張 禾，陳燁芝，孫 翠，曹錦萍，孫崇德

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 果實品質(zhì)生物學(xué)實驗室 園藝產(chǎn)品冷鏈物流工藝與裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室浙江省園藝植物整合生物學(xué)研究與應(yīng)用重點實驗室 杭州 310058）

楊梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc.）是原產(chǎn)于我國的特色水果，其果實色澤艷麗、柔軟多汁、酸甜適口，深受消費者喜愛。目前楊梅產(chǎn)區(qū)集中分布于長江流域以南各地，包括浙江、江蘇、福建等省，其中浙江省是目前我國最大的楊梅產(chǎn)區(qū)。楊梅上市期短，浙江地區(qū)集中于6月中旬至7月初大量上市。

楊梅果實極其不耐貯運，民間素有“一日味變，二日色變，三日色味皆變”之說[1]。一方面，楊梅果實成熟期恰逢長江中、下游地區(qū)的高溫多雨季節(jié)，加上產(chǎn)地和上市期均較為集中，采收期短，給楊梅銷售造成巨大的壓力；另一方面，楊梅果實為漿果狀核果，無外果皮包被，果肉呈柱狀排列，肉柱柔嫩呈輻射狀，易受病蟲害和機械損傷[2]。除楊梅果實本身結(jié)構(gòu)造成其不耐貯運外，楊梅成熟期容易引來果蠅產(chǎn)卵于果實中，采收后果蠅幼蟲活動造成的果實傷口易受細(xì)菌和真菌的侵染。此外，楊梅果實采后代謝旺盛，在完熟期呼吸速率達(dá)到高峰，導(dǎo)致采后品質(zhì)快速劣變。以上各因素給楊梅的采后貯運和銷售帶來巨大的挑戰(zhàn)。

楊梅果實采后侵染性病害主要由真菌引起[3]。從常溫貯藏的楊梅病果中分離出桔青霉（Penicillium citrinum）、綠色木霉（Trichoderma viride）、楊梅輪帚霉（Verticiladiella abielinga （Peck） Hugh es）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等病原菌[4-5]。其中，由桔青霉侵染引起的綠霉病是楊梅中較為常見的采后病害，病果表面布滿白色菌絲，果實硬度降低。楊梅果實果肉柔軟且裸露，一般不用液態(tài)的化學(xué)保鮮劑處理。目前常用的采后保鮮方式是低溫保鮮或低溫結(jié)合氣調(diào)保鮮。

對于難以運用殺菌劑處理的漿果類水果，人們一直在積極尋求無殘留和無損傷的采后防腐手段。近年來，低溫等離子體技術(shù)在食品防腐領(lǐng)域被大量報道，也逐漸向果蔬保鮮領(lǐng)域滲透。等離子體被稱為物質(zhì)的第4 種狀態(tài)[6]。等離子體中包含大量帶電粒子（電子和離子）、自由基、中性物種（激發(fā)原子和分子）、光子（可見光、UV-A 和UV-B）和電磁場等[7-8]。低溫等離子體是等離子體的其中一種形式，其通過在氣體中放電獲得，主要通過產(chǎn)生的電子、離子、自由基、活性粒子以及UV 射線等對病原菌起殺滅作用[9]。

低溫等離子體作為一種物理殺菌方法，具有無殘留、無污染等優(yōu)點，在楊梅果實采后病原菌的防治方面具有應(yīng)用價值。本文通過研究低溫等離子體處理的楊梅果實貯藏和貨架期腐爛率變化，以及低溫等離子體的抗真菌活性測定，評估低溫等離子體對楊梅果實桔青霉的抑制作用；通過孢子活性氧（ROS）水平、線粒體膜電位和膜完整性測定，探索低溫等離子體對桔青霉抑制作用的機理，以期為低溫等離子體在楊梅果實采后病害防治中的應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

