李杰，吉偉佳，楊婷婷，易路遙

江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

市場上化妝品產(chǎn)品推陳出新，琳瑯滿目，每種化妝品所含的化學(xué)組分更是種類繁多［1］，其中香料是化妝品使用較多較廣的一類添加劑，然而隨著近年來化妝品的廣泛使用，化妝品的不良反應(yīng)報(bào)道也隨之增加［2］，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，因?yàn)槭褂没瘖y品的原因而產(chǎn)生的各種不良反應(yīng)至少有35%是因?yàn)橄懔蠈?dǎo)致的［3］。

隨著大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)和過敏案例的積累，香料中的新鈴蘭醛、苔黑醛及氯化苔黑醛［4-6］這三種物質(zhì)逐漸被列入各個(gè)國家和地區(qū)的化妝品禁用物質(zhì)目錄，歐盟委員會(huì)在2017 年8 月2 日發(fā)布了（EU）2017/1410 號法規(guī)［7］，以及我國國家藥品監(jiān)督管理局在2021 年5 月28 日發(fā)布公告（2021 年第74號）［8］，均將新鈴蘭醛、苔黑醛、氯化苔黑醛列為化妝品禁用物質(zhì)。

目前國內(nèi)僅剛剛出臺了新鈴蘭醛的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有國內(nèi)文獻(xiàn)［9-13］中有用氣質(zhì)聯(lián)用法檢測塑料玩具中致敏性芳香劑、氣質(zhì)聯(lián)用法檢測化妝品中苔黑醛及氯化苔黑醛，HPLC-MS 法測定香料類過敏原物質(zhì)殘留量等可供參考，但同時(shí)檢測這三種香料的方法暫無；國外檢測標(biāo)準(zhǔn)有［14-16］歐盟CEN/TC 347 EN 16274:2012 消費(fèi)品中香料過敏原的氣質(zhì)聯(lián)用檢測方法，包括新鈴蘭醛Ⅰ（CAS 31906-04-4），但未包括新鈴蘭醛Ⅱ（CAS 51414-25-6）以及苔黑醛及氯化苔黑醛。

本研究改進(jìn)了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)方法的樣品提取，采用新型通過式SPE 柱作為凈化手段，對方法提取溶劑，凈化過程等進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，并對方法的基質(zhì)效應(yīng)，回收率，線性關(guān)系，檢出限，定量限等方法學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)，結(jié)合通用廣且能確證的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）技術(shù)［13］，建立適用于化妝品基質(zhì)檢測三種致敏香料新鈴蘭醛、苔黑醛及氯化苔黑醛含量的定性定量方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 7890A/5975 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 公司，美國），XS205DU 電子天平（METTLER TOLEDO，瑞士），ML204 電子天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；DB-17MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm，Agilent 公司，美國）；離心機(jī)（Thermo Fisher公司，美國）；渦旋混合器（IKA 公司，德國）。

新鈴蘭醛對照品（批號：111528，新鈴蘭醛Ⅰ∶新鈴蘭醛Ⅱ=72∶28），來源：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；苔黑醛對照品（批號：D494613），來源：上海洽姆儀器科技有限公司；氯化苔黑醛對照品（批號：BCBW0256），來源：Sigma 公司；甲醇（色譜純），來源：Sigma；無水Na2SO4（分析純），來源：國藥集團(tuán)；SHIMSEN Qvet-HP（2 g/6 mL），來源：日本島津。

8 批嬰幼兒護(hù)膚類化妝品（護(hù)膚霜4 批、潤膚乳4 批），8 批面膜類化妝品（保濕面膜、美白面膜等），爽膚水2 批（控油爽膚水等），均為市售所得。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的制備精密稱取新鈴蘭醛標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.1 g（精確至0.1 mg，均為新鈴蘭醛同分異構(gòu)體的混合對照品，按照歸一化法新鈴蘭醛Ⅰ∶新鈴蘭醛Ⅱ=72∶28 換算各自的濃度，樣品中測得新鈴蘭醛總量以新鈴蘭醛Ⅰ和新鈴蘭醛Ⅱ之和計(jì)），苔黑醛標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g（精確至0.1 mg），氯化苔黑醛標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g（精確至0.1 mg）至10 mL 棕色容量瓶中，甲醇定容，得到濃度為新鈴蘭醛Ⅰ7.2 mg/mL 和新鈴蘭醛Ⅱ2.8 mg/mL、苔黑醛7.66 mg/mL、氯化苔黑醛10 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于4 ℃避光保存。臨用時(shí)分別取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，用甲醇稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

