李 樊， 李隱俠， 舒嘉傲， 孟春花， 張 俊， 錢 勇， 曹少先

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇南京210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇南京210014；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014)

隨著綿羊養(yǎng)殖集約化發(fā)展和全球變暖加劇，熱應(yīng)激對(duì)綿羊生產(chǎn)性能的不利影響日益嚴(yán)重。有研究結(jié)果表明，熱應(yīng)激組公羔羊的生長(zhǎng)速度和飼料利用率均顯著低于正常組的羔羊[1]；夏季公羔羊的生長(zhǎng)速度、飼料利用率和腰肉產(chǎn)量均顯著低于冬季[2]。在交配周期內(nèi)，環(huán)境溫度大于等于32 ℃的條件下每增加1 d，母羊的受精率和產(chǎn)羔率分別下降2.7%和3.5%[3-4]，說(shuō)明交配期間的高溫對(duì)受精、胚胎存活都產(chǎn)生不利影響。熱應(yīng)激影響綿羊卵母細(xì)胞后期的發(fā)育，且延長(zhǎng)發(fā)情周期，導(dǎo)致受精率和胚胎成活率明顯下降。

鈣離子通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)外形成離子梯度，在細(xì)胞內(nèi)充當(dāng)?shù)诙攀埂ｂ}穩(wěn)態(tài)是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心，受到許多離子通道、泵和交換器的嚴(yán)格調(diào)控[5]。在非興奮性細(xì)胞中，大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放是通過(guò)以下3種通道進(jìn)行的：(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的1,4,5-三磷酸肌醇受體(IP3Rs)的鈣離子通道；(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的RYR(Ryanodine)受體的鈣釋放通道；(3)溶酶體樣細(xì)胞器中的煙酸腺嘌呤二核苷酸(NAADP)鈣離子通道[6]。

控制鈣離子釋放或者積累的鈣信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞周期、生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖等方面發(fā)揮重要作用。鈣離子濃度在細(xì)胞分裂間期(DNA合成前期/DNA復(fù)制期、DNA合成后期/細(xì)胞分裂期)和細(xì)胞分裂中期到后期的相變期間顯著增加[7-9]。在斑馬魚(yú)和非洲爪蟾胚胎發(fā)育過(guò)程中都有觀察到細(xì)胞間的鈣波存在[10-11]，在哺乳動(dòng)物卵子激活和胚胎發(fā)育中也發(fā)現(xiàn)了鈣信號(hào)的重要作用[12]。

本研究擬以湖羊卵巢顆粒細(xì)胞為對(duì)象，研究熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞鈣離子濃度、鈣離子通路相關(guān)基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡和雌激素合成的影響，以期為解析熱應(yīng)激影響綿羊繁殖性能的分子機(jī)制提供理論依據(jù)，為緩解夏季綿羊熱應(yīng)激提供候選靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮的湖羊卵巢從江蘇省太倉(cāng)市東林屠宰場(chǎng)采集，放入裝有37 ℃生理鹽水的保溫杯中立即帶回實(shí)驗(yàn)室。生理鹽水沖洗3遍后用手術(shù)剪剪掉卵巢周圍組織，注射器抽取3～5 mm卵泡的卵泡液后輕輕注入15 ml的離心管中，1 000 r/min離心5 min，再用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)清洗2遍后棄去PBS；用預(yù)熱的DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中；24 h后觀察細(xì)胞貼壁情況，用PBS清洗細(xì)胞，更換培養(yǎng)基，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)處理

湖羊卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)24 h，貼壁后分為3組，對(duì)照組(37 ℃)、熱應(yīng)激組(42 ℃)和熱應(yīng)激+鈣離子螯合劑(BAPTA-AM)組(42 ℃)，分別在5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)提取，每項(xiàng)試驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄

用RNA提取試劑盒(BioTeke公司產(chǎn)品)抽提RNA，Nandrop2000分光光度計(jì)[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品]測(cè)定RNA質(zhì)量濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；20 μl反應(yīng)體系為：RNA 1 000 ng，4×gDNA wiper Mix 4 μl，RNase Free dH2O 16 μl，混合均勻，42 ℃ 2 min去除基因組DNA，然后加入5×HiScript II qRT SuperMix II 4 μl，吹打混勻， 50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄后所得的cDNA產(chǎn)物可于-20 ℃或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物合成和real-time PCR

根據(jù)綿羊相關(guān)基因的NCBI序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，以β-actin為內(nèi)參基因，進(jìn)行real-time PCR試驗(yàn)(表1)。20.0 μl反應(yīng)體系：2.0 μl cDNA，10.0 μl 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix (南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品)，0.4 μl上游引物，0.4 μl下游引物，7.2 μl ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

