李彥超,胡靚君,張琪,劉睿,崔小兵,柴川,文紅梅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

《中國藥典》(以下簡稱“藥典”)收載的蜈蚣為蜈蚣科少棘巨蜈蚣ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch的干燥體[1],性辛、溫,有毒。其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為下品,具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙,攻毒散結(jié),通絡(luò)止痛之功效。由于其性猛力強(qiáng),療效遠(yuǎn)超其他平性中藥,被歷代醫(yī)家所喜用。

我國蜈蚣資源種類較多,分布較廣,目前藥用蜈蚣多來源于野生,除藥典規(guī)定的正品藥用蜈蚣少棘巨蜈蚣外,還有多棘蜈蚣S.subspinipesmultidensNewport、墨江蜈蚣S.mojiangicaZhang et Chi、黑頭蜈蚣S.negrocapitisZhang et Wang和哈氏蜈蚣S.hedaaniBrandat這4種常見品種,在某些地區(qū)的民間也作為藥用蜈蚣使用,存在著混用誤用現(xiàn)象[2]。不同品種蜈蚣在產(chǎn)地、形態(tài)及功效等方面存在差異。少棘巨蜈蚣主要分布在長江中下游地區(qū),其頭板及第一背板桔紅色,其他背板深綠色,體型小,主治肝風(fēng)內(nèi)動(dòng),痙攣抽搐,小兒驚風(fēng),風(fēng)濕頑痹,蛇蟲咬傷等;多棘蜈蚣主要分布在云南、廣西等地,頭板及第一背板紅褐色,其他背板棕色,體型大,內(nèi)服或外用,用于驚風(fēng)、抽搐、淋巴結(jié)核、腫毒瘡瘍、腫瘤等;墨江蜈蚣主要分布在云南墨江地區(qū),暗褐色,體型小,內(nèi)服,用于中風(fēng)、風(fēng)濕、瘡瘍、瘰疬等;黑頭蜈蚣分布在長江流域,青綠色,體型小,有時(shí)混于少棘巨蜈蚣藥材商品中;哈氏蜈蚣主要分布在珠江流域,云南、海南等地,頭板及第一背板紅棕色,其他背板棕色或黃棕色至紅棕色,泡酒外用,用于風(fēng)濕、癬疥等[3]。

蜈蚣中蛋白質(zhì)和多肽成分含量占60%～70%[4],為抗腫瘤[5-7]、抗凝、溶栓[8-9]和抗菌[10-13]等作用的有效成分,但由于蛋白多肽類成分復(fù)雜,缺乏針對蜈蚣蛋白多肽類成分的特異性鑒別?；谏镔|(zhì)譜的分析方法已被應(yīng)用于不同物種的鑒別,如梁瑞強(qiáng)等[14]找到全蝎的特征多肽(IIAPPER),可用于區(qū)分全蝎與其他品種動(dòng)物。2020年版藥典采用液質(zhì)聯(lián)用法選取特征多肽的特征離子,對龜甲膠、阿膠進(jìn)行定性鑒別;采用LC-MS MRM法對阿膠特征多肽進(jìn)行定量分析[1]。劉睿等[15]采用生物質(zhì)譜法結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)分析尋找鹿皮明膠中的物種特異性肽,并使用靶向質(zhì)譜法驗(yàn)證特征肽。

本課題組前期對蜈蚣蛋白質(zhì)進(jìn)行分析[16]，從蜈蚣胃蛋白酶解液中鑒定出7個(gè)多肽,選取少棘巨蜈蚣中含量較高的3個(gè)特征肽段(LEEDLERSEERL、EEKDKALQNAEGEVAAL、MILPTGASSF),合成對照品。本文采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UFLC-MS/MS)法,優(yōu)化活性多肽的質(zhì)荷比(母離子、子離子)和各個(gè)多肽成分的質(zhì)譜條件,以多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),建立蜈蚣中3個(gè)特征肽段的檢測方法,比較少棘巨蜈蚣與不同品種蜈蚣的含量差異,以期為蜈蚣的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng):LC-30AD型超高效液相色譜儀(日本島津公司),AB Sciex 4500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Sciex公司)。SOP型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司),KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),TGL 16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試劑

乙腈(質(zhì)譜純,德國Merk公司),甲酸(質(zhì)譜純,德國Merk公司),無水乙醇(分析純,南京化學(xué)試劑股份有限公司)，Sep-Pak C18脫鹽小柱(50 mg,美國Waters公司),胃蛋白酶(474 U·mg-1,南京翼飛雪生物科技有限公司,批號：YP0022-10),十二烷基硫酸鈉(SDS,南京生興生物技術(shù)有限公司,批號：2G232G23),二硫蘇糖(DTT,上海凜恩科技發(fā)展有限公司,批號：RH162644),人工胃液(北京雷根生物技術(shù)有限公司,批號：1201A21)。

