閆婷，古麗妮尕爾·阿里木，朱麗君，張琳雪，張學(xué)良，努爾尼沙·阿力甫

(新疆醫(yī)科大學(xué)a.公共衛(wèi)生學(xué)院，b.醫(yī)學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830011)

宮頸癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤之一，2020年全球新發(fā)宮頸癌約60萬例，死亡30余萬例[1-3]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是誘發(fā)宮頸癌的主要因素之一，持續(xù)的高危型HPV感染可增加宮頸癌的發(fā)生率[4]，嚴(yán)重危害女性身心健康。目前，治療宮頸癌的主要方法有手術(shù)、放療、化療以及放化療協(xié)同治療[5]，但均對(duì)正常組織造成較大損傷，且不良反應(yīng)較多[6-7]。此外，宮頸癌診斷中常使用傳統(tǒng)成像方法(B超、CT和磁共振成像等)進(jìn)行輔助診斷，但這些成像技術(shù)存在輻射大、軟組織顯影分辨率差、耗時(shí)長(zhǎng)[8-9]等不足。因此，尋求安全、高效、清晰成像的宮頸癌診療方式顯得十分重要。

光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)作為一種新型癌癥治療方法，具有非侵入性和可定向性的優(yōu)勢(shì)[10]。與傳統(tǒng)治療方法相比，PDT借助光敏劑治療對(duì)正常組織損傷較小、生物安全性較高，且僅在腫瘤病灶區(qū)域表現(xiàn)出高攝取信號(hào)，近年逐漸受到關(guān)注。同時(shí)，光敏劑輔助的熒光成像不僅具有靈敏度和分辨率高等特點(diǎn)[11]，還能夠?qū)崿F(xiàn)成像引導(dǎo)下的精準(zhǔn)治療，是具有良好應(yīng)用前景的生物醫(yī)學(xué)診療方式。隨著對(duì)光敏劑的不斷研究，第一代光敏劑血卟啉衍生物已廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤治療。第二代光敏劑卟吩、鈦菁等部分克服了第一代光敏劑的眾多缺點(diǎn)，現(xiàn)已進(jìn)入臨床研究階段。第三代光敏劑以第二代光敏劑為基礎(chǔ)，進(jìn)一步優(yōu)化其修飾基團(tuán)，能夠獲得更理想的成像效果。近紅外熒光成像作為一種新發(fā)展的醫(yī)學(xué)影像成像方式，與傳統(tǒng)成像方式相比，其信噪比、時(shí)空分辨率、靈敏度均較高，且具有深層組織成像能力。使用光敏劑的近紅外熒光成像在臨床腫瘤的輔助診斷和光療法中顯示出巨大的應(yīng)用潛力。現(xiàn)就近紅外熒光成像技術(shù)引導(dǎo)下PDT在宮頸癌中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 PDT概述

1.1PDT的方法 在PDT過程中，使用特定波長(zhǎng)的激光照射通過注射光敏劑的腫瘤病灶區(qū)域，以激發(fā)光敏劑能量轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生對(duì)癌細(xì)胞具有毒性作用的活性氧[12-13]。與傳統(tǒng)放療和化療相比，PDT具有對(duì)病灶周圍正常組織損傷小、可重復(fù)治療、無副作用等優(yōu)勢(shì)。近紅外熒光成像已逐漸成為醫(yī)學(xué)成像的研究熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)可見光相比，近紅外激發(fā)光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)、散射更小、生物體組織穿透力更強(qiáng)[14-15]。此外，近紅外熒光成像技術(shù)具有高時(shí)空分辨率、低自發(fā)熒光背景干擾、高對(duì)比度和高靈敏度[16]等優(yōu)點(diǎn)，在提升醫(yī)學(xué)成像質(zhì)量、確保精準(zhǔn)腫瘤診斷等方面有巨大的應(yīng)用價(jià)值。因此，生物安全性可靠且發(fā)光的光敏劑與長(zhǎng)波長(zhǎng)的近紅外光源組合使用能夠殺死癌細(xì)胞，為宮頸癌的診療提供新的技術(shù)手段。

