劉孜琦，聶妍琦，傅旖靈，陸夢，郁潔

湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410036

中風是全球范圍內(nèi)第二大致死原因，也是導致殘疾的主要因素，其發(fā)病率逐年上升，其中大部分為缺血性中風。缺血性中風病理特點是局部腦組織血流量受阻形成梗塞區(qū)，恢復缺血腦組織血液供應是缺血性中風治療的主要措施。目前西醫(yī)主要采用溶栓治療，但血液再灌注后可導致腦損傷進一步加重，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。研究表明，CIRI早期以炎癥反應為主，CIRI誘導的神經(jīng)細胞凋亡和神經(jīng)系統(tǒng)損傷與NLRP3激活密切相關(guān)，抑制NLRP3介導的細胞焦亡能發(fā)揮神經(jīng)保護作用。課題組前期研究顯示，電針可改善缺血再灌損傷模型大鼠神經(jīng)功能，抑制神經(jīng)細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究通過大腦中動脈栓塞（MCAO）大鼠模型，進一步探討電針是否通過抑制NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡發(fā)揮神經(jīng)保護作用，為明確電針治療缺血性中風的作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

9～10周齡健康SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（230±30）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2019-0004。分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，溫度24～26℃，相對濕度50%～70%，12 h光/暗循環(huán)，自由攝食飲水。使用許可證號SCXK（湘）2019-0009。實驗過程嚴格按照《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》進行。

1.2 藥物及試劑

依達拉奉注射液，1.5 mg/mL，貨號H20080056，安徽國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司。4%多聚甲醛，貨號BL539A，北京白鯊易科技有限公司；戊巴比妥鈉，貨號P3761，上海Sigma-Aldrich；BCA蛋白濃度測定試劑盒，貨號PC0020，北京Solarbio；SYBR FAST qPCR Master Mix，貨 號KM4101，上 海KAPA Biosystems；蛋白Marker，貨號P12103，深圳Helix；化學發(fā)光試劑，貨號WBKLS0500，上海Millipore；PVDF膜，貨號IPVH00010，上海Millipore；吐溫-20，貨號T8220-100，北京Solarbio；RIPA組織細胞快速裂解液，貨號R0010，北京Solarbio；NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、白細胞介素（IL）-1β、GAPDH、Goat anti-Rabbit IgG抗體，貨號分別為PAB37930、PAB44625、PAB39968、PAB36269、SAB43714，武漢Bioswamp；伊紅，貨號E8090，北京Solarbio；蘇木素，貨號G1004，武漢Servicebio；中性樹脂，貨號G8590，北京Solarbio。

1.3 主要儀器

一次性實驗針灸針（0.30 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司），栓線（型號2634-50A4，北京西濃有限公司），電針治療儀（型號SDZ-Ⅱ，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），正置顯微鏡（型號DM1000，上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司），恒溫烘箱（型號DHG-9023A，上海一恒科學儀器有限公司），石蠟切片機（型號RM2235，上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司），生物組織包埋機-冷凍機（型號TB-718L，湖北泰維科技），電泳儀（型號Mini Protean 3 Cell，上海Bio-Rad），酶標儀（型號MK3，芬蘭雷勃），干式恒溫器（型號K30，杭州爽盛儀器），高速冷凍離心機（型號iCEN-24R，杭州奧盛），全自動化學發(fā)光分析儀（型號Tanon-5200，上海天能），PCR儀（型號GE48527，杭州柏恒），熒光定量PCR儀（型號CFX-Connect 96，上海Bio-Rad），超微量分光光度計（型號Nano-300，杭州奧盛）。

