白周現(xiàn) 邵敬芝 劉莉娜 孔祥東

1鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心，鄭州 450000；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，鄭州 450000

先天性白內(nèi)障是主要的兒童致盲眼病之一，嬰幼兒出生時(shí)或1歲前可出現(xiàn)部分或全部晶狀體混濁，嚴(yán)重影響患兒視力發(fā)育。先天性白內(nèi)障可分為僅有晶狀體混濁的單純白內(nèi)障和伴有其他眼部及全身其他系統(tǒng)異常的綜合征；單純白內(nèi)障也可伴或不伴其他眼部異常，如小角膜、小眼球和虹膜缺損等[1]。先天性白內(nèi)障與遺傳關(guān)系密切，遺傳性白內(nèi)障常見的遺傳方式為常染色體顯性遺傳，少數(shù)為常染色體隱性遺傳及X染色體連鎖隱性遺傳[2]。先天性白內(nèi)障大多數(shù)是單純型，通常雙眼受累，單眼受累較少見[3]。目前已報(bào)道有數(shù)十個(gè)基因的相關(guān)變異可導(dǎo)致先天性白內(nèi)障，包括晶狀體蛋白基因、膜蛋白基因、調(diào)節(jié)眼球發(fā)育的基因、熱休克蛋白等，其中晶狀體蛋白基因數(shù)量最多[4]。然而，目前已知的致病性基因變異并不能完全解釋所有的遺傳相關(guān)先天性白內(nèi)障，高通量測(cè)序技術(shù)在遺傳性眼病臨床檢測(cè)中的實(shí)踐為發(fā)現(xiàn)更多的致病性變異提供了有效手段。本研究擬通過(guò)分析先天性白內(nèi)障患者的臨床表現(xiàn)和致病變異，為先天性白內(nèi)障患者產(chǎn)前診斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用家系調(diào)查研究，納入2018年1月至2019年12月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的12個(gè)無(wú)血緣關(guān)系的中國(guó)漢族先天性白內(nèi)障家系，收集其既往病史及相關(guān)檢查。納入本研究的27例患者均為檢出致病基因的先天性白內(nèi)障患者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，研究方案經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào)：KS-2018-KY-36)，受試者或其監(jiān)護(hù)人均對(duì)本研究知情并自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1捕獲測(cè)序及變異位點(diǎn)分析 采集患者和家系成員外周血各4 ml。外周血基因組DNA使用Blood DNA Midi Kit D3494試劑盒(美國(guó)Omega Bio-Tek公司)，通過(guò)epMotion全自動(dòng)核酸提取純化工作站(德國(guó)Eppendorf公司)抽提。利用Agilent SureSelect外顯子靶向序列富集系統(tǒng)進(jìn)行序列捕獲(含153個(gè)白內(nèi)障致病基因，北京貝瑞和康公司設(shè)計(jì))，采用Illumina NextSeq 500(美國(guó)Illumina公司)測(cè)序。目標(biāo)序列測(cè)序深度平均為100×。變異注釋選擇GRCh37版人類基因組參考序列，篩選分析得到候選致病變異位點(diǎn)。入選本研究候選致病變異的條件為患者疾病表型、家族史、相關(guān)致病基因的遺傳方式均符合先天性白內(nèi)障。

候選變異致病性分析通過(guò)人類基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)(human gene mutation database，HGMD)、單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(database of single nucleotide polymorphisms，dbSNP)查詢目標(biāo)變異收錄情況。變異的人群頻率檢索基因組整合數(shù)據(jù)庫(kù)gnomAD。候選變異報(bào)道情況和致病性研究通過(guò)PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)查詢。由GERP++軟件工具分析變異位點(diǎn)的氨基酸序列保守性；采用SIFT、PolyPhen_2、MutationTaster蛋白功能分析軟件預(yù)測(cè)錯(cuò)義變異的影響，判斷其致病性，其中SIFT預(yù)測(cè)值范圍為(0，1)，值越小越有害；PolyPhen_2和MutationTaster預(yù)測(cè)值范圍為(0，1)，值越大越有害。

1.2.2變異驗(yàn)證 參照本研究團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法驗(yàn)證家系12致病基因外顯子缺失重復(fù)[5]。其他家系的候選變異行Sanger測(cè)序法驗(yàn)證。采用Taq DNA聚合酶(立陶宛Fermentas公司)和特異引物(GeneTool設(shè)計(jì))對(duì)受試者基因組DNA目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增，其中3個(gè)新突變家系的引物設(shè)計(jì)見表1。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)32次；72 ℃終延伸10 min，純化(乙醇/醋酸鈉法按BigDyeV3.1操作)DNA片段產(chǎn)物變性后，通過(guò)3130xl型測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)用dGTP BigDye?Terminator Sequencing Kit(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件為96 ℃ 1 min；96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 4 min，循環(huán)25次。