1.2.2 樣品前處理精密稱取1.0 g 試樣置于10 mL容量瓶中，加入約5 mL 甲醇溶液，于超聲波清洗儀上超聲20 min，再用甲醇定容至10 mL，混勻，轉(zhuǎn)移至離心管中以8 000 r/min 高速離心10 min，取適量上清液通過2 g 無水Na2SO4脫水，取脫水后的溶液2 mL 置通過式SPE 小柱，直接收集流出液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾,濾液作為待測溶液。

陰性樣品基質(zhì)溶液：取陰性樣品按上述方法制備。

1.2.3 色譜-質(zhì)譜條件色譜柱DB-17MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），色譜條件：初始溫度為100 ℃，保持1 min 后以10 ℃/min 速率升至200 ℃；然后以5℃/min 速率升至260 ℃；再以10 ℃/min 速率升至280 ℃，保持5 min。載氣：高純氦氣，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為280 ℃；進(jìn)樣模式為分流進(jìn)樣，分流比5∶1。質(zhì)譜條件均為：離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，傳輸線溫度280 ℃ ；離子化方式為EI；電離能量為70 eV。

新鈴蘭醛Ⅰ定量離子136，定性離子192、105；新鈴蘭醛Ⅱ定量離105，定性離子118、163；苔黑醛定量離子151，定性離子106、152；氯化苔黑醛定量離子 185，定性離子186。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 基質(zhì)工作標(biāo)準(zhǔn)曲線精密量取適量“1.2.1”中各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備溶液，用甲醇稀釋至適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間使用溶液，再用按照“1.2.2”的制備方法得到的陰性樣品基質(zhì)溶液配制對應(yīng)的基質(zhì)工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)新鈴蘭醛Ⅰ的濃度范圍為0.36 μg/mL～10.80 μg/mL，新鈴蘭醛Ⅱ?yàn)?.14 μg/mL～4.20 μg/mL，苔黑醛為0.19 μg/mL～5.75 μg/mL，氯化苔黑醛為0.50 μg/mL～15.00 μg/mL。以目標(biāo)化合物的定量離子色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。三種物質(zhì)在其標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，峰面積與濃度值呈現(xiàn)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.990 0，線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.1.2 精密度取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中新鈴蘭醛Ⅰ0.36 μg/mL、新鈴蘭醛Ⅱ0.14 μg/mL、苔黑醛0.19 μg/mL、氯化苔黑醛0.50 μg/mL 溶液與新鈴蘭醛Ⅰ10.80 μg/mL、新鈴蘭醛Ⅱ4.20 μg/mL、苔黑醛5.75 μg/mL、氯化苔黑醛15.00 μg/mL 溶液，各連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算峰面積的RSD 作為低、高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的日內(nèi)精密度。計(jì)算結(jié)果RSD 均小于10%，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.1.3 回收率及重復(fù)性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)選取了霜、乳液、粉劑和液體劑4 種典型的化妝品樣品作為基質(zhì)本底，分別添加了1 倍定量限（低）、2 倍定量限（中）、10 倍定量限（高）3 個(gè)添加濃度，按前述“1.2.2”處理，分別平行制備5 份，經(jīng)測定并計(jì)算結(jié)果可知，方法對于不同化妝品基質(zhì)，霜?jiǎng)┑幕厥章试?2.5%～99.5%之間，乳劑的回收率在72.3%～98.7%之間，粉劑的回收率在70.5%～125.4%之間，液體劑的回收率在85.6%～111.7%之間，RSD 均小于10%。