1.4 分組及造模

大鼠適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗，按隨機數(shù)字表法將60只大鼠分為空白組、模型組、電針組和依達拉奉組，每組15只。除空白組外，采用Longa改良線栓法制備MCAO模型，術(shù)前12 h禁食不禁水，1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射（30 mg/kg）麻醉大鼠，仰臥位固定于鼠板，剃除頸部毛發(fā)，消毒皮膚，頸部正中切開皮膚，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣用止血鉗鈍性分離皮下筋膜、肌肉及腺體，充分暴露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，用玻璃分針分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈及迷走神經(jīng)，分別在頸內(nèi)動脈、頸外動脈掛線備用。結(jié)扎頸外動脈近心端，用顯微動脈夾暫時夾閉頸內(nèi)動脈和頸總動脈，在距頸總動脈分叉3 mm處剪一“V”形小口，將栓線由“V”型小口插入頸總動脈至頸內(nèi)動脈，松開頸內(nèi)動脈及頸總動脈處顯微動脈夾，繼續(xù)將栓線插入頸內(nèi)動脈約（18.5±0.5）mm至微感阻力，將頸內(nèi)動脈遠心端處手術(shù)線結(jié)扎，用以固定栓線。逐層縫合傷口，碘伏消毒傷口及周圍皮膚，栓線另一端留l cm置于體外，術(shù)后腹腔注射青霉素鈉（20萬U/只）預防感染。缺血90 min后撤去栓線實現(xiàn)再灌注。空白組只暴露頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈及迷走神經(jīng)，不插入栓線。

大鼠蘇醒后根據(jù)文獻[10]標準進行神經(jīng)功能缺損評分：0分，無神經(jīng)缺損癥狀；1分，不能完全伸展左前肢；2分，走路時身體轉(zhuǎn)向偏癱側(cè)；3分，行走時身體向偏癱側(cè)傾倒；4分，不能自主行走，意識喪失。分別于蘇醒后0、24、48 h進行評分，將首次評分為1～3分的大鼠納入實驗。

1.5 干預

電針組參照《實驗針灸學》進行腧穴定位，選取左側(cè)“內(nèi)關(guān)”“百會”，用0.30 mm×25 mm針灸針30°斜刺2 mm，正極接左側(cè)“內(nèi)關(guān)”，負極接“百會”，連接電針治療儀。刺激參數(shù)：疏波10 Hz、密波50 Hz，脈沖寬度0.5 ms，電流1 mA。電針組大鼠造模生命體征平穩(wěn)后（約2 h）進行第1次電針，隨后每隔12 h電針1次，20 min/次，共5次。模型組和依達拉奉組在相同時段予固定操作20 min。依達拉奉組大鼠在造模蘇醒后即刻一次性腹腔注射依達拉奉注射液（3 mg/kg），模型組和電針組注射等量生理鹽水。

1.6 指標檢測

1.6.1 HE染色

干預結(jié)束后，每組選取3只大鼠，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，斷頭取腦，切取0.3 cm×0.3 cm大小腦組織，放入4%多聚甲醛中固定48 h，乙醇梯度脫水，浸蠟包埋，切片（厚度3 μm），每只大鼠選取3張切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察，Leica Application Suite圖象系統(tǒng)采集圖像，觀察大腦皮層梗死區(qū)病理改變。

1.6.2 TUNEL染色

將固定好的大鼠腦組織常規(guī)脫水浸蠟包埋，連續(xù)切片（2 μm），水浴展片及烤片，脫蠟處理后，不同濃度酒精水化，滴加Protein K工作液，37℃孵育15 min，加入50 μL TUNEL反應混合液，濕盒避光37℃加蓋孵育60 min，PBS沖洗3次，加入50 μL POD-conjugated Anti-FITC工作液，濕盒37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，加入50 μL DAB底物，室溫孵育10 min，蘇木素復染，脫水，透明，封片。光學顯微鏡下觀察，以棕黃色顆粒為凋亡陽性表達，每張切片隨機選取5個視野，使用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計每個視野中凋亡陽性細胞數(shù)及細胞總數(shù)，計算細胞凋亡率（凋亡陽性細胞數(shù)÷細胞總數(shù)×100%）。

1.6.3 Western blot檢測

剪取200 mg凍存腦組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，4℃、12000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，樣品與5×上樣緩沖液混合，100℃加熱5 min變性；配制12%分離膠、5%濃縮膠進行電泳，20 μg/孔上樣，濃縮膠80 V、40 min，分離膠120 V、50 min，當溴酚藍到達分離膠底部時結(jié)束電泳；4℃、100 mA轉(zhuǎn)膜50 min；5%脫脂奶粉4℃封閉過夜；加入NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GAPDH一抗（均為1∶1000），室溫孵育1 h；TBST洗膜15 min×3次，滴加HRP標記山羊抗兔IgG（1∶10000），室溫孵育1 h；TBST洗膜15 min×3次，滴加ECL化學發(fā)光液顯色曝光，將膜置于全自動化學發(fā)光分析儀中檢測，采用TANON GIS軟件讀取蛋白條帶灰度值。