楊梅果實（‘荸薺“品種），2020年6月15日采于浙江省臺州市仙居縣；桔青霉（Penicillium citrinum），上海生物保藏中心。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、碘化丙啶（PI）、Hoechst 33342 試劑，上海源葉生物科技有限公司；活性氧（ROS）檢測試劑盒，杭州楊雅生物科技有限公司。其它試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

低溫等離子體制備設(shè)備，南京蘇曼等離子科技有限公司；激光共聚焦顯微鏡（LSM780），德國ZEISS 公司；臨界點干燥儀（HCP-2 型）、掃描電鏡（SU-8010 型）、透射電鏡（H-7650 型），日本日立（Hitachi）株式會社；超薄切片機（EM UC7 型），德國LEICA 公司；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生化恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 低溫等離子體的制備

低溫等離子體制備設(shè)備由低溫等離子體脈沖電源和低溫等離子體發(fā)生裝置兩部分構(gòu)成。低溫等離子體脈沖電源的輸出電壓范圍為10～25 kV，功率范圍為300～1 500 W。低溫等離子氣體發(fā)生裝置由不銹鋼和聚乙烯四氟等制作而成，外電極為外徑25 mm，內(nèi)徑20 mm 的石英管，內(nèi)電極是凹槽直徑為11 mm 的齒形不銹鋼電極。本研究以空氣為發(fā)生氣體，通過介質(zhì)阻擋放電產(chǎn)生等離子體，等離子放電寬度為150 mm，單邊放電間隙為3 mm。

楊梅果實低溫等離子體處理流程如圖1所示。將設(shè)備各部件連接，依次打開氣泵和等離子脈沖電源的開關(guān)并調(diào)節(jié)電流強度，即可在低溫等離子氣體發(fā)生裝置的出氣口獲得等離子體。將等離子體通入楊梅果實容器中，按照設(shè)定時間進(jìn)行密閉處理。

圖1 低溫等離子體處理流程Fig.1 Schematic diagram on the cold plasma treatment process of Chinese bayberry

1.4 病原菌培養(yǎng)和菌懸液制備

桔青霉孢子的收集根據(jù)前人方法[10]稍作改進(jìn)，將桔青霉在PDA 平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～10 d（25 ℃，RH 95%），待產(chǎn)孢后向平板中加入無菌蒸餾水，用涂布棒反復(fù)刮取病原菌孢子，收集孢子懸液于渦旋振蕩器中渦旋1 min 后，用4 層無菌紗布過濾去除孢子菌絲，收集濾液并于光學(xué)顯微鏡下計數(shù)，稀釋獲得濃度為1×106spores/mL 的菌懸液待用。

1.5 楊梅果實采收

楊梅果實于清晨采摘后，當(dāng)天運輸至浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院果樹所實驗室。挑選大小均一、成熟度一致、無機械損傷和病蟲害的楊梅果實放置于經(jīng)過消毒的楊梅果筐中待用。

1.6 低溫等離子氣體對楊梅果實貯藏性的影響

將挑選后的楊梅果實分組后放置于經(jīng)過消毒的密閉容器中，每組設(shè)置120 個楊梅果實，通入6 A 電流產(chǎn)生的低溫等離子體處理3 min 后取出，對照組（CK）中通入空氣。設(shè)置不同時間間隔處理，分別為每隔12，24，48 h 處理1 次。處理結(jié)束后將果實取出，置于恒溫冷庫中（4 ℃，RH 90%）。從貯藏的第2 天開始計算果實腐爛率，每2 d 計算1次，共計觀察2 周。

