任菲菲，劉德麗，馬斐，閆雪，鄭艷青

(德州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 德州 253000)

萊陽梨為薔薇科植物白梨(PyrusbretschneideriRehd.)的栽培變種茌梨的新鮮果實(shí)，是山東地理標(biāo)志品牌，入選中國地理標(biāo)志注冊(cè)名錄，也是國內(nèi)唯一入藥并以此命名的梨果[1]。曾被列為皇家貢品，名馳南北[2]。由萊陽梨制成的清膏添加麻黃提取液、杏仁水、百合流浸膏、遠(yuǎn)志流浸膏、北沙參流浸膏、薄荷腦等制成的萊陽梨止咳顆粒、糖漿收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十四冊(cè)?？涉?zhèn)咳祛痰，用于傷風(fēng)感冒引起的咳嗽多痰，急、慢性氣管炎[3]。萊陽梨中的綠原酸具有抗菌作用[4]，麻黃中鹽酸麻黃堿具鎮(zhèn)咳作用[5-8]，而苯甲酸為常用防腐劑，近年來研究表明，其毒副作用不容小視，長期過量服用會(huì)致癌、具有細(xì)胞毒性、精子畸形及輕度蓄積作用[9-10]。針對(duì)目前萊陽梨止咳顆粒、糖漿相關(guān)研究較少，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)落后的問題，為確保制劑質(zhì)量，擬采用高效液相色譜法對(duì)其中綠原酸、鹽酸麻黃堿和苯甲酸等3種成分進(jìn)行測定。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀；Milli-Q Integral3 超純水系統(tǒng)；Mettler Toledo ML204電子分析天平。

1.2 試藥 乙腈、甲醇為色譜純(上?？泼軞W高純?cè)噭┯邢薰?；磷酸為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

1.3 對(duì)照品 鹽酸麻黃堿對(duì)照品(批號(hào)：171241-201508，含量：99.8%)；綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-201716，含量：99.3%)；苯甲酸對(duì)照品(批號(hào)：100419-200301，含量：100.0%)；以上對(duì)照品均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.4 材料 萊陽梨止咳糖漿、顆粒共34批樣品，均為藥品監(jiān)督管理部門在山東省各藥品生產(chǎn)企業(yè)、經(jīng)營企業(yè)、醫(yī)療單位抽樣樣品(見表 1)。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫條件見表2，柱溫：30 ℃；檢測波長：0～20 min(210 nm)；20～45 min(327 nm)；45～52 min(230 nm)；進(jìn)樣量：10 μL,樣品中各個(gè)峰得到很好的分離。

表2 梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸麻黃堿、綠原酸、苯甲酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解稀釋制成每1 mL中約含鹽酸麻黃堿60 μg、綠原酸12 μg、苯甲酸1 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 供試品的制備 萊陽梨止咳糖漿：精密量取本品5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

萊陽梨止咳顆粒：取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按照《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第四冊(cè)中萊陽梨止咳顆粒、糖漿標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的處方工藝，制成不含萊陽梨清膏、麻黃提取液的陰性樣品。按“2.2.2”項(xiàng)下制備陰性樣品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果理論塔板數(shù)以各對(duì)照品峰計(jì)均大于6 500，分離度均大于1.5。

2.5 線性關(guān)系的考察 精密吸取鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液(62.225 3 μg·mL-1)1、2、4、6、8、10 μL；綠原酸對(duì)照品溶液(11.588 3 μg·mL-1)1、2、4、6、8、10 μL；苯甲酸對(duì)照品溶液(212.3 μg·mL-1)1、5、10、15、20、25 μL(230 nm)；苯甲酸對(duì)照品溶液(1 061.5 μg·mL-1)1、2、3、4、5、6 μL(248 nm)下分別進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別為：Y= 2 142.6X-11.954(r=0.999 9)；Y= 3 117.9X-0.687 4(r=1.000 0)；Y=5 278X+42.335(r=1.000 0)；Y=3 203.5X-2 854.8(r=0.999 9)。

A.混合對(duì)照品；B.萊陽梨止咳顆粒；C.萊陽梨止咳糖漿；D.萊陽梨止咳顆粒陰性樣品；E.萊陽梨止咳糖漿陰性樣品 1.鹽酸麻黃堿；2.綠原酸；3.苯甲酸圖1 高效液相色譜圖