1.2PDT的三要素 PDT的三要素為激光、光敏劑、活性氧。其中，激光為PDT的第一要素，故選擇合適的激光尤為重要。傳統(tǒng)可見激光能量低、散射強(qiáng)[17-18]，不足以很好地實(shí)現(xiàn)成像引導(dǎo)下的PDT。近紅外激光的波長(zhǎng)較長(zhǎng)，能改善傳統(tǒng)激光光散射強(qiáng)的缺點(diǎn)，且可穿透更深層組織，進(jìn)而激發(fā)更多光敏劑富集區(qū)域。光敏劑是PDT的第二要素，主要包含有機(jī)光敏劑和無機(jī)光敏劑[19]，其中無機(jī)光敏劑主要有碳納米管、半導(dǎo)體量子點(diǎn)和摻雜稀土的發(fā)光納米材料等，然而無機(jī)光敏劑潛在的毒性問題使其應(yīng)用受到限制[20]。有機(jī)光敏劑主要包括有機(jī)小分子和有機(jī)納米顆粒，具有良好的生物兼容性、低毒性，可實(shí)現(xiàn)高清晰度的生物體成像[21-23]?；钚匝踝鳛镻DT的第三要素，經(jīng)激光照射后，光敏劑由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，將能量傳遞給周圍的氧分子，從而形成活性氧，光敏劑三重態(tài)發(fā)生電子轉(zhuǎn)移形成自由基陰離子和超氧化物(稱為Ⅰ型反應(yīng))，或與基態(tài)分子氧發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生單線態(tài)氧(1O2，稱為Ⅱ型反應(yīng))[24]，即產(chǎn)生活性氧，最終引起癌細(xì)胞損傷乃至凋亡，以達(dá)到治療腫瘤的目的[25-27]?；钚匝醯漠a(chǎn)生主要基于光敏劑與激光的共同作用，光敏劑具有近紅外熒光特性，經(jīng)激發(fā)后可實(shí)現(xiàn)近紅外熒光成像并提高活性氧產(chǎn)生率，從而更好地實(shí)現(xiàn)近紅外熒光成像引導(dǎo)下高質(zhì)量的PDT。

2 有機(jī)光敏劑輔助的PDT在宮頸癌中的應(yīng)用

有機(jī)光敏劑憑借良好的生物相容性、低毒性以及獨(dú)特的熒光特性，可輔助近紅外熒光成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)高時(shí)空分辨率、成像清晰、高靈敏度的PDT，可避免無機(jī)光敏劑的潛在毒性，并實(shí)現(xiàn)宮頸癌治療的高效癌細(xì)胞消融與高質(zhì)量成像。常用的3種典型近紅外有機(jī)光敏劑主要有原卟啉Ⅸ(proto-porphyrin Ⅸ，PPⅨ)、二氫卟吩e6(chlorin e6，Ce6)和聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aggregation-induced emission，AIE)有機(jī)納米顆粒等。

2.1PPⅨ光敏劑 PPⅨ是人體組織細(xì)胞正常成分，美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)其作為光敏劑[28]，基于PPⅨ的有效積累可抑制癌細(xì)胞的增殖，PPⅨ與其他粒子聯(lián)合可實(shí)現(xiàn)PPⅨ的外源性補(bǔ)充，且小劑量光敏劑即可抑制癌細(xì)胞增長(zhǎng)，進(jìn)一步增強(qiáng)PDT作用。近紅外有機(jī)光敏劑PPⅨ及其應(yīng)用見表1。