2 結(jié)果

2.1 12個(gè)家系患者臨床特點(diǎn)

12個(gè)家系家系圖見圖1，其主要臨床表現(xiàn)見表2，其中單純白內(nèi)障共9個(gè)家系(家系1～9)，先天性白內(nèi)障伴無(wú)虹膜癥1個(gè)家系(家系10)，綜合征型白內(nèi)障2個(gè)家系(家系11和12)。除家系11患者Ⅱ1為單眼白內(nèi)障外，其他患者均雙眼患病。家系6患者Ⅱ1和家系10的各個(gè)患者除白內(nèi)障外，還表現(xiàn)出眼球震顫，家系7的每例患者均表現(xiàn)出小眼球癥(圖2)。

表1 3個(gè)新變異的Sanger測(cè)序驗(yàn)證引物Table 1 Primers for identification of novel variations by Sanger sequencing家系基因位點(diǎn)正向引物序列(5'-3')反向引物序列(5'-3')產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)5CRYGDc.422GAGGACTACAGAGGCCAGATGATATGCCAGGAACACACAGAAAATATT3057CRYBB2c.434CGTAGTGGGTGCACTGGGCAGAGGTCAGCAGAGCACACT40510ELP4c.886GGGGAGACGATATTTGCTGTGCGCAAATGGCCAGAAAGCACCT264

圖1 12個(gè)先天性白內(nèi)障家系家系圖 □：正常男性；○：正常女性；■：男性患者；●：女性患者；：性別未知胎兒；：女性攜帶者；/：已故；：先證者Figure 1 Pedigrees of 12 families with congenital cataract □：normal male；○：normal female；■：male patient；●：female patient；：fetus of unknown sex；：female carrier；/：deceased；：proband

表2 12個(gè)先天性白內(nèi)障家系患者臨床表現(xiàn)Table 2 Clinical manifestations of patients with congenital cataract in 12 collected pedigrees家系患者例數(shù)患者主要臨床表現(xiàn)12患者Ⅱ2,女,32歲,雙眼先天性中央核性白內(nèi)障;患者Ⅲ1,女,4歲,雙眼先天性白內(nèi)障22患者Ⅱ 1,女,19歲,出生3 d發(fā)現(xiàn)雙眼白內(nèi)障,4月齡時(shí)行白內(nèi)障手術(shù),術(shù)后視力基本正常;患者Ⅰ2,女,44歲,雙眼先天性白內(nèi)障(晶狀體外周點(diǎn)狀混濁)、視力障礙34患者Ⅲ5,男,7歲,1歲發(fā)現(xiàn)雙眼先天性白內(nèi)障,行白內(nèi)障摘出術(shù);患者Ⅰ1、Ⅱ2和Ⅱ5雙眼先天性白內(nèi)障41患者Ⅱ1,女,29歲,雙眼先天性白內(nèi)障52患者Ⅱ2,女,26歲,雙眼先天性白內(nèi)障;患者Ⅰ2雙眼先天性白內(nèi)障61患者Ⅱ1,男,42歲,雙眼先天性白內(nèi)障、眼球震顫、斜視、弱視74患者Ⅱ1,男,37歲,雙眼先天性白內(nèi)障、雙眼小眼球;患者Ⅰ2和Ⅱ3雙眼先天性白內(nèi)障、雙眼小眼球;患者Ⅲ2,胎兒期經(jīng)基因產(chǎn)前診斷為先天性白內(nèi)障患者即引產(chǎn)82患者Ⅱ1,男,28歲,雙眼先天性白內(nèi)障;患者Ⅲ1雙眼先天性白內(nèi)障92患者Ⅱ1,女,26歲,雙眼先天性白內(nèi)障;患者Ⅰ2雙眼先天性白內(nèi)障105患者Ⅲ5,女,22歲,雙眼先天性白內(nèi)障、眼球鐘擺樣震顫、虹膜缺損;患者Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ1和Ⅲ6雙眼先天性白內(nèi)障、虹膜缺損、眼球震顫111患者Ⅱ1,男,3歲,右眼先天性白內(nèi)障,左眼視盤發(fā)育異常,腎臟發(fā)育異常121患者Ⅲ2,男,2歲,雙眼先天性白內(nèi)障,蛋白尿,腦發(fā)育遲緩