表明鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液、綠原酸對(duì)照品溶液、苯甲酸對(duì)照品溶液分別在0.062 23～0.622 3、0.011 59～0.115 9、0.212 3～5.307 51(萊陽梨止咳顆粒)、1.061 5～6.369 0(萊陽梨止咳口服液)μg的進(jìn)樣量范圍內(nèi)均與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 取上述混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿的保留時(shí)間RSD<0.3%，峰面積RSD<0.2%；綠原酸的保留時(shí)間RSD<0.4%，峰面積RSD<0.3%；苯甲酸的保留時(shí)間RSD<0.4%，峰面積RSD<0.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)為A1萊陽梨止咳顆粒樣品，平行制備6份，分別進(jìn)樣，求得各樣品中鹽酸麻黃堿的含量，平均值為0.148 6 mg·g-1，RSD<1.0%；綠原酸的含量，平均值為0.009 9 mg·g-1，RSD<0.9%；苯甲酸平均值為0.282 36 mg·g-1，RSD<1.3%；表明該方法重復(fù)性良好。取編號(hào)為S14的萊陽梨止咳糖漿供試品，平行制備6份，分別進(jìn)樣，求得各樣品中鹽酸麻黃堿的含量，平均值為0.099 9 mg·g-1，RSD<0.8%；綠原酸的含量，平均值為0.357 1 mg·g-1，RSD<0.5%；苯甲酸平均值為0.063 6 mg·g-1，RSD<1.2%；表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)為A1的萊陽梨止咳顆粒和編號(hào)為S14的萊陽梨止咳糖漿供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，其鹽酸麻黃堿、綠原酸和苯甲酸峰面積RSD分別為1.2%、1.4%、2.1%和1.5%、1.7%、2.0%，試驗(yàn)結(jié)果表明萊陽梨止咳顆粒和萊陽梨止咳糖漿的供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率試驗(yàn) 萊陽梨止咳顆粒：經(jīng)計(jì)算，編號(hào)為A1的樣品中鹽酸麻黃堿、綠原酸、苯甲酸的含量分別為0.148 6、0.009 9、0.282 3 mg·g-1。取本品研細(xì)，平行6份，取約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入含鹽酸麻黃堿對(duì)照品0.033 08 mg·mL-1，綠原酸對(duì)照品0.002 816 mg和苯甲酸0.080 23 mg混合對(duì)照品溶液10 mL，精密加入50%甲醇10 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

萊陽梨止咳糖漿：經(jīng)計(jì)算，編號(hào)為S15的樣品中鹽酸麻黃堿、綠原酸、苯甲酸的含量分別為0.169 4、0.013 2、1.071 2 mg·mL-1。精密量取本品5 mL，置10 mL量瓶中，平行6份，分別精密加入鹽酸麻黃堿對(duì)照品0.330 8 mg，綠原酸對(duì)照品0.028 16 mg和苯甲酸2.793 2 mg，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

取上述兩種供試品溶液，分別按上述“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3～4，表明本方法具有良好的回收率。

表3 萊陽梨止咳顆粒加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表4 萊陽梨止咳糖漿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.10 樣品測定 取10批萊陽梨止咳顆粒和30批萊陽梨止咳糖漿，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備樣品，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中3種成分的含量，結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果[n=10,mg·g-1(萊陽梨止咳顆粒)；n=30,mg·mL-1(萊陽梨止咳糖漿)]

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 提取對(duì)照品色譜中各色譜峰在190～400 nm范圍的吸收光譜，顯示鹽酸麻黃堿在210 nm處有強(qiáng)吸收，綠原酸在327 nm[11]有強(qiáng)吸收，苯甲酸在230 nm處有強(qiáng)吸收。參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-14]，同時(shí)結(jié)合目標(biāo)峰響應(yīng)強(qiáng)、分離度好、雜質(zhì)峰干擾小等因素，選用0～20 min(210 nm)，20～45min(327 nm)，45 min以后230 nm的波長轉(zhuǎn)換方法作為本文方法。

3.2 提取條件的考察 以糖漿劑為試驗(yàn)樣品，分別考察了使用乙酸乙酯進(jìn)行萃取、以乙醇為溶劑超聲并離心、以甲醇為溶劑直接溶解提取等不同的提取方式，對(duì)提取過程的難易及結(jié)果的準(zhǔn)確度進(jìn)行了分析，最終確定了本方案的提取方法為：精密量取本品5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。因萊陽梨止咳顆粒與糖漿劑處方相同，因此參考糖漿劑的提取方法，確定方法為：取本品5 g,研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.3 樣品數(shù)據(jù)分析 萊陽梨止咳顆粒共檢測了2個(gè)廠家的10批樣品，均檢出鹽酸麻黃堿和綠原酸，同時(shí)檢出了苯甲酸，結(jié)合生產(chǎn)工藝，并且通過對(duì)顆粒中原料萊陽梨清膏中的苯甲酸進(jìn)行了測定，可知苯甲酸來自于萊陽梨清膏。萊陽梨止咳糖漿共檢測了3個(gè)廠家的30批樣品，其中S30號(hào)樣品中未檢出綠原酸，鹽酸麻黃堿含量也遠(yuǎn)低于其他廠家的樣品，懷疑可能存在未投料或少投料的現(xiàn)象，但該廠家樣品僅有此1批，還需進(jìn)行更多樣品的研究。其余各廠家糖漿劑中均檢出了鹽酸麻黃堿和綠原酸。

根據(jù)表5中的檢測結(jié)果，將萊陽梨止咳顆粒和糖漿的含量測定限度擬訂為：含麻黃提取液以鹽酸麻黃堿計(jì)不得少0.15 mg·g-1；含萊陽梨以綠原酸計(jì)不得少0.017 mg·g-1；《中國藥典》2015年版(四部)通則“糖漿劑”項(xiàng)下規(guī)定：“苯甲酸的用量不得過0.3%(其鉀鹽、鈉鹽的用量分別按酸計(jì))”，但沒有制定相應(yīng)的含量測定方法。采用本文建立的檢測方法，測定結(jié)果顯示萊陽梨止咳顆粒和糖漿中苯甲酸的含量均符合藥典規(guī)定。

3.4 小結(jié) 本試驗(yàn)采用HPLC法，對(duì)萊陽梨止咳顆粒、糖漿中的鹽酸麻黃堿、綠原酸、苯甲酸同時(shí)測定，樣品處理簡單，方法準(zhǔn)確可靠，可為萊陽梨止咳顆粒、糖漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提高提供參考。