周佳偉，張 宇，吳俊靜，喬 木，徐 忠，李梓芃，楊前平，彭先文，梅書棋

（動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢 430064）

乳頭數(shù)是評估母豬泌乳能力的重要指標(biāo)，影響仔豬斷奶存活率，是提高斷奶仔豬頭數(shù)的有效途徑。在選育過程中，隨著母豬產(chǎn)仔數(shù)提高，母豬乳頭數(shù)性狀的選育也引起了育種人的重視。不同品種豬的乳頭數(shù)差異較大，大白豬的總?cè)轭^數(shù)14 個左右，杜洛克在10～12 個，而我國地方豬種二花臉豬的總?cè)轭^數(shù)最高達到25個。乳頭數(shù)遺傳力在0.1～0.4，屬于中等遺傳力性狀。Hong 等報道大白豬總?cè)轭^數(shù)遺傳力為0.22，Lee 等報道大白豬總?cè)轭^數(shù)遺傳力為0.41。不同品系杜洛克豬總?cè)轭^數(shù)遺傳力在0.1～0.4，我國地方豬種清平豬的總?cè)轭^數(shù)遺傳力為0.36。

全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）被廣泛應(yīng)用于重要經(jīng)濟性狀相關(guān)SNP 的挖掘與鑒定。Moscatelli 等在大白豬SSC7 鑒定到2 個影響總?cè)轭^數(shù)的SNP，1 個影響左乳頭數(shù)的SNP，2 個影響右乳頭數(shù)的SNP。Uzzaman等在大白豬SSC8 和SSC13 上分別鑒定到2 個和1 個與乳頭數(shù)相關(guān)的SNP。Zhuang 等在SSC18 之外的17 對染色體上均鑒定到了與杜洛克豬乳頭數(shù)相關(guān)的SNP，其中SSC7 上鑒定到的位點數(shù)最多，篩選到等候選基因。本研究以944 頭加系大白豬為研究材料，對左、右和總?cè)轭^數(shù)進行GWAS 分析，鑒定與加系大白母豬乳頭數(shù)性狀相關(guān)的SNP 及候選基因，為乳頭數(shù)性狀的育種提供新的分子標(biāo)記，加快乳頭數(shù)性狀的選育。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和表型數(shù)據(jù) 本研究中的944 頭加系大白豬來源于貴州某場，出生日期為2020 年1 月—2020 年6 月，來自12 個血統(tǒng)，每個血統(tǒng)的頭數(shù)、左乳頭數(shù)、右乳頭數(shù)和總?cè)轭^數(shù)的均值見表1。母豬分娩時采集耳組織樣品，記錄其左乳頭數(shù)、右乳頭數(shù)和總?cè)轭^數(shù)。

表1 944 頭大白豬群體的基本信息

1.2 基因分型 采用動物組織DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號DP304）提取耳組織的基因組DNA。使用NanoDrop 2000 分光光度計檢測DNA 濃度，利用1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量。將檢測合格樣品的DNA 稀釋至50 ng/μL 左右，送樣至北京康普森生物技術(shù)有限公司“中芯一號”芯片檢測。

1.3 基因型數(shù)據(jù)質(zhì)控 采用PLINK v1.9進行質(zhì)量控制。篩選標(biāo)準(zhǔn)為：①剔除最小等位基因頻率MAF<5%的位點；②剔除樣本檢出率小于95%，SNP 檢出率小于90%；③剔除沒有對應(yīng)到豬參考基因組位置的位點和Y 染色體上的位點。共保留944 頭豬和39 653 個SNP用于后續(xù)研究。

1.4 遺傳參數(shù)估計模型 本研究使用以下模型進行乳頭數(shù)性狀的遺傳力估計，使用GCTA 軟件進行GREML分析：

式中，y 表示乳頭數(shù)性狀的表型向量，b 表示固定效應(yīng)向量，g 表示每個個體的隨機多基因效應(yīng)向量，X 和Z分別對應(yīng)b 和g 的關(guān)聯(lián)矩陣，e 表示乳頭數(shù)性狀的殘差。

1.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析 本研究采用rMVP 軟件進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，利用軟件中的廣義線性模型（GLM），將前5 個PCA、初生年、季節(jié)、血統(tǒng)因素分別作為固定效應(yīng)加在關(guān)聯(lián)分析模型中，本實驗采用的關(guān)聯(lián)分析模型如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 乳頭數(shù)統(tǒng)計及遺傳力分析 通過對944 頭大白豬的乳頭數(shù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如表2 所示，左乳頭數(shù)在6～10，右乳頭數(shù)在5～9，總?cè)轭^數(shù)在11～19；左、右、總?cè)轭^數(shù)的平均值分別為（7.05±0.53）、（7.08±0.57）、（14.14±0.92）。進一步對以上3 個性狀進行遺傳力分析，發(fā)現(xiàn)遺傳力均在0.1～0.2，其中左乳頭數(shù)遺傳力為0.1，右乳頭數(shù)遺傳力為0.12，總?cè)轭^數(shù)遺傳力為0.16（表3）。

表2 左、右和總?cè)轭^數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果

表3 左、右和總?cè)轭^數(shù)遺傳力

2.2 主成分分析 利用“中芯一號”芯片檢測數(shù)據(jù)經(jīng)PLINK 質(zhì)控后得到944 個有效個體及39 653 個有效SNP 位點，用于后續(xù)分析。通過主成分分析，繪制基于前兩個特征向量的主成分分析圖（圖1），結(jié)果表明群體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，僅有少數(shù)個體表現(xiàn)出群體分層。因此，須在廣義線性模型（GLM）中加入相應(yīng)主成分進行矯正，以減少關(guān)聯(lián)分析出現(xiàn)假陽性。