1.7 低溫等離子體體外抑菌處理

向PDA 平板培養(yǎng)基中加入100 μL 濃度為1×106spores/mL 的桔青霉懸液，使用涂布棒涂布均勻后，靜置于超凈工作臺使水分被培養(yǎng)基吸收。隨后將平板放入密閉樂扣盒中，通入低溫等離子體進(jìn)行處理，設(shè)置不同電流強度產(chǎn)生的低溫等離子體處理以及不同處理時間的對比，具體分組如下：3 A-1 min，4 A-1 min，5 A-1 min，6 A-1 min，3 A-3 min，4 A-3 min，5 A-3 min，6 A-3 min，對照組（CK）中通入空氣，每組設(shè)置6 個平板重復(fù)。處理結(jié)束后將平板取出，置于25 ℃的恒溫箱中（RH 95%）培養(yǎng)，每隔24 h 拍照記錄菌體生長情況，并用Image J 軟件測定菌落面積。

1.8 低溫等離子體體內(nèi)抑菌活性分析

將楊梅果實在2%（體積分?jǐn)?shù)） 次氯酸鈉中浸泡2 min 進(jìn)行表面消毒，無菌沖洗并風(fēng)干后接種病原菌。由于楊梅果實果肉裸露，因此接種時無需另外制造傷口，直接將10 μL 的桔青霉的孢子懸浮液（1×106spores/mL）滴加至楊梅果實赤道部位果肉表面，風(fēng)干后置于密閉容器中，通入6 A 電流產(chǎn)生的低溫等離子體，處理3 min 后取出。設(shè)置不同時間間隔處理，分別為每隔12，24，48 h 處理1次，對照組（CK）中通入空氣。處理結(jié)束后將果實取出，置于恒溫庫中（20 ℃，RH 90%），從第2 天開始每天用Image J 軟件測定病斑面積。每組設(shè)置120 個果實。

1.9 孢子壞死和凋亡分析

采用PI 和Hoechst 33342 染色法評估低溫等離子體對桔青霉細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞凋亡的作用，具體方法參照前人的方法[11-12]稍作修改。將桔青霉在PDA 平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～10 d（25 ℃，RH 95%），待產(chǎn)孢后通入3 A 電流產(chǎn)生的低溫等離子體進(jìn)行處理，處理時間分別為1 min 和3 min，每組設(shè)置6 個平板重復(fù)，處理結(jié)束后取出，刮取孢子制備懸液。在1 mL 菌懸液中加入10 μL 質(zhì)量濃度為20 mg/L 的PI 染液或10 μL 質(zhì)量濃度為20 mg/L 的Hoechst 33342 染液，于黑暗條件下室溫孵育15 min 后，用激光共聚焦顯微鏡觀察、檢測細(xì)胞膜的完整性和細(xì)胞凋亡情況。

1.10 孢子ROS 檢測

采用DCFH-DA 染色法評估低溫等離子體對桔青霉孢子ROS 的誘導(dǎo)作用。等離子體處理和孢子懸液的制備方法同1.7 節(jié)，每組設(shè)置6 個平板重復(fù)。染色方法參照前人的方法[13]稍作修改。將孢子懸液進(jìn)行離心收集孢子，用磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0） 漂洗2 次后，重懸于20 μmol/LDCFH-DA 中，在28 ℃黑暗條件下孵育20 min 后，再次用磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）漂洗去除多余的染料，用激光共聚焦顯微鏡觀測ROS 水平。

1.11 掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）觀測

分別采用SEM 和TEM 評估低溫等離子體對桔青霉孢子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響。每組設(shè)置6個平板重復(fù)。掃描電鏡孢子樣品的獲取方法同1.7節(jié)，樣品在2.5%的戊二醛溶液中4 ℃固定過夜；倒掉固定液，用磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）漂洗樣品3 次；用1%的鋨酸溶液固定樣品；去除鋨酸廢液，用磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）漂洗樣品3 次；依次用體積分?jǐn)?shù)30%，50%，70%，80%，90%，95%的乙醇和無水乙醇對樣品進(jìn)行脫水處理，最后樣品用無水乙醇重懸后，在臨界點干燥儀中進(jìn)行干燥。干燥后的樣品進(jìn)行鍍膜處理，置于掃描電鏡下觀察。