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulonic acid，5-ALA)是血紅素前體，其本身沒有光敏劑的特性，但可在人體內(nèi)與酶發(fā)生反應(yīng)并轉(zhuǎn)化為PPⅨ。PPⅨ作為一種內(nèi)源性光敏劑，借助激光可在腫瘤區(qū)域發(fā)生PDT，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，還具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)。Rossi等[32]對(duì)5-ALA介導(dǎo)的PDT在婦科腫瘤中作用的研究顯示，在600～700 nm激光照射下，HeLa、MDA-MB-231等

表1 近紅外有機(jī)光敏劑PPⅨ及其應(yīng)用

6種細(xì)胞線粒體中觀察到光敏劑的發(fā)光和亞細(xì)胞的損傷，并在6種細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)5-ALA誘導(dǎo)的PPⅨ有效積累，在光能量>15 J/cm2時(shí)，可獲得至少3個(gè)對(duì)數(shù)的細(xì)胞殺傷率，這為腫瘤細(xì)胞內(nèi)光敏劑的有效聚集提供了依據(jù)。經(jīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)化后，光敏劑仍具有明顯的熒光信號(hào)，且與療效顯著相關(guān)。PPⅨ與激光共同作用才可完成PDT，PPⅨ在人體內(nèi)通過酶反應(yīng)產(chǎn)生，但若沒有激光或自然光的照射，并不能發(fā)生PDT，表明光敏劑與激光照射在PDT過程中缺一不可。Xie等[33]采用100 mW/cm2、635 nm波長(zhǎng)激光治療生殖器尖銳濕疣30 min，結(jié)果顯示，ALA-PDT可以劑量依賴方式抑制HeLa細(xì)胞增殖，且治療后HPV病毒載量明顯降低。

經(jīng)前體物質(zhì)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的內(nèi)源性PPⅨ較少，耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，將外源性PPⅨ進(jìn)行基團(tuán)修飾后內(nèi)化至體內(nèi)是增加其積累量的有效方法，修飾后的PPⅨ光敏劑既降低了較高的暗毒性，又提升了富集量，改善了體內(nèi)PPⅨ的有效積累與穩(wěn)定性，以獲取最大優(yōu)勢(shì)下的PDT效果。Shuvra Smita等[29]基于氧化石墨烯在生物安全性和親水性方面的優(yōu)勢(shì)，以葡萄糖為還原劑，將PPⅨ與還原后的氧化石墨烯官能化，其官能化偶聯(lián)步驟簡(jiǎn)單，且具有較高的PPⅨ負(fù)載量與光吸收能力，在635 nm激光照射下，僅0.001 mg/ml的濃度即對(duì)HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的增殖抑制，具有較高的PDT效率。Zhang等[34]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)聚乙二醇與金納米棒修飾的PPⅨ-聚乙二醇、PPⅨ-金納米棒復(fù)合物具有更理想的穩(wěn)定性與生物相容性。在1 064 nm激光照射下，存在PDT以及光熱療法(photothermal therapy，PTT)的協(xié)同治療，可實(shí)時(shí)觀測(cè)凋亡情況的生物成像。

綜上，PPⅨ的內(nèi)源性特點(diǎn)大大提升了其生物安全性、可代謝性，在PDT過程中，熒光信號(hào)與療效并不消失，對(duì)正常組織的損傷幾乎可忽略。且修飾后的外源性PPⅨ復(fù)合物不僅具有類似于內(nèi)源性PPⅨ的良好生物安全性和生物相容性，還保留了較強(qiáng)的熒光信號(hào)及PDT的高細(xì)胞殺傷率，為輔助診斷及治療婦科惡性腫瘤提供了一種非手術(shù)療法。

2.2Ce6光敏劑 四吡咯結(jié)構(gòu)類光敏劑在臨床PDT中廣泛應(yīng)用，以PPⅨ、Ce6等常見[35]。與PPⅨ相比，Ce6的最大吸收波長(zhǎng)更長(zhǎng)、穿透力更強(qiáng)、成像更清晰，在PDT與PTT協(xié)同治療中表現(xiàn)出潛在優(yōu)勢(shì)。近紅外有機(jī)光敏劑Ce6及其應(yīng)用見表2。