圖1 群體結(jié)構(gòu)PCA 圖

2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析 利用rMVP 軟件包中的GLM方法對左乳頭數(shù)、右乳頭數(shù)和總?cè)轭^數(shù)3 個性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如圖2 所示，左乳頭數(shù)、右乳頭數(shù)、總?cè)轭^數(shù)分別得到4、1、4 個基因組顯著的SNP，6、8、11 個潛在顯著的SNP，去除重復(fù)的SNP 后，共獲得4 個基因組顯著的SNP，21 個潛在顯著的SNP。這些SNP 分布在SSC3、SSC4、SSC6、SSC7、SSC9、SSC11、SSC13 上，4 個基因組顯著的SNP 位點，均位于SSC7 上。

圖2 乳頭數(shù)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖

進一步對SSC7 上4 個基因組顯著和5 個潛在顯著的SNP 位點上下游200 kb 進行候選基因分析。如表4～6所示，1 個SNP 位于SSC7 的14 124 612 bp 處，剩余的8個位點的距離較近，從96 646 705 bp 至104 914 125 bp。其中chr7:14124612 位點附近存在等5 個基因，chr7:96646705、chr7:97430037、chr7:97614602 位點附近存在等12 個基因，chr7:101888771、chr7:102041850、chr7:103232787、chr7:103574383、chr7:104914125 等5 個位點附近發(fā)現(xiàn)等22 個基因，其中被廣泛報道與乳頭數(shù)性狀密切相關(guān)。

表4 左乳頭數(shù)顯著關(guān)聯(lián)SNP 位點及候選基因信息

3 討 論

乳頭數(shù)是豬重要經(jīng)濟性狀，與母豬繁殖性狀密切相關(guān)。國內(nèi)外研究者對不同品種和品系的豬相繼開展了乳頭數(shù)性狀相關(guān)QTL 的鑒定，但關(guān)于加系大白豬乳頭數(shù)相關(guān)QTL 的研究較少。本研究對944 頭加系大白母豬乳頭數(shù)性狀開展了GWAS 研究，旨在找到影響加系大白豬乳頭數(shù)的SNP，為加系大白豬乳頭數(shù)選育提供新的分子標(biāo)記和候選基因。

本研究使用的加系大白豬群體左、右和總?cè)轭^數(shù)的平均值分別為7.05、7.08 和14.14 個，與前人報道的大白豬乳頭數(shù)相似。豬乳頭數(shù)性狀的遺傳力為中等遺傳力，遺傳力為0.1～0.4。本研究加系大白豬群體左、右和總?cè)轭^數(shù)的遺傳力分別為0.1、0.12 和0.16，略低于前人報道的乳頭數(shù)遺傳力，可能與大白豬的品系差異有關(guān)。

在主成分分析中發(fā)現(xiàn)左下角個體表現(xiàn)出群體分層，進一步查看這部分個體的系譜信息，發(fā)現(xiàn)這些個體同屬于11 號血統(tǒng)，通過乳頭數(shù)性狀與血統(tǒng)因素的廣義線性模型分析，發(fā)現(xiàn)不同血統(tǒng)個體的乳頭數(shù)存在差異。因此，在GWAS 分析模型中，將排名前5 的PCA、初生年、季節(jié)及血統(tǒng)作為固定效應(yīng)加在關(guān)聯(lián)分析模型中。

通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，在SSC3、SSC4、SSC6、SSC7、SSC9、SSC11、SSC13 上找到了25 個與乳頭數(shù)性狀基因組水平顯著相關(guān)或潛在顯著相關(guān)的SNP。本研究發(fā)現(xiàn)的4 個基因組水平顯著相關(guān)的SNP 均位于SSC7上，其中3 個SNP 位于SSC7 的97.6～102.0 Mb。值得注意的是，SSC7 上97614602（A

表5 右乳頭數(shù)顯著關(guān)聯(lián)SNP 位點及候選基因信息

綜上，豬乳頭數(shù)性狀的調(diào)控機制復(fù)雜，在多個染色體上均定位到與其相關(guān)的SNP，并獲得了多個重要候選基因，但具體的分子機制仍有待后續(xù)研究，本研究將為乳頭數(shù)的遺傳改良提供參考。

4 結(jié) 論

本研究利用“中芯一號”芯片分析加系大白豬乳頭數(shù)性狀的遺傳機制，發(fā)現(xiàn)左、右和總?cè)轭^數(shù)的遺傳力分別為0.1、0.12 和0.16，屬于中低遺傳力。通過全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法，在SSC7 上鑒定到4 個與乳頭數(shù)性狀基因組水平顯著相關(guān)的SNP，并在SSC3、SSC4、SSC6、SSC7、SSC9、SSC11、SSC13 上共鑒定到21個與乳頭數(shù)性狀潛在顯著相關(guān)的SNP。進一步掃描25個顯著相關(guān)的位點上下游200 kb 內(nèi)的基因，獲得84個候選基因，SSC7 上獲得39 個候選基因，其中包括等候選基因，關(guān)于部分候選基因的功能及分子機制還有待進一步研究。

表6 總?cè)轭^數(shù)顯著關(guān)聯(lián)SNP 位點及候選基因信息