透射電鏡樣品的固定和漂洗處理與掃描電鏡

的樣品處理類似，之后依次用體積分?jǐn)?shù)30%，50%，70%，80%的乙醇溶液對樣品進(jìn)行脫水處理，隨后過渡到90%和95%的丙酮溶液中，最后用純丙酮處理2 次。依次先后用Spurr 包埋劑與丙酮1∶1（體積比）和1∶3（體積比）混合液對樣品進(jìn)行滲透處理；最后在室溫下純包埋劑處理樣品過夜。將經(jīng)過滲透處理的樣品包埋起來，70 ℃加熱過夜，即得到包埋好的樣品；在超薄切片機中切片，經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色5～10 min；最后在透射電鏡下觀察。

1.12 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用“平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件（SPSS 公司，美國）對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差（One-way ANOVA）分析，并用Duncan 檢驗進(jìn)行多重比較差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 低溫等離子體對楊梅果實腐爛率的影響

楊梅果實在4 ℃貯藏條件下的腐爛率隨著貯藏時間的延長而增加。對照組在貯藏到第15 天時腐爛率達(dá)到了34.67%，而經(jīng)等離子氣體處理的楊梅果實腐爛率與對照組相比有了明顯降低，處理時間間隔為12，24，36，48 h 的處理組腐爛率分別為11.33%，12.00%，15.33%，28.67%，較對照組分別降低了23.34%，22.67%，19.34%，6.00%（圖2）。由此可見，低溫等離子氣體對楊梅果實有較好的降腐效果，并且處理時間的間隔越短，效果越明顯。

圖2 低溫等離子體對楊梅果實腐爛率的影響Fig.2 Effect of cold plasma on the decay rate of Chinese bayberry

2.2 低溫等離子體對桔青霉侵染的楊梅果實病程的影響

桔青霉侵染楊梅果實后，病斑擴(kuò)展迅速。如圖3a 所示，接菌24 h 后對照組果實的菌斑面積就已經(jīng)達(dá)到果面面積的52.00%，菌斑呈不規(guī)則形狀，表面產(chǎn)生大量深綠色的孢子，外沿可見一圈白色菌絲。6 A 電流所產(chǎn)生的低溫等離子體顯著抑制了楊梅果實桔青霉病斑的擴(kuò)展，并且其抑制效果隨處理頻次的增加而增強。處理時間間隔越短，病斑的面積越小且病程明顯減緩，如圖3b 所示，在接種后第2 天，等離子體處理間隔為48，24，12 h組的果實病斑面積與對照組相比分別縮小了20%，45%，49%（P<0.05），其中，間隔24 h 處理組與間隔12 h 處理組之間病斑面積無顯著性差異（P>0.05）。因此，采用6 A 電流所產(chǎn)生的低溫等離子體每24 h 處理果實1 次對于桔青霉引起的楊梅果實病害防控最為經(jīng)濟(jì)、有效。桔青霉在楊梅果實中的發(fā)病似乎有一定的自限性，各處理組的病斑面積隨著時間的推移并無明顯擴(kuò)散跡象。

圖3 低溫等離子體對桔青霉侵染的楊梅果實病程的影響Fig.3 The inhibition effects of cold plasma treatment on the disease progression of P.citrinum inoculated Chinese bayberry

2.3 低溫等離子體對桔青霉的體外抑制作用

低溫等離子體可以顯著抑制桔青霉在平板上的生長，并且其抑制作用與制備低溫等離子體的電流強度呈正相關(guān)。此外，低溫等離子體的處理時間越長，對桔青霉的抑制效果越好（圖4a 和4c）。3～6 A 電流所產(chǎn)生的低溫等離子體處理1 min，能抑制絕大多數(shù)桔青霉菌體生長，而仍有少量菌體未被殺滅，在平板中可見零星生長的菌落；而將處理時間延長至3 min 時，5 A 和6 A 電流所產(chǎn)生的低溫等離子體處理組的桔青霉生長完全被抑制，培養(yǎng)第4 天平板中仍未有肉眼可見的菌落（圖4b 和4d）。因此，5 A 以上的電流強度下產(chǎn)生的等離子體處理3 min 以上，對桔青霉能起到較為徹底的抑制效果。