2.1.4 方法的檢出濃度和最低定量濃度向霜?jiǎng)?、乳液、粉劑和液體的空白基質(zhì)中定量添加三種待測組分，按“1.2.2”處理后，測定信噪比為3∶1 時(shí)，添加的化合物的量為方法檢出濃度；測定信噪比為10∶1 時(shí)，添加的化合物的量為方法最低定量濃度。經(jīng)測定，檢出濃度為新鈴蘭醛Ⅰ1.1 mg/kg、新鈴蘭醛Ⅱ 0.4 mg/kg、苔黑醛0.6 mg/kg、氯化苔黑醛1.5 mg/kg；最低定量濃度為新鈴蘭醛Ⅰ3.6 mg/kg、新鈴蘭醛Ⅱ1.4 mg/kg、苔黑醛1.9 mg/kg、氯化苔黑醛5.0 mg/kg。

2.2 樣品測定

采用上述方法對8 批嬰幼兒護(hù)膚類化妝品，8批面膜類化妝品、爽膚水2 批開展了分析。樣品按“1.2.2”處理并測定，結(jié)果顯示，其中1 批嬰幼兒護(hù)膚霜類化妝品檢出新鈴蘭醛34.3 mg/kg。兒童嬰幼兒護(hù)膚類化妝品中存在添加致敏香料情況，需引起重視，嬰幼兒一直都是高風(fēng)險(xiǎn)人群［17］，是安全問題的易發(fā)區(qū)，鑒于我國剛剛于今年5 月更新《化妝品禁用原料目錄》［8］，嬰幼兒護(hù)膚類化妝品的香料添加使用情況需要重點(diǎn)關(guān)注。

3 討論

3.1 色譜質(zhì)譜條件的選擇和優(yōu)化

在色譜條件優(yōu)化過程中，我們針對氣相毛細(xì)管色譜柱的極性強(qiáng)弱進(jìn)行了對比，選擇了不同液膜厚度的HP-5MS 毛細(xì)管柱（0.25 μm、1.0 μm），DB-17MS 毛細(xì)管柱，DB-WAX 毛細(xì)管柱及HP-FFAP毛細(xì)管柱對三種標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行分析，其中HP-5MS 和DB-17MS 對三個(gè)目標(biāo)化合物分離最為合適，且出峰峰形較好，HP-5MS 液膜厚1.0 μm 比0.25 μm 的分離度更好，而針對三種致敏香料的分離時(shí)長來看，HP-5MS 毛細(xì)管柱對其分離耗時(shí)較DB-17MS 毛細(xì)管柱更長，故最終將DB-17MS 作為分離色譜柱。

在升溫條件優(yōu)化過程中，我們比較了多個(gè)文獻(xiàn)［14-21］的方法：若選擇起始溫度為60 ℃，會(huì)導(dǎo)致三個(gè)目標(biāo)物分離度不好且出峰時(shí)間較長，因此，我們通過抬高色譜柱DB-17MS 的初始的溫度，優(yōu)化升溫程序，使目標(biāo)物在12 min 內(nèi)即可出峰完全，且分離度良好，最后快速抬高溫度至280 ℃進(jìn)行雜質(zhì)掃尾，三個(gè)目標(biāo)物的總離子流圖詳見圖1。

圖1 GC/MS儀器條件下3種香料的總離子流圖

質(zhì)譜條件的優(yōu)化通過GC-MS 在SCAN 模式下對新鈴蘭醛、苔黑醛及氯化苔黑醛標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液進(jìn)行掃描，確定了各自的定性定量離子。

3.2 樣品提取溶劑的選擇

化妝品前處理提取溶劑常用的有甲醇和乙腈，綜合考慮適用范圍和氣相色譜分離手段，甲醇極性大，基質(zhì)的適用性更好一些，且乙腈在氣相色譜分析中一般較少使用，加之甲醇毒性稍弱一點(diǎn)，因此最后選擇了甲醇作為提取溶劑，同時(shí)增加無水硫酸鈉脫水處理步驟，最后為保護(hù)氣相毛細(xì)管色譜柱避免甲醇的溶解損傷，設(shè)置了分流比進(jìn)樣［17］。