1.6.4 RT-PCR檢測

取100 mg腦組織，加入1 mL Trizol研磨成勻漿，12000 r/min離心15 min，提取組織總RNA，按照說明書進行反轉(zhuǎn)錄，將cDNA進行PCR擴增：95℃預變性3 min，95℃變性5 s，59℃退火10 s，72℃延伸25 s，共40個循環(huán)。采用CFX Manager 3.1軟件獲取Ct值，以GAPDH為 內(nèi) 參，2法 計 算NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對表達量。PCR引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 電針對模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響

造模后0 h，各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分較空白組均顯著升高（＜0.01），提示造模成功；與模型組比較，電針組和依達拉奉組大鼠造模后24、48 h神經(jīng)功能缺損評分顯著降低（＜0.05，＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠造模后不同時點神經(jīng)功能缺損評分比較［M（Q1，Q3），分］

2.2 電針對模型大鼠大腦皮層病理變化的影響

HE染色結(jié)果顯示，空白組大鼠大腦皮層神經(jīng)元密集、排列規(guī)則，胞質(zhì)豐富，核仁明顯，未見病理損傷；模型組大鼠大腦皮層神經(jīng)元排列紊亂，染色質(zhì)皺縮，胞體膨大變形，部分可見細胞膜破裂，有空泡，周圍尼氏體消失，部分神經(jīng)細胞萎縮及壞死，有大量小膠質(zhì)細胞，微血管增多；電針組大鼠大腦皮層病變情況較模型組減輕，細胞排列較整齊，少量神經(jīng)細胞壞死，神經(jīng)細胞形態(tài)有明顯改善，有少量小膠質(zhì)細胞；依達拉奉組大鼠大腦皮層病理損傷較模型組顯著減輕，神經(jīng)細胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰，胞漿豐富。見圖1。

圖1 各組大鼠大腦皮層形態(tài)（HE染色，×400）

2.3 電針對模型大鼠腦組織細胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠腦組織細胞凋亡率顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，電針組和依達拉奉組大鼠腦組織細胞凋亡率顯著降低（＜0.01）。見表3、圖2。

圖2 各組大鼠腦組織凋亡陽性表達（TUNEL染色，×200）

表3 各組大鼠腦組織細胞凋亡率比較（±s，%）

2.4 電針對模型大鼠腦組織NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1、白細胞介素-1β蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，電針組和依達拉奉組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達顯著降低（＜0.01），且依達拉奉組各指標低于電針組，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05，＜0.01）。見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白免疫印跡

圖4 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達比較（±s，每組15只）

2.5 電針對模型大鼠腦組織NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1、白細胞介素-1β mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達顯著升高（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，電針組和依達拉奉組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達顯著降低（＜0.05，＜0.01），且依達拉奉組各指標低于電針組，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達比較（±s，每組15只）

3 討論

缺血性中風病因主要為風、火、痰、瘀、虛，病機多屬本虛標實。《醫(yī)林改錯》有“無氣則不能動，不能動，名曰半身不遂，不遂者，不遂人用也”，將中風表現(xiàn)的臨床癥狀歸于氣虛不達所致?，F(xiàn)代研究表明，元氣虧損是缺血性腦卒中的主要原因，氣行則血行，氣為血之帥，因此氣虛則血虛，脈道失榮?！夺樉拇蟪伞酚小爸酗L將至，病淺癥輕，時發(fā)時止，若有若無，其因不明，此時若施以針灸，投以重劑，恐傷氣血，又慮虛實之誡，誤釀痼疾”，強調(diào)中風的病性為本虛標實，以虛為主，忌投以重劑。