采集蜈蚣20批,其中少棘巨蜈蚣8批,多棘蜈蚣5批,黑頭蜈蚣3批,墨江蜈蚣2批,哈氏蜈蚣2批;非蜈蚣品種8批,其中地龍3批,僵蠶2批,水蛭、土鱉蟲、全蝎各1批，均由南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為正品。樣品信息詳見表1。

表1 20批蜈蚣及8批其他動(dòng)物藥來源信息表

多肽TD1(LEEDLERSEERL)、TD2(EEKDKALQNAEGEVAAL)、TD3(MILPTGASSF)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,信息詳情見表2。

表2 3種多肽的信息表

2 方法

2.1 色譜條件

采用XSelect HSS T3(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)色譜柱;以乙腈為流動(dòng)相A,以0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B,按表3進(jìn)行梯度洗脫,流速為0.6 mL·min-1;進(jìn)樣量為5 μL;柱溫為40 ℃。

表3 梯度洗脫表

2.2 質(zhì)譜條件

采用三重四極桿質(zhì)譜檢測器,電噴霧離子化(ESI),離子源噴霧電壓(Ionspray voltage):5 500 V;離子源溫度(TEM):550 ℃;氣簾氣壓力(CUR):35 psi;霧化器壓力(GAS 1):55 psi;輔助加熱器壓力(GAS 2):55 psi。正離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測(MRM),監(jiān)測離子對和優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表4。

表4 3種肽段優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)

2.3 對照品溶液的制備

取3種肽段對照品約10 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,加水溶解并稀釋到刻度,搖勻,制備成單一對照品儲備液，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存,備用。精密量取各對照品儲備液適量,制備成2 μg·mL-1混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液制備

取樣品粉末100 mg,精密稱定,置于離心管中,加蛋白裂解液(2%SDS,20 mmol·L-1DTT,50 mmol·L-1PBS,pH 7.8)5 mL,超聲處理(40 kHz,250 W)60 min,4 500 r·min-1離心10 min,取上清液,在冰浴上緩慢加入冷乙醇至80%乙醇濃度,邊加邊振搖,12 000 r·min-1離心10 min,取沉淀揮干,得到醇沉沉淀粉末,加人工胃液800 μL,密閉,振搖,于37 ℃恒溫孵育30 min。加胃蛋白酶溶液200 μL制成活力值為14 200 U·mL-1的溶液1 mL,酶解8 h,后置85 ℃恒溫水浴中滅活15 min,冷卻至室溫,以12 000 r·min-1離心10 min,取上清液,即得。

所得的蛋白酶解液經(jīng)C18小柱脫鹽處理后,注入液質(zhì)聯(lián)用儀分析。

3 結(jié)果

3.1 蜈蚣肽段的篩選

對鑒定得到的7個(gè)肽段進(jìn)行合成,通過MRM模式初步比較7個(gè)肽段與少棘巨蜈蚣酶解液,確定3個(gè)響應(yīng)值較高的肽段,即TD1(LEEDLERSEERL)、TD2(EEKDKALQNAEGEVAAL)、TD3(MILPTGASSF),3種肽段的二級質(zhì)譜圖見圖1。其中TD1和TD2對應(yīng)蛋白的登記號為“tr|A5D6I1|A5D6I1_9MYRI”,蛋白功能為原肌球蛋白(Tropomyosin);TD3對應(yīng)蛋白登記號為“tr|L7R1H2|L7R1H2_9NEOP”,蛋白功能為Phosphopyruvate hydratase。

3.2 質(zhì)譜分析

經(jīng)質(zhì)譜分析,選擇TD1(LEEDLERSEERL)的母/子離子對為m/z506.59(三電荷)→638.4(雙電荷),TD2(EEKDKALQNAEGEVAAL)的母/子離子對為m/z605.64(三電荷)→562.0(三電荷),TD3(MILPTGASSF)的母/子離子對為m/z1 023.5→666.1。

在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下,對3種多肽TD1、TD2、TD3進(jìn)樣分析,其提取離子色譜圖見圖2。由圖2可見,3種多肽分離度好,峰形對稱,保留時(shí)間分別為3.43、4.24、5.55 min。

3.3 蜈蚣蛋白提取條件的考察

以提取方式(A),提取溶劑(B),沉淀方式(C)為3個(gè)因素,選取3個(gè)水平,按照正交試驗(yàn)表5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。蜈蚣蛋白提取條件的正交試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表5 正交試驗(yàn)因素水平表

表6 蜈蚣蛋白提取條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

從表6結(jié)果和極差分析可知,各因素對3種肽段的綜合影響力度為B>C>A,即提取溶劑影響最大,沉淀方式次之,提取方式無明顯影響?？紤]實(shí)際操作的簡便性,最終確定蛋白的提取條件:蛋白裂解液作為提取溶劑,超聲處理(40 kHz,250 W)60 min,沉淀方式為80%乙醇沉淀蛋白。

