大多缺乏特異性，這樣無法有針對性地進行靶向治療。盡管表觀遺傳調控視網膜變性有待于更充分的探索，但表觀遺傳失調顯然是視網膜變性的重要原因之一，表觀遺傳調控可能是多因素造成的視網膜變性疾病的有效治療手段，也是對不適合基因替代療法的這類患者在治療方法上的補充。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突