圖4 低溫等離子氣體對桔青霉的體外抑制作用Fig.4 The inhibition effects of cold plasma treatment on the growth of P.citrinum in vitro

2.4 低溫等離子體對桔青霉孢子壞死和凋亡的誘導(dǎo)作用

進(jìn)一步采用PI 和Hoechst 33342 兩種熒光指示劑聯(lián)合評估低溫等離子體對桔青霉孢子的壞死和凋亡的誘導(dǎo)作用。PI 雖不能通過活細(xì)胞膜，但它可以穿過受損的細(xì)胞膜并使細(xì)胞核物質(zhì)染色。如圖5a 和圖5b 所示，經(jīng)過3 A 電流所產(chǎn)生的低溫等離子氣體處理1 min 后，有38.46%的孢子被PI染色，處理3 min 后則有91.33%的孢子被染色，表明低溫等離子體處理后桔青霉孢子的細(xì)胞膜出現(xiàn)了損傷，而且處理時間越長其效果越強。

熒光染料Hoechst 33342 能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜，使其染上的藍(lán)色熒光強度較低，而凋亡細(xì)胞的膜通透性增強，因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33342 比正常細(xì)胞中的多，熒光強度要比正常細(xì)胞中要高，此外，凋亡細(xì)胞的染色體DNA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，從而使該染料能更有效地與DNA 結(jié)合，并且凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷，不能有效地將Hoechst 33342 排出到細(xì)胞外，使之在細(xì)胞內(nèi)積累增加等，都使凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光增強。如圖5c 和圖5d 所示，經(jīng)過3 A 電流所產(chǎn)生的低溫等離子氣體處理1 min 和3 min 后，Hoechst 33342 染色陽性的細(xì)胞分別達(dá)到84.44%和92.09%，處理1 min 和3 min 的效果無顯著差異（P<0.05）。由此可以推測，在低強度的等離子體短時間處理條件下，可以造成桔青霉孢子的凋亡。

圖5 低溫等離子體對桔青霉孢子壞死和凋亡的誘導(dǎo)作用Fig.5 The induction effects of cold plasma on the necrosis and apoptosis of P.citrinum spore

2.5 低溫等離子氣體對桔青霉孢子ROS 積累的誘導(dǎo)作用

采用DCFH-DA 熒光染料評估低溫等離子體對桔青霉孢子ROS 水平的影響。如圖6a 所示，等離子體處理后，帶綠色熒光信號的桔青霉孢子數(shù)量顯著增加（P<0.05），而對照組孢子未見綠色熒光信號，表明等離子體處理顯著誘導(dǎo)了桔青霉孢子內(nèi)ROS 的積累。統(tǒng)計結(jié)果表明，等離子氣體處理1 min 后DCFH-DA 染色陽性的孢子比例為26.79%，而當(dāng)處理時間延長至3 min，這一比例上升至82.28%，組間差異顯著（P<0.05）（圖6b）。該結(jié)果表明，等離子體處理對桔青霉孢子內(nèi)ROS 的誘導(dǎo)作用隨著處理時間的延長而增強。

圖6 低溫等離子氣體對桔青霉孢子ROS 積累的誘導(dǎo)作用Fig.6 The induction effects of cold plasma on ROS accumulation in P.citrinum spores