表2 近紅外有機(jī)光敏劑Ce6及其應(yīng)用

缺氧是腫瘤微環(huán)境的常見特征，缺氧會(huì)限制反應(yīng)速率，進(jìn)而明顯制約PDT效率。研究者通過提供谷胱甘肽來解決這一問題。通常Ce6在激光照射下容易被消耗降解，而二氧化錳(manganese dioxide，MnO2)薄片可以保護(hù)激光照射下的Ce6不被降解，增強(qiáng)其穩(wěn)定性。Gulzar等[39]基于保護(hù)Ce6組裝了一種能克服腫瘤缺氧和谷胱甘肽導(dǎo)致PDT抵抗的納米復(fù)合材料(過氧化鈣-MnO2-環(huán)己烷-Ce6/阿霉素)，其中MnO2與過氧化鈣在過氧化氫和水的調(diào)節(jié)作用下生成氧氣，同時(shí)MnO2將Ce6的熒光信號(hào)覆蓋，但隨著MnO2的消耗降解，Ce6的熒光特性恢復(fù)。在808 nm激光照射下，Ce6熒光信號(hào)可在更深層生物組織內(nèi)呈現(xiàn)，不僅可提升成像的時(shí)空分辨率，還在腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出劑量與時(shí)間依賴性，并可有效殺死腫瘤細(xì)胞。Chen等[36]利用鉑負(fù)載過氧化氫酶與Ce6制備的復(fù)合材料能夠持續(xù)分解過氧化氫生成氧氣，以緩解腫瘤缺氧，具有制備簡(jiǎn)單、可重復(fù)的特點(diǎn)，在650 nm激光照射下，Ce6傳遞能量產(chǎn)生的活性氧能夠降低線粒體的膜電位，使線粒體中的細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)，最終導(dǎo)致線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可明顯抑制HeLa細(xì)胞增殖，并在BALB/c小鼠中表現(xiàn)出明顯的抑瘤作用和熒光穩(wěn)定性。

Ce6通過PDT產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并通過PTT的光熱轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)PDT/PTT協(xié)同作用，與單純PDT或PTT相比，細(xì)胞殺傷能力更強(qiáng)。Lin等[40]基于Ce6開發(fā)了一種多功能納米顆粒，其具有合適的生物相容性、光穩(wěn)定性和橫向弛豫率。在808 nm和670 nm近紅外激光照射下，該多功能納米顆粒作用于HeLa細(xì)胞的活性氧生成速率與細(xì)胞殺傷率隨之增加，PDT/PTT協(xié)同作用的效果顯著。為了使Ce6在體內(nèi)具有良好的發(fā)光特性并參與PDT的發(fā)生，Zhang等[41]設(shè)計(jì)了一種Ce6-共軛金納米棒(Ce6-聚乙二醇-AuNR)，經(jīng)修飾的Ce6-聚乙二醇-AuNR發(fā)生熒光猝滅，但在酸性條件(pH=5.0)下，Ce6-聚乙二醇-AuNR經(jīng)808 nm激光照射后發(fā)出明顯的熒光信號(hào)，20 h約釋放80%的Ce6，Ce6的特異性熒光恢復(fù)，能夠輔助腫瘤定位；同時(shí)，在664 nm激光照射下，Ce6-聚乙二醇-AuNR能夠有效產(chǎn)生活性氧，僅400 s腫瘤區(qū)域溫度就達(dá)到55 ℃，與單純PDT或PTT有顯著差異。

由此可見，Ce6的長(zhǎng)波長(zhǎng)有助于實(shí)現(xiàn)深層生物組織的成像，其與多肽結(jié)合可將諸多改善腫瘤缺氧微環(huán)境的物質(zhì)帶入生物體，從而改善腫瘤缺氧、增強(qiáng)PDT效率。修飾后包含Ce6的納米顆粒即使存在熒光猝滅，但在酸性環(huán)境下仍可重新釋放Ce6，恢復(fù)其熒光特性，從而有效地通過PDT/PTT協(xié)同作用抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