表1 real-time PCR引物序列

1.5 Western blot分析

將卵巢顆粒細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，將培養(yǎng)板分別置于37 ℃、42 ℃和42 ℃+BAPTA-AM條件下培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，100 ℃ 10 min變性。處理好的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，上樣量為30 μg，60 V電泳3.0 h，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(100 V，30 min)，將膜置于5%脫脂牛奶中封閉1.5 h，用GAPDH蛋白(Proteintech公司產(chǎn)品，貨號(hào) 60004-1-lg，稀釋倍數(shù)1∶3 000)、BAX蛋白(Proteintech公司產(chǎn)品，貨號(hào) 50599-2-lg，稀釋倍數(shù)1∶2 000)、BCL2蛋白(Proteintech公司產(chǎn)品，貨號(hào) 66799-1-lg，稀釋倍數(shù)1∶2 000)、MFN2蛋白(AFFINITY公司產(chǎn)品，貨號(hào) DF8106，稀釋倍數(shù)1∶2 000)、FIS1蛋白(AFFINITY公司產(chǎn)品，貨號(hào) DF12005，稀釋倍數(shù)1∶1 000)、CYP19A1蛋白(AFFINITY公司產(chǎn)品，貨號(hào) DF6884，稀釋倍數(shù)1∶1 000)抗體4 ℃敷育過(guò)夜，含吐溫20的Tris鹽酸(TBST)緩沖液洗膜(1次10 min，3次)，二抗室溫敷育2 h，洗膜，顯影，image J灰度值分析。

1.6 鈣離子濃度測(cè)定方法

去除顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)液，用Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)緩沖液清洗3遍，每孔加入200 μl Fluo-4 AM(Fluo-4是鈣離子熒光探針，AM是一種乙酰甲酯衍生物)工作液(終濃度為1 μmol/L)，37 ℃孵育30 min，隨后用HBSS洗滌3次，洗滌后再孵育30 min以確保Fluo-4 AM在細(xì)胞內(nèi)完全轉(zhuǎn)變成Fluo-4。熒光顯微鏡檢測(cè)熒光并拍照分析，以確定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率

湖羊卵巢顆粒細(xì)胞在各處理下培養(yǎng)48 h后，胰酶[不含乙二胺四乙酸(EDTA)]消化5 min，冷PBS緩沖液清洗2次， 100 μl 1×binding buffer 重懸，加入5 μl FITC Annexin V 和5 μl PI染色液混勻，避光孵15 min，加400 μl 1×binding buffer混勻, 染色后的樣品于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行細(xì)胞凋亡水平的檢測(cè)，結(jié)果用FlowJo V7.6 軟件進(jìn)行分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16.0 軟件中t檢驗(yàn)以及單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱應(yīng)激對(duì)湖羊卵巢顆粒細(xì)胞鈣離子濃度的影響

利用Fluo-4鈣離子熒光探針檢測(cè)熱應(yīng)激前后湖羊卵巢顆粒細(xì)胞中鈣離子濃度的變化。結(jié)果(圖1)顯示，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組湖羊卵巢顆粒細(xì)胞的鈣離子熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說(shuō)明熱應(yīng)激誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞鈣離子濃度升高。加入BAPTA-AM后，熱應(yīng)激組的鈣離子濃度明顯下調(diào)。

圖1 熱應(yīng)激對(duì)湖羊卵巢顆粒細(xì)胞鈣離子濃度的影響

2.2 熱應(yīng)激對(duì)湖羊卵巢顆粒細(xì)胞中鈣離子信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

鈣離子是細(xì)胞的第二信使，熱應(yīng)激導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞鈣離子濃度上升，可引起細(xì)胞膜的去極化。以鈣離子信號(hào)通路中細(xì)胞膜去極化通路中CACNA1C、CACNA1B、RYR1和CAMK2共4個(gè)基因?yàn)閷?duì)象，real-time PCR檢測(cè)熱應(yīng)激對(duì)這4個(gè)基因mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果(圖2)表明，熱應(yīng)激組湖羊卵巢顆粒細(xì)胞中鈣離子信號(hào)通路中CACNA1B、CACNA1C、RYR1、CAMK2基因表達(dá)均顯著或極顯著上調(diào)，但是熱應(yīng)激+鈣離子螯合劑組，CAMK2基因表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。

*表示差異達(dá)0.05顯著水平；**表示差異達(dá)0.01顯著水平。

2.3 熱應(yīng)激通過(guò)鈣信號(hào)調(diào)控湖羊卵巢顆粒細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)