3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液,逐級稀釋,加水定容,制備成8個(gè)不同濃度的混合對照品溶液,分別精密吸取上述溶液各5 μL,注入液質(zhì)聯(lián)用儀,以對照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y),對照品濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X),制備3種多肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立回歸方程,線性關(guān)系考察結(jié)果見表7。以信噪比S/N=10時(shí)的進(jìn)樣濃度為最低定量限(LOQ)。

表7 蜈蚣中3個(gè)肽段的線性關(guān)系考察結(jié)果

3.5 樣品測定以及定性鑒別

取20批不同品種蜈蚣飲片及8批地龍、僵蠶、水蛭、土鱉蟲和全蝎飲片,按“2.4”方法制備樣品溶液,“2.1”色譜條件和“2.2”質(zhì)譜條件進(jìn)行測定,從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出供試品溶液中相應(yīng)于3種肽段的含量,結(jié)果見表8。少棘巨蜈蚣與其他動(dòng)物藥3種肽段提取離子色譜圖見圖3。少棘巨蜈蚣與其他4種非藥典蜈蚣品種3種肽段提取離子色譜圖見圖4。

由圖3A可見,在TD1對照品保留時(shí)間處,少棘巨蜈蚣均檢出明顯色譜峰,地龍、僵蠶、水蛭中均未檢出色譜峰,而在全蝎和土鱉蟲中有對應(yīng)色譜峰,因此TD1可用于區(qū)別少棘巨蜈蚣與地龍、僵蠶和水蛭。由圖3B～C可見,在TD2、TD3對照品保留時(shí)間處,少棘巨蜈蚣均檢出明顯色譜峰,在全蝎、土鱉蟲、地龍、僵蠶和水蛭中均無對應(yīng)色譜峰,因此TD2和TD3可區(qū)分少棘巨蜈蚣與全蝎、土鱉蟲、地龍、僵蠶和水蛭。

由圖4A～B可見,在TD1、TD2對照品保留時(shí)間處,少棘巨蜈蚣、黑頭蜈蚣和多棘蜈蚣有明顯色譜峰;表8也可以看出TD1、TD2在少棘巨蜈蚣、黑頭蜈蚣和多棘蜈蚣中遠(yuǎn)高于哈氏蜈蚣,而墨江蜈蚣中未檢出TD1和TD2。TD1和TD2可用于區(qū)別少棘巨蜈蚣與墨江蜈蚣、哈氏蜈蚣。由圖4C可見,在TD3對照品保留時(shí)間處,少棘巨蜈蚣有明顯色譜峰,黑頭蜈蚣和多棘蜈蚣中未檢出色譜峰,因此TD3可以區(qū)分少棘巨蜈蚣與多棘蜈蚣、黑頭蜈蚣。

表8 28批樣品中3種肽段的含量

綜上所述,TD1、TD2、TD3三個(gè)肽段可用于區(qū)分蜈蚣屬動(dòng)物與其他動(dòng)物藥,同時(shí)也可區(qū)分藥典品種少棘巨蜈蚣與上述4種常見的非藥典蜈蚣品種。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化,分別考察了乙腈-水,乙腈-0.1%甲酸溶液等洗脫體系,加入甲酸以后色譜峰響應(yīng)值較高,峰形較好,故優(yōu)選乙腈為流動(dòng)相A,0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行了梯度洗脫。

質(zhì)譜條件的優(yōu)化中采用MRM模式,多肽的母分子通常選用多電荷離子,使其質(zhì)量數(shù)適于質(zhì)譜檢測(m/z100～1 200)。在選擇二級特征子離子碎片時(shí),應(yīng)盡量選取質(zhì)量數(shù)偏大的碎片離子,以避免與其他小分子物質(zhì)在鑒定過程中的混淆,確保方法的準(zhǔn)確性。同時(shí)選取質(zhì)譜響應(yīng)較高的碎片,來提高檢測方法的靈敏度。

常見的蛋白提取方式有浸提法和超聲法,由于煎煮易使蛋白質(zhì)變性,最高提取溫度為60 ℃。故選取4 ℃冷浸提取、60 ℃熱浸提取、超聲處理3種方式對蜈蚣蛋白進(jìn)行提取考察。選取水、1%碳酸氫銨和蛋白裂解液作為提取溶劑考察指標(biāo)。對所得蛋白溶液進(jìn)行沉淀方法考察,選取有機(jī)溶劑沉淀法(80%乙醇、80%丙酮)和鹽析法(80%硫酸銨)。

本研究采用蛋白裂解液提取蜈蚣蛋白,胃蛋白酶酶解成多肽,以TD1、TD2、TD3作為對照品,建立了UFLC-MS/MS法分析蜈蚣中3個(gè)多肽成分。該方法可用于區(qū)分少棘巨蜈蚣與地龍、僵蠶、水蛭、全蝎及土鱉蟲,同時(shí)通過比較3種多肽的差異,可區(qū)分藥典品種少棘巨蜈蚣和4種非藥典品種,為蜈蚣的質(zhì)量評價(jià)和基礎(chǔ)研究提供參考。