2.6 低溫等離子體對桔青霉孢子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響

經(jīng)低溫等離子體處理后的桔青霉孢子的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。SEM 觀測結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的桔青霉孢子呈飽滿的規(guī)則橢圓球狀，3 A電流產(chǎn)生的低溫等離子體處理1 min 后，孢子表面雖出現(xiàn)破裂的痕跡，但仍保持著基本形狀。而當(dāng)處理時間延長至3 min，孢子發(fā)生破裂，結(jié)構(gòu)被完全破壞（圖7）。

圖7 低溫等離子體處理后桔青霉孢子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的變化Fig.7 Changes of morphology and ultrastructure of P.citrinum spore after cold plasma treatment

進(jìn)而采用TEM 對孢子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的孢子細(xì)胞壁完整光滑，細(xì)胞核也呈現(xiàn)規(guī)則的圓形，而經(jīng)過3 A 電流產(chǎn)生的低溫等離子體1 min 和3 min 處理的孢子均出現(xiàn)了明顯的形態(tài)變化，如細(xì)胞壁破裂，細(xì)胞核萎縮，胞質(zhì)外泄，核膜和細(xì)胞器模糊等。

3 討論

針對楊梅采后問題，前人開展了低溫貯藏技術(shù)、氣調(diào)貯藏技術(shù)、熱處理技術(shù)、外源物質(zhì)保鮮技術(shù)等方面的研究[14-15]。在實際生產(chǎn)中，目前最常使用的技術(shù)為低溫貯藏結(jié)合減壓保鮮技術(shù)。王威等[16]通過預(yù)冷與1-MCP 處理結(jié)合的方式能在5 d 內(nèi)維持楊梅果實貨架期腐爛率低于10%；龍杰[15]采用減壓處理的方法對楊梅果實進(jìn)行保鮮，發(fā)現(xiàn)處理9 d 后果實腐爛率與對照差異不顯著。本研究采用低溫等離子體對楊梅果實進(jìn)行采后貯藏期間間歇性處理的方法，使果實在貯藏第7 天的腐爛率仍維持4%以下，遠(yuǎn)低于對照組（10.67%）。處理間歇時間越短，防腐效果越好，并且隨著貯藏時間的延長，處理組與對照組之間的差異顯著。其中，間歇12 h 處理組貯藏第13 天的腐爛率低于10%，顯著優(yōu)于對照組（32%），也優(yōu)于前人所報道的預(yù)冷結(jié)合1-MCP 處理和減壓處理。前人也嘗試?yán)玫入x子體的其它形態(tài)對楊梅進(jìn)行保鮮研究。Ma 等[17]利用低溫等離子活化水（介質(zhì)阻擋放電）浸泡楊梅果實，發(fā)現(xiàn)浸泡2 min 后的果實在3 ℃貯藏8 d 后腐爛率為21.05%，較清水浸泡的對照組腐爛率（45.67%）顯著下降。然而浸泡處理后還需經(jīng)過吹干等步驟，考慮到楊梅屬于無果皮包被的漿果，不利于其后續(xù)處理和防腐保鮮。相較之下，本研究所采用的低溫等離子體為氣體形態(tài)，處理方便且無殘留，更加適用于楊梅等易受損傷的漿果類果實。

