李 娟，高園園，黃 潔，楊曉旭，趙芳芳，俞 洋，5△

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004；3.寧夏回族自治區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，寧夏 銀川 750021；4.銀川國(guó)龍醫(yī)院，寧夏 銀川 750004；5.寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004)

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是引起西方國(guó)家50歲以上老年人低視力和盲的首要原因[1]。在我國(guó)隨著生活水平的提高，AMD發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)。RPE光損傷可能是視網(wǎng)膜光損傷的關(guān)鍵，AMD與RPE細(xì)胞光損傷密切相關(guān)[2]。前期研究顯示：枸杞子對(duì)RPE細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用[3-4]，枸杞子作為中國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源食物，其富含枸杞多糖、多種氨基酸、甜菜堿、微量元素、維生素、生物堿、脂肪酸等化學(xué)成分，其中，枸杞多糖(LBP)作為枸杞子主要的有效成分，由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等單糖成分組成，具有諸多重要的生理功能。目前受提取工藝的影響，導(dǎo)致成品枸杞多糖的純度不一，為研究此種差異對(duì)視網(wǎng)膜光損傷保護(hù)的影響，本實(shí)驗(yàn)選取純度為50%、65%的LBP，以人RPE為研究對(duì)象，觀察LBP對(duì)光誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞凋亡的影響，探討不同純度枸杞多糖對(duì)人RPE細(xì)胞光損傷保護(hù)的作用機(jī)制，提高枸杞多糖在臨床應(yīng)用的利用率。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19)，購(gòu)于BNCC。

1.2 主要試劑與藥物 50%、65%純度LBP(北京索萊寶生物有限公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；DMEM/F12(美國(guó) HyClone 公司)；青霉素-鏈霉素混合液、胰蛋白酶(北京索萊寶生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(美國(guó)HyClone 公