2.3AIE光敏劑 PPⅨ和Ce6的多數(shù)衍生物大都表現(xiàn)出團(tuán)簇狀態(tài)，進(jìn)而表現(xiàn)出聚集誘導(dǎo)熒光猝滅現(xiàn)象，而AIE有機(jī)納米顆?？捎行П苊膺@一現(xiàn)象[42]。近紅外有機(jī)光敏劑AIE及其應(yīng)用見表3。

表3 近紅外有機(jī)光敏劑AIE及其應(yīng)用

傳統(tǒng)單體光敏劑大多存在光穩(wěn)定性差、熒光量子產(chǎn)生率低、斯托克斯位移小、在生物環(huán)境中穩(wěn)定性欠佳等缺點(diǎn)。一旦產(chǎn)生聚集誘導(dǎo)猝滅現(xiàn)象，便導(dǎo)致熒光與活性氧產(chǎn)生率降低。研究者通過包覆修飾單體光敏劑解決上述問題。與傳統(tǒng)單體光敏劑相比，AIE光敏劑具有較大的斯托克斯位移、較強(qiáng)的熒光信號(hào)以及較高的活性氧產(chǎn)生率?；钚匝踝鳛镻DT的關(guān)鍵因素，其高產(chǎn)生率有望更好地抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Luo等[45]設(shè)計(jì)合成了一種硅膠聚合物(1-甲基1，2，3，4，5-五苯基硅烷)作為光敏劑，該聚合物表現(xiàn)出明顯的AIE現(xiàn)象，隨著溶液中硅膠聚合物光敏劑含量的增加，其熒光光譜逐漸紅移且熒光增強(qiáng)，說明發(fā)光未被聚集猝滅，此結(jié)果與聚集誘導(dǎo)熒光猝滅相反，表明聚集可使硅膠聚合物光敏劑的發(fā)光與PDT效率大幅提升。Ysraki等[46]將4-巰基苯甲酸修飾的銀納米顆粒(AgNP)通過靜電作用形成紅色發(fā)光的AgNP@AIE-PS光敏劑，其熒光猝滅僅5%，且具有較高的活性氧產(chǎn)生率、良好的生物相容性和熒光特性；細(xì)胞熒光成像數(shù)據(jù)顯示，AgNP@AIE-PS在HeLa細(xì)胞中的熒光信號(hào)較單獨(dú)使用AIE-PS更強(qiáng)，經(jīng)40 mW/cm2低強(qiáng)度激光照射10 min后，AgNP@AIE-PS組的細(xì)胞殺傷率較單獨(dú)AIE-PS組高4倍，且活性氧產(chǎn)生率明顯升高，PDT治療效率明顯提升。Min等[47]以高負(fù)電荷的鐵蛋白為支架，制備了一種更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-AIE光敏劑，其熒光發(fā)射性能較強(qiáng)、活性氧產(chǎn)生增加，熒光量子產(chǎn)生率達(dá)54.59%，粒徑較小(35.16 nm)，更易被腫瘤細(xì)胞攝??；該蛋白質(zhì)-AIE光敏劑濃度為5 μmol/ml時(shí)，其暗毒性基本可忽略，在HeLa、A549、MCF-7等細(xì)胞中具有強(qiáng)烈的熒光信號(hào)；在5 μmol/ml的蛋白質(zhì)-AIE光敏劑作用下，經(jīng)0.25 W/cm2白光照射2 min的PDT組產(chǎn)生的活性氧多于無白光照射的對(duì)照組。