圖2 家系11患者Ⅱ1右眼白內(nèi)障照片F(xiàn)igure 2 Right eye with cataract of patient Ⅱ1 in family 11

2.2 二代測(cè)序篩查

經(jīng)Illumina NextSeq 500測(cè)序平臺(tái)DNA靶向測(cè)序，12個(gè)家系患者分別檢測(cè)到與其表型高度相關(guān)的基因變異(表3)。

2.3 候選變異驗(yàn)證

各個(gè)基因變異驗(yàn)證結(jié)果均與二代測(cè)序一致，3個(gè)新變異Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果見圖3。12個(gè)家系各基因變異型和疾病表型全部共分離。12個(gè)家系受試者的相關(guān)變異攜帶情況見圖1。

表3 先天性白內(nèi)障12個(gè)家系基因變異概況Table 3 Genetic variations of 12 families with congenital cataract included家系基因核酸改變氨基酸改變合子狀態(tài)人群頻率致病性預(yù)測(cè)遺傳方式疾病[OMIM number]新變異(文獻(xiàn))1CRYBA4c.277T>Cp.S93PHet-+++AD白內(nèi)障23型[610425]否[6]2MIPc.97C>Tp.R33CHet-+++AD白內(nèi)障15型[615274]否[7]3CRYBB2c.563G>Ap.R188HHet-+++AD白內(nèi)障3型[601547]否[8]4CRYBB2c.436G>Cp.V146LHet-+-+AD白內(nèi)障3型[601547]否[9]5CRYGDc.422delGp.G141Dfs?6Het-///AD白內(nèi)障4型[115700]是6GJA8c.593G>Ap.R198QHet-+++AD白內(nèi)障1型[116200]否[10]7CRYBB2c.434G>Cp.R145PHet-+++AD白內(nèi)障3型[601547]是8CRYGCc.470G>Ap.W157XHet-+++AD白內(nèi)障2型[604307]否[11]9CRYGDc.70C>Ap.P24THet----AD白內(nèi)障4型[115700]否[12]10ELP4c.886C>Ap.L296IHet-+++AD無(wú)虹膜2型[617141]是11PAX2c.70dupGp.V26Gfs?28Het0.000 2///ADRCS[120330]否[13]12OCRLE5-E16dup-Hemi-///XRLowe綜合征[309000]否[5] 注:OMIM:人類在線孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù);Het:雜合變異;Hemi:半合子變異;AD:常染色體顯性遺傳;XR:X染色體連鎖隱性遺傳;RCS:腎視神經(jīng)乳頭缺損綜合征 致病性分別由SIFT、PolyPhen_2、MutationTaster預(yù)測(cè),+表示預(yù)測(cè)有害或致病,-表示預(yù)測(cè)良性,/表示無(wú)結(jié)果 Note:OMIM:Online Mendelian Inheritance in Man;Het:heterozygous variation;Hemi:hemizygous variation;AD:autosomal dominant inheritance;XR:X-linked recessive inheritance;RCS:renal coloboma syndrome The pathogenicity was predicted by SIFT,PolyPhen_ 2 and MutationTaster,respectively,and+indi-cated damaging,- for benign,/ for NA

圖3 3個(gè)新變異Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果 A：家系5 CRYGD基因c.422delG突變型與野生型 B：家系7 CRYBB2基因c.434G>C突變型與野生型 C：家系10 ELP4基因c.886C>A突變型與野生型Figure 3 Sanger sequencing analysis for validation of 3 new variations A：Mutant and wild-type CRYGD c.422delG in family 5 B：Mutant and wild-type CRYBB2 c.434G>C in family 7 C：Mutant and wild-type ELP4 c.886C>A in family 10

2.4 變異致病性分析

12個(gè)先天性白內(nèi)障家系共檢出12個(gè)不同候選致病變異(表3)，其中ELP4基因c.886C>A、CRYBB2基因c.434G>C、CRYGD基因c.422delG在PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)和HGMD專業(yè)版均未見報(bào)道，為新發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)。CRYBA4基因c.277T>C和OCRL基因E5-E16dup為本課題組已報(bào)道變異[5-6]。CRYGD基因c.422delG為移碼變異，依據(jù)《遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》和2015年版《ACMG Standards and Guidelines》判斷其致病性非常強(qiáng)，等級(jí)為PVS1，為致病性變異，主要表現(xiàn)為翻譯過(guò)程提前終止而產(chǎn)生了截短的無(wú)功能產(chǎn)物蛋白。