低溫等離子體對果實的防腐保鮮效應(yīng)與其抑菌效果有關(guān)。前人已有大量的研究報道低溫等離子體技術(shù)對細(xì)菌和真菌等具有抑制或殺滅效果。在抑制細(xì)菌方面，Kelly-wintenberg 等[18]報道了輝光放電等離子體能有效殺滅聚丙烯表面的嗜熱脂肪桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌；李振鋼等[19]報道了APPJ 氬氣常壓低溫射頻等離子體可快速有效地殺滅大腸埃希菌。在抑制真菌方面，季龍飛[20]發(fā)現(xiàn)等離子體處理對白色念珠菌具有明顯的抑制效果。等離子體對于果蔬病原菌的抑制作用，也有相應(yīng)的報道。王卓等[21]用低溫等離子體處理藍(lán)莓，使果實表面細(xì)菌和真菌數(shù)量分別下降1.75 lg（CFU/g）和1.77 lg（CFU/g）；氣體沿面放電低溫等離子體對蘋果和獼猴桃等果實的主要致病菌擴(kuò)展青霉（P.expansum）也有非常好的殺滅效果，且等離子體處理時間越長殺菌效果越好[22]；張花利[23]的研究發(fā)現(xiàn)低溫射頻等離子體在最佳條件下對灰霉菌（Botrytis cinerea）的殺滅作用幾乎達(dá)到了100%。目前關(guān)于等離子體對楊梅果實病原菌的殺滅作用研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)低溫等離子體對楊梅果實主要病原菌桔青霉具有良好的殺滅效果，當(dāng)強度達(dá)到一定程度時，能100%抑制桔青霉。該研究結(jié)果進(jìn)一步完善了低溫等離子體的抑菌譜，也擴(kuò)大了低溫等離子體的應(yīng)用范圍。

關(guān)于等離子體對致病菌的滅活原理，有學(xué)者提出細(xì)胞膜破裂說，即當(dāng)?shù)入x子體活性組分作用于致病菌細(xì)胞膜時，或是氧化細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層、膜蛋白以及膜脂質(zhì)等，或是積累電荷造成細(xì)胞膜破裂，致使細(xì)胞膜表現(xiàn)形成結(jié)構(gòu)性缺陷或穿孔。致使更多的等離子體活性組分進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，細(xì)胞膜內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器泄漏出來[24]。前人的研究主要通過PI 染色檢測孢子壞死情況以及電鏡觀察孢子的超微結(jié)構(gòu)變化來研究等離子體殺菌的作用機理。等離子處理后的白色念珠菌在透射電鏡和掃描電鏡下可觀察到表面皺縮、凹陷，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破裂，胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)外溢等現(xiàn)象[25]；等離子體處理后的金黃色葡萄球菌PI 染色呈陽性[26]；本研究中發(fā)現(xiàn)低溫等離子體處理后，桔青霉的超微結(jié)構(gòu)變化和PI 染色結(jié)果與前人報道的現(xiàn)象一致，表面低溫等離子氣體能迅速破壞桔青霉細(xì)胞結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重影響菌體活力。在本研究中，還進(jìn)一步采用了熒光染料Hoechst 33342 對桔青霉的孢子凋亡情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)等離子體處理1 min就能夠誘導(dǎo)大部分的桔青霉孢子凋亡。細(xì)胞內(nèi)ROS（包括超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基和單線態(tài)氧等） 的產(chǎn)生和消除失調(diào)導(dǎo)致的 “氧化應(yīng)激”被認(rèn)為是造成細(xì)胞成分被破壞、微生物死亡的重要原因[27-28]。由于等離子體中也存在大量的ROS成分[9]，前人的研究發(fā)現(xiàn)低溫等離子體誘導(dǎo)了黃曲霉孢子中ROS 的產(chǎn)生[29]，本研究也采用DCFHDA 染色法檢測了等離子體對桔青霉ROS 的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)低溫等離子體處理后的桔青霉孢子內(nèi)積累了大量的ROS，這與前人對黃曲霉的研究結(jié)果一致，表明低溫等離子體對桔青霉凋亡的誘導(dǎo)作用與ROS 的積累有關(guān)。

4 結(jié)論

低溫等離子體可通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS 積累，破壞細(xì)胞膜的完整性，誘導(dǎo)孢子凋亡來抑制楊梅果實主要病原菌——桔青霉，從而降低楊梅果實貯藏期間的腐爛率。相較于傳統(tǒng)的楊梅保鮮方法，低溫等離子體具有處理方法簡便、無殘留、可與低溫貯藏庫整合使用等優(yōu)點，在楊梅果實中具有潛在的應(yīng)用價值，同時也為其它易損傷、難保鮮的漿果類采后病害防治提供了一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的策略。