以線粒體融合蛋白2(MFN2)和分裂蛋白(FIS1)為對(duì)象，檢測(cè)熱應(yīng)激后其在卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)水平的變化。Real-time PCR(圖3)和Western blot結(jié)果(圖4)顯示，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組線粒體融合蛋白基因MFN2無(wú)論是mRNA表達(dá)水平還是蛋白質(zhì)表達(dá)水平均無(wú)顯著變化，但是熱應(yīng)激組線粒體分裂蛋白基因FIS1的mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著提高。熱應(yīng)激+鈣離子螯合劑組，F(xiàn)IS1基因的mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平均較熱應(yīng)激組顯著下調(diào)。

*表示差異達(dá)0.05顯著水平；**表示差異達(dá)0.01顯著水平。

*表示差異達(dá)0.05顯著水平；**表示差異達(dá)0.01顯著水平。

2.4 熱應(yīng)激通過(guò)鈣信號(hào)調(diào)控湖羊卵巢顆粒細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖5)顯示，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，熱應(yīng)激+鈣離子螯合劑組細(xì)胞凋亡率下降。與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組促凋亡蛋白家族代表基因BAX和抗凋亡蛋白家族代表基因BCL2在卵巢顆粒細(xì)胞中mRNA表達(dá)量的比值(BAX/BCL2)顯著上升，但是加入鈣離子螯合劑后比值下降。Western blot結(jié)果表明，熱應(yīng)激組BAX蛋白表達(dá)量上升，BCL2蛋白表達(dá)量下降，加入鈣離子螯合劑后結(jié)果相反。說(shuō)明熱應(yīng)激通過(guò)鈣離子信號(hào)調(diào)控BAX基因表達(dá)上調(diào)和BCL2基因表達(dá)下調(diào)，調(diào)控湖羊卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。

A～C：流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組(37 ℃)、熱應(yīng)激組(42 ℃)、熱應(yīng)激+鈣離子螯合劑組湖羊卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況；D：流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同處理卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率；E～F：熱應(yīng)激對(duì)顆粒細(xì)胞BCL2、BAX蛋白表達(dá)水平的影響；G：熱應(yīng)激對(duì)顆粒細(xì)胞促凋亡蛋白家族代表基因BAX和抗凋亡蛋白代表基因BCL2 mRNA表達(dá)量比值(BAX/BCL2)的影響。*表示差異達(dá)0.05顯著水平。Annexin V：鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白。

2.5 熱應(yīng)激通過(guò)鈣信號(hào)調(diào)控湖羊卵巢顆粒細(xì)胞功能

為了研究熱應(yīng)激對(duì)湖羊卵巢顆粒細(xì)胞功能的影響，本研究用ELISA方法檢測(cè)熱應(yīng)激后卵巢顆粒細(xì)胞雌二醇的水平。圖6顯示，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組雌二醇含量顯著下降(P<0.05)；熱應(yīng)激+鈣離子螯合劑組與熱應(yīng)激組相比，雌二醇含量顯著上升(P<0.05)。與對(duì)照組相比，雌激素合成關(guān)鍵基因CYP19A1的mRNA表達(dá)水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平在熱應(yīng)激組卵巢顆粒細(xì)胞中均顯著下降(P<0.05)，但是熱應(yīng)激+鈣離子螯合劑組與熱應(yīng)激組相比顯著上升(P<0.05)。說(shuō)明熱應(yīng)激通過(guò)鈣離子濃度調(diào)控湖羊卵巢顆粒細(xì)胞雌二醇合成能力，影響卵巢顆粒細(xì)胞的功能。

A～B：熱應(yīng)激對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞CYP19A1 mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響；C：熱應(yīng)激對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞雌二醇水平的影響;*表示差異達(dá)0.05顯著水平。

3 討論

熱應(yīng)激對(duì)動(dòng)物健康有重要影響，可顯著降低生產(chǎn)力和繁殖性能[13-14]。大量研究結(jié)果表明，很多基因和信號(hào)通路參與了熱應(yīng)激調(diào)控動(dòng)物生產(chǎn)性能的過(guò)程，鈣信號(hào)通路就是其中之一[15-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+-CaMK2-HSF1信號(hào)通路調(diào)控斑馬魚(yú)的熱應(yīng)激[17]。本研究以湖羊卵巢顆粒細(xì)胞為對(duì)象，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激處理后，卵巢顆粒細(xì)胞中鈣離子濃度顯著上升，說(shuō)明熱應(yīng)激導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞鈣離子濃度發(fā)生變化，破壞細(xì)胞內(nèi)的鈣平衡。