ELP4基因c.886C>A和CRYBB2基因c.434G>C位點(diǎn)在dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)記錄編號(hào)，不屬于多態(tài)性位點(diǎn)，人群發(fā)生頻率極低。gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)查詢?cè)撟儺愒谌巳褐邪l(fā)生頻率未記錄。蛋白功能分析軟件對(duì)這2個(gè)變異位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，SIFT預(yù)測(cè)值為0，提示為有害變異，PolyPhen_2和MutationTaster預(yù)測(cè)值均為1，提示為有害和致病變異。ELP4基因c.886C>A變異導(dǎo)致第296位氨基酸由非極性二級(jí)結(jié)構(gòu)趨向α螺旋的脂肪族亮氨酸替換為非極性二級(jí)結(jié)構(gòu)趨向β折疊的異亮氨酸，CRYBB2基因c.434G>C變異導(dǎo)致第145位氨基酸由極性帶正電無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)趨向的脂肪族精氨酸替換為非極性二級(jí)結(jié)構(gòu)趨向β轉(zhuǎn)角的雜環(huán)脯氨酸。CRYBB2基因c.436G>C(p.V146L)是與c.434G>C位置緊臨的已知致病性錯(cuò)義變異[9]，c.434G>C有害的可能性大。ELP4基因c.886C>A(p.L296I)和CRYBB2基因c.434G>C(p.R145P)位點(diǎn)氨基酸序列在物種間高度保守(圖4)，變異有害的可能性大。

圖4 ELP4基因296位和CRYBB2基因145位氨基酸序列在物種間的保守性 2個(gè)位點(diǎn)均高度保守Figure 4 Conservation of amino acid sequences at position 296 of ELP4 and position 145 of CRYBB2 among species Both loci were highly conserved

3 討論

本研究12個(gè)先天性白內(nèi)障家系包括9個(gè)單純白內(nèi)障家系、1個(gè)先天性白內(nèi)障伴無(wú)虹膜癥家系和2個(gè)綜合征型白內(nèi)障家系。這些家系中僅RCS為單眼白內(nèi)障，其余均為雙眼發(fā)??；依據(jù)孟德爾遺傳定律，僅眼腦腎綜合征為X染色體連鎖隱性遺傳，其余均為常染色體顯性遺傳。針對(duì)晶狀體致病基因靶向捕獲測(cè)序進(jìn)行的分析發(fā)現(xiàn)，12個(gè)家系致病基因變異可分為3個(gè)組，即晶狀體蛋白類變異(家系1、3、4、5、7、8、9)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類變異(家系2、6、12)和轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體類變異(家系10、11)。本研究通過(guò)臨床表型結(jié)合遺傳學(xué)分析確診了12個(gè)先天性白內(nèi)障家系的致病基因及變異位點(diǎn)。