近紅外激光可實(shí)現(xiàn)更深層組織的熒光成像，其較高的活性氧產(chǎn)生率與穿透深度相關(guān)。在近紅外激光照射下，AIE光敏劑不僅具有熒光信號(hào)，其較高的活性氧產(chǎn)生亦可增強(qiáng)PDT的療效，故其具備生物成像和治療的雙重優(yōu)勢(shì)。Fang等[48]開發(fā)了一種具有AIE特性的小分子，這種小分子(FM1210)基于苯并雙噻二唑衍生物骨架，并引入Se原子和氨基來改善光敏劑的波長(zhǎng)，可使FM1210的最大發(fā)射波長(zhǎng)超過1 200 nm，從而實(shí)現(xiàn)100幀的高速近紅外熒光成像，且更深層組織的熒光信號(hào)較強(qiáng)，能夠明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)活性氧產(chǎn)生，顯著提高PDT的療效。Liu等[49]開發(fā)了基于供電子的以三苯胺和吸電子的氮雜氟酮為核心，并將二甲基苯胺、吡啶等取代基連接至外圍的4個(gè)AIE光敏劑(TPAN、TPAPy、TPANPF6和TPAPyPF6)，當(dāng)其由分散狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂瘧B(tài)后，分子內(nèi)的運(yùn)動(dòng)受到限制，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)、活性氧產(chǎn)生率升高；在1 040 nm激光照射下，TPAN、TPAPy、TPANPF6和TPAPyPF6分別作用于HeLa細(xì)胞和荷瘤裸鼠后，HeLa細(xì)胞中出現(xiàn)明亮的熒光信號(hào)，且荷瘤小鼠腫瘤體積隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減小。Wang等[50]設(shè)計(jì)了一種具有AIE特征并以銅為金屬有機(jī)骨架的高效線粒體靶向光敏劑——PMOF，PMOF具有核殼結(jié)構(gòu)，流體力學(xué)直徑約為110 nm，在中性和酸性環(huán)境中具有良好的穩(wěn)定性。將HeLa細(xì)胞與PMOF共同孵育24 h，可在HeLa細(xì)胞的線粒體觀察到明亮的熒光，且PMOF對(duì)HeLa細(xì)胞的光毒性也強(qiáng)于正常3T3細(xì)胞；此外，在使用PMOF干預(yù)荷瘤斑馬魚中觀察到PDT的發(fā)生，表明PMOF可以有效抑制腫瘤增長(zhǎng)。

綜上，AIE光敏劑通過包覆多種光敏劑可有效避免熒光猝滅現(xiàn)象的發(fā)生，并增強(qiáng)細(xì)胞成像的示蹤能力。近紅外激光照射實(shí)現(xiàn)了更深層生物組織內(nèi)成像，并大幅度提升了熒光量子和活性氧的產(chǎn)生率，使熒光信號(hào)與PDT效果大大增強(qiáng)。

3 小 結(jié)

PDT克服了傳統(tǒng)輔助診斷成像技術(shù)在惡性腫瘤治療過程中導(dǎo)致的正常組織輻射損傷等不足，憑借微創(chuàng)性、不良反應(yīng)小、可重復(fù)性、生物安全性高等優(yōu)勢(shì)為宮頸癌的研究和臨床治療提供了技術(shù)支撐。目前，有機(jī)光敏劑雖表現(xiàn)出高熒光量子產(chǎn)生率和高活性氧產(chǎn)生率，但由于人體內(nèi)生物化學(xué)環(huán)境復(fù)雜，尚無法避免敏感聚合引起的熒光猝滅現(xiàn)象。因此，研究生物安全性更高、穩(wěn)定性更強(qiáng)且具備靶向作用的光敏劑仍是未來的研究方向，同時(shí)應(yīng)進(jìn)一步完善激光使用條件和儀器設(shè)備等，以為PDT在宮頸癌輔助診斷與治療中的應(yīng)用提供條件，實(shí)現(xiàn)宮頸癌的早診斷、早治療，提高患者生存率，改善患者生活質(zhì)量。