本實驗參考前期研究選取“百會”“內(nèi)關(guān)”進行電針干預，進一步揭示電針對缺血再灌注損傷模型大鼠的保護機制。百會為諸陽之會，督脈要穴，全身各部陽氣皆匯集于此，《會元針灸學》有“百會者，五臟六腑奇經(jīng)三陽百脈之所會”，刺激百會可調(diào)動百脈之氣，補陽調(diào)陰。研究發(fā)現(xiàn)，百會具有醒神開竅、益精調(diào)神作用。百會位于巔頂，百會之下則為腦，《本草綱目》“腦為元神之府”，而心主神志，心藏神，心腦同治也?！叭酥癫赜谀X，人之識神發(fā)于心”（《醫(yī)學衷中參西錄》），故取手厥陰心包經(jīng)穴內(nèi)關(guān)相配，手厥陰心包經(jīng)起于胸中，出屬心包絡，下膈，歷絡三焦。內(nèi)關(guān)為八脈交會穴、絡穴之一，常用于治療心臟疾病及部分神志病證，具有寧心定志作用。且內(nèi)關(guān)與陰維脈相通，通過絡脈與三焦貫通，調(diào)理三焦氣機，運行氣血，故針刺內(nèi)關(guān)可調(diào)心以醒腦。百會、內(nèi)關(guān)二穴相配，可達開竅醒神、活血祛風之功。本研究中，電針干預后模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著低于模型組，且與依達拉奉組無明顯差異。HE染色顯示，模型組大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞排列紊亂，細胞萎縮及壞死，神經(jīng)元核固縮及變形，電針組大鼠腦組織病理損傷明顯減輕，提示電針能降低大鼠腦組織損傷，改善神經(jīng)細胞形態(tài)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

CIRI發(fā)病機制復雜，炎癥反應和細胞焦亡是其過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中，炎癥反應在CIRI早期發(fā)揮重要作用。NLRP3炎癥小體是腦血管疾病產(chǎn)生的最廣泛的復合小體之一，在大腦中大量表達，能夠識別缺血性中風期間細胞損傷，并調(diào)節(jié)缺血再灌注損傷引起的炎癥反應。NLRP3炎癥小體由NLRP3（3個結(jié)構(gòu)域及NLR寡聚化形成炎癥小體的核心結(jié)構(gòu)）、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1前體（pro-Caspase-1）組成，可以增加促炎細胞因子的產(chǎn)生和分泌，導致細胞凋亡和細胞焦亡的程序性死亡。細胞焦亡作為具有炎癥性特點的細胞死亡形式，可介導炎癥反應的發(fā)生，加劇CIRI。細胞焦亡依賴于經(jīng)典的Caspase-1通路，細胞內(nèi)的模式識別受體作為感受器識別細胞外信號，通過接頭蛋白ASC與pro-Caspase-1結(jié)合，形成多蛋白復合物，使Caspase-1活化?；罨腃aspase-1一方面對IL-1β和IL-18的前體進行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，募集炎癥細胞，擴大炎癥反應；另一方面切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段，誘導細胞膜穿孔，細胞破裂，導致細胞焦亡。NLRP3是細胞焦亡的關(guān)鍵蛋白，可與ASC相互作用，招募pro-Caspase-1，通過上述Caspase-1經(jīng)典焦亡通路，將焦亡信號傳遞到下游焦亡蛋白，最終發(fā)生細胞焦亡。TUNEL染色觀察顯示，電針可抑制模型大鼠腦組織細胞凋亡，但由于TUNEL染色是細胞凋亡的主要評價方法，無法特異性評價焦亡情況，因此通過Western blot和PCR實驗，進一步檢測焦亡相關(guān)分子的表達。結(jié)果表明，模型組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白和mRNA表達顯著升高，提示出現(xiàn)細胞焦亡；電針組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白和mRNA表達顯著降低，推測電針可能通過抑制NLRP3炎癥小體阻止Caspase-1活化，減少促炎因子IL-1β的分泌，抑制細胞焦亡。

綜上，電針“百會”“內(nèi)關(guān)”對腦缺血再灌注損傷大鼠可發(fā)揮神經(jīng)保護作用，其機制可能與抑制NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡，減輕CIRI有關(guān)。但電針對NLRP3炎癥小體的具體抑制途徑及對其他細胞焦亡通路的調(diào)節(jié)作用仍有待今后深入研究。