晶狀體蛋白占人晶狀體濕重的30%～40%，占晶狀體干重的90%。α、β、γ晶狀體球蛋白均為遺傳性突變的靶蛋白，這些蛋白的基因變異可導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常和晶狀體混濁[14]，從而引起先天性白內(nèi)障。本研究檢出的晶狀體球蛋白類變異基因包括CRYBA4、CRYBB2、CRYGC和CRYGD。CRYBA4基因編碼β晶狀體球蛋白A4亞基，β晶狀體球蛋白是一種復(fù)雜的蛋白聚合體，通常同種亞基結(jié)合為同二聚體或不同亞基聚合為異二聚體。CRYBA4為β晶狀體球蛋白酸性基團(tuán)成員，是與β-B1、β-B2和β-B3組成的基因簇的一部分[15]。CRYBB2基因編碼β晶狀體球蛋白B2亞基。CRYGC為γ晶狀體球蛋白家族的成員之一，據(jù)報(bào)道其變異與核性粉狀白內(nèi)障和板層白內(nèi)障有關(guān)[12,16]。CRYGD基因變異可以出現(xiàn)更多的表型變異。γ晶狀體球蛋白是一組由高度對(duì)稱的單體蛋白組成的同源基因，通常缺乏連接肽和末端延伸。γ晶狀體球蛋白家族包括4個(gè)基因(γ-A、γ-B、γ-C、γ-D)和3個(gè)假基因(γ-E、γ-F、γ-G)，在基因組序列中以基因簇的形式排列。晶狀體的透明特性是組織結(jié)構(gòu)高度有序的結(jié)果，這些結(jié)構(gòu)的維持依賴于水合作用和單個(gè)細(xì)胞容積的控制。而各種相關(guān)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白就承擔(dān)著這樣的任務(wù)，其基因變異可導(dǎo)致先天性白內(nèi)障[14]。本研究檢出的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類變異基因包括MIP、GJA8和OCRL。MIP基因編碼晶狀體纖維的主要內(nèi)在蛋白AQP0，是成熟晶狀體內(nèi)最多的連接膜蛋白，作為水通道蛋白涉及快速的水跨膜運(yùn)動(dòng)。GJA8基因編碼縫隙連接蛋白α-8，作為縫隙連接蛋白的一部分，連接素Cx50是晶狀體纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和成熟必需的。OCRL基因編碼肌醇多磷酸鹽5-磷酸酶，涉及調(diào)節(jié)膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，也定位于多個(gè)亞細(xì)胞膜。研究表明，OCRL基因產(chǎn)物定位于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和腎小管細(xì)胞的初級(jí)纖毛，OCRL變異導(dǎo)致纖毛縮短、纖毛功能障礙[17]，從而使眼、腎臟出現(xiàn)相應(yīng)癥狀。初級(jí)纖毛信號(hào)通路也介導(dǎo)眼壓感覺[18]。最新的RNA測(cè)序研究在OCRL變異導(dǎo)致的眼腦腎綜合征中發(fā)現(xiàn)了與眼部白內(nèi)障相關(guān)的差異表達(dá)基因[19]。晶狀體的發(fā)育是由多種基因在時(shí)間和空間上相互作用共同協(xié)調(diào)完成的，轉(zhuǎn)錄因子基因變異會(huì)導(dǎo)致一定程度的眼前節(jié)，如角膜和晶狀體發(fā)育異常[20]。本研究檢出的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體類變異基因有ELP4和PAX2。ELP4基因編碼延伸子乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物亞基4，在轉(zhuǎn)錄延伸期間直接與RNA聚合酶Ⅱ接合。ELP4基因?qū)AX6的表達(dá)有下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[21]，PAX6為已知的無(wú)虹膜癥致病基因，可導(dǎo)致無(wú)虹膜及白內(nèi)障表型。ELP4基因變異可間接通過(guò)調(diào)控PAX6影響白內(nèi)障表型。PAX2基因編碼配對(duì)盒2，該轉(zhuǎn)錄因子基因家族的核心特征是保守的DNA結(jié)合配對(duì)盒結(jié)構(gòu)域。

靶向測(cè)序能夠輔助先天性白內(nèi)障遺傳病因的確診及亞型鑒別。Astiazarn等[22]對(duì)11個(gè)墨西哥先天性白內(nèi)障家系進(jìn)行了靶向捕獲測(cè)序研究，Zhai等[23]對(duì)27個(gè)中國(guó)先天性白內(nèi)障家系進(jìn)行了外顯子組靶向捕獲測(cè)序研究，其結(jié)果同樣涉及本研究結(jié)果所屬的3類基因，分別達(dá)到了55%(6/11，墨西哥人)和63%(17/27，中國(guó)人)的分子診斷率。本研究分子診斷率約為71%(12/17)，這可能與根據(jù)臨床表型納入的白內(nèi)障受試者和靶向捕獲基因的優(yōu)化有關(guān)。本研究12個(gè)家系患者的臨床表現(xiàn)顯示了異質(zhì)性，家系11、12為伴有白內(nèi)障的綜合征患者，家系7白內(nèi)障3型患者均雙眼球縮小，而家系3、4患者無(wú)此癥狀。家系10無(wú)虹膜2型患者均虹膜缺損輕微，以白內(nèi)障表現(xiàn)為主。一些白內(nèi)障患者還表現(xiàn)出眼球震顫。本研究結(jié)果表明，不同基因型的先天性白內(nèi)障表現(xiàn)有差異，即使相同基因型的先天性白內(nèi)障表現(xiàn)也可不同。

本研究匯總分析了12個(gè)不同家系先天性白內(nèi)障患者的臨床表現(xiàn)和致病基因變異，報(bào)道了導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的3個(gè)新變異并分析了變異致病性。本研究結(jié)果拓展了常染色體顯性遺傳及X染色體連鎖隱性遺傳的先天性白內(nèi)障致病基因變異譜，豐富了先天性白內(nèi)障相關(guān)表型譜，有助于進(jìn)一步理解該病的分子機(jī)制，為先天性白內(nèi)障的確診、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明白周現(xiàn)：參與選題、醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)、起草文章；邵敬芝：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)；劉莉娜：分析/解釋數(shù)據(jù)；孔祥東：對(duì)文章知識(shí)性內(nèi)容的審閱和智力性內(nèi)容的修改及定稿