熱應(yīng)激是如何調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞鈣離子濃度變化的呢？鈣離子通過(guò)其進(jìn)入通道和釋放通道進(jìn)出細(xì)胞膜和細(xì)胞器，以滿足機(jī)體各項(xiàng)生理功能的需要[5]。電壓門控鈣離子通道是一種鈣進(jìn)入通道，鑲嵌于細(xì)胞膜上，其中央是高度選擇性的親水通道，允許適當(dāng)電荷和適當(dāng)大小的鈣離子通過(guò)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激后電壓門控鈣離子通道基因CACNA1C、CACNA1B的mRNA表達(dá)水平顯著上升，說(shuō)明熱應(yīng)激打開(kāi)了細(xì)胞膜上的鈣進(jìn)入通道。RYR1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放通道的一個(gè)關(guān)鍵受體[19]，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣池的鈣離子進(jìn)入細(xì)胞漿的重要通道之一。熱應(yīng)激后湖羊卵巢顆粒細(xì)胞中RYR1表達(dá)量顯著上升，說(shuō)明熱應(yīng)激引起卵巢顆粒細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子通過(guò)RYR1受體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)?？傊瑹釕?yīng)激打開(kāi)卵巢顆粒細(xì)胞鈣離子進(jìn)入通道和釋放通道，導(dǎo)致細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子釋放到細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度上調(diào)。

釋放到細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+很快與Ca2+結(jié)合蛋白相結(jié)合，成為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活成分，鈣調(diào)素就是其中之一。鈣調(diào)蛋白是一種依賴于鈣離子活性的蛋白質(zhì)，與鈣離子結(jié)合形成Ca2+/CaM復(fù)合物，從而啟動(dòng)下游多種信號(hào)通路[20]。熱應(yīng)激導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶(CAMK2)表達(dá)量顯著升高，但是在熱應(yīng)激卵巢顆粒細(xì)胞中加入鈣離子螯合劑后，CAMK2基因表達(dá)量顯著下調(diào)，說(shuō)明熱應(yīng)激導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞鈣離子濃度上升，誘導(dǎo)CAMK2表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而啟動(dòng)下游其他信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞的功能。

線粒體為細(xì)胞正常生長(zhǎng)代謝提供必需的能量，線粒體穩(wěn)態(tài)對(duì)維持機(jī)體的生物學(xué)功能具有非常重要的作用[21-23]。融合和分裂伴隨著線粒體的一生，維持著線粒體的穩(wěn)態(tài)[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激會(huì)損傷線粒體，破壞線粒體穩(wěn)態(tài)[25]。本研究選擇調(diào)控線粒體融合和分裂的2種蛋白質(zhì)MFN2、FIS1，探討熱應(yīng)激導(dǎo)致鈣離子濃度變化后對(duì)MFN2、FIS1表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在湖羊卵巢顆粒細(xì)胞中，熱應(yīng)激導(dǎo)致線粒體分裂基因FIS1表達(dá)量顯著升高，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度后FIS1基因表達(dá)水平恢復(fù)正常，說(shuō)明熱應(yīng)激可能通過(guò)調(diào)控鈣離子濃度來(lái)調(diào)控線粒體分裂基因FIS1的變化，進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體損傷。

BAX作為促凋亡蛋白參與細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)CL2蛋白可拮抗BAX的促凋亡效應(yīng)，BAX/BCL2失衡導(dǎo)致半胱天冬酶釋放并引發(fā)半胱天冬酶級(jí)聯(lián)發(fā)生，最終激活半胱天冬酶3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激后綿羊卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率顯著上升，促凋亡蛋白基因BAX和抗凋亡蛋白基因BCL2的表達(dá)量比值顯著上升；加入鈣離子螯合劑后，BAX/BCL2表達(dá)量比值顯著下降，細(xì)胞凋亡率下降，表明熱應(yīng)激通過(guò)調(diào)控鈣離子濃度的變化，引起B(yǎng)AX/BCL2表達(dá)量比值變化，進(jìn)而誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。

卵巢顆粒細(xì)胞是雌性動(dòng)物卵巢卵泡的重要組成部分，顆粒細(xì)胞分泌雌二醇，促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟，進(jìn)而調(diào)控雌雄動(dòng)物的生殖[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激后調(diào)控雌激素合成關(guān)鍵基因CYP19A1的mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著下降，但是加入鈣離子螯合劑后CYP19A1的mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著上升；相應(yīng)的，熱應(yīng)激后湖羊卵泡顆粒細(xì)胞分泌雌二醇的能力顯著下降，鈣離子螯合劑加入后能恢復(fù)由于熱應(yīng)激導(dǎo)致的雌二醇下降。說(shuō)明熱應(yīng)激通過(guò)鈣離子信號(hào)調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，從而影響其細(xì)胞功能，進(jìn)而影響動(dòng)物的繁殖。

4 結(jié)論

熱應(yīng)激導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞細(xì)胞膜上的鈣離子進(jìn)入通道(電壓門控鈣離子通道)和鈣離子釋放通道(RYR1受體)打開(kāi)，鈣離子濃度上升，導(dǎo)致CAMK2蛋白表達(dá)上調(diào)，激活下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響卵巢顆粒細(xì)胞的功能，調(diào)控綿羊的繁殖性能。