3.3 凈化方案的優(yōu)化

3.3.1 SPE 柱的選擇為了快速且有效地凈化樣品提取液，結(jié)合文獻(xiàn)［17］采用通過式SPE 小柱來進(jìn)行凈化，為了選擇合適的固相萃取柱建立專屬性好的前處理凈化方案，我們選擇了不同品牌不同填料的SPE 柱，PRiME HLB（200 mg/6 mL）、PRiME MCX（200 mg/6 mL）、SHIMSEN Qvet-NM（2 g/6 mL）及SHIMSEN Qvet-HP（2 g/6 mL）。分別進(jìn)行4 種設(shè)計(jì)分析：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液直接過柱、樣品基質(zhì)溶液直接過柱、樣品基質(zhì)溶液過柱后添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、樣品基質(zhì)溶液添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后再過柱。實(shí)驗(yàn)選用霜?jiǎng)⑷閯?、粉劑和液體4 類化妝品作為考察基質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)過柱前和過柱后的添加量均使得最后標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)上機(jī)溶液濃度為5 μg/mL。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液直接過柱實(shí)驗(yàn)中，三個(gè)目標(biāo)物SHIMSEN Qvet-HP平均回收率為95.1%、SHIMSEN Qvet-NM 平均回收率為81.7%、PRiME MCX 平均回收率為43.5%、PRiME HLB 平均回收率為43.5%。樣品基質(zhì)溶液直接過柱實(shí)驗(yàn)中，SHIMSEN Qvet-NM 和SHIMSEN Qvet-HP 去除干擾效果較好，PRiME HLB、PRiME MCX 次之，液體基質(zhì)的3 款柱子雜峰去除干擾效果SHIMSEN Qvet-HP 要優(yōu)于SHIMSEN Qvet-NM，PRiME HLB、PRiME MCX 效果次之。樣品基質(zhì)溶液過柱后添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品基質(zhì)溶液添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后再過柱的實(shí)驗(yàn)中，通過樣品基質(zhì)溶液添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)再過柱測得的目標(biāo)物峰面積與樣品基質(zhì)溶液過柱后添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測得的目標(biāo)物峰面積之比計(jì)算回收率，通過計(jì)算，SHIMSEN Qvet-HP 回收率為85.0%～95.0%、SHIMSEN Qvet-NM 回收率為78.0%～86.0%、PRiME HLB 回收率為80.0%～90.0%，PRiME MCX 回收率為40.5%～46.0%。

綜上，可選擇SHIMSEN Qvet-HP（2 g/6 mL）作為凈化柱。同時(shí)進(jìn)一步結(jié)合基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合選擇最優(yōu)的凈化柱。

3.3.2 基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)基質(zhì)效應(yīng)（ME）的計(jì)算［17］等于“3.3.1”方案設(shè)計(jì)中樣品基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)過柱后測得目標(biāo)物的峰面積與對應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的峰面積的百分比再減去100%，若計(jì)算結(jié)果為負(fù)，則為基質(zhì)效應(yīng)抑制，若計(jì)算結(jié)果為正，則為基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRiMEMCX對霜?jiǎng)┖腿閯┑幕|(zhì)效應(yīng)有較強(qiáng)抑制（-68.1%～-45.0%），SHIMSEN Qvet-HP 有略微基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)（21.0%～9.0%），PRiME MCX 對粉劑和液體的基質(zhì)效應(yīng)為一般抑制，PRiME HLB 和SHIMSEN Qvet-HP 為略微增強(qiáng)。

綜上，最終選擇SHIMSEN Qvet-HP（2 g/6 mL）作為凈化柱。

4 結(jié)論

香料是化妝品中常見的配料之一，香料過敏會(huì)引起包括過敏性接觸性皮炎，刺激性接觸性皮炎等各種過敏反應(yīng)，導(dǎo)致皮膚紅腫、脫屑和角質(zhì)化等，長期還會(huì)引起皮膚皸裂、苔蘚化和角質(zhì)化過度等嚴(yán)重癥狀。部分商家為吸引消費(fèi)者而添加的各種香料會(huì)帶來潛在的過敏風(fēng)險(xiǎn)，因此有必要針對化妝品中常見致敏香料物質(zhì)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。

本研究建立了化妝品中三種致敏香料新鈴蘭醛、苔黑醛和氯化苔黑醛的GC-MS 測定方法。對色譜、質(zhì)譜條件及樣品提取凈化方案進(jìn)行了改進(jìn)優(yōu)化，完成了基質(zhì)效應(yīng)及方法學(xué)驗(yàn)證等評價(jià)，該分析方法前處理簡單，高效準(zhǔn)確，選擇性好，可用于化妝品中三種致敏香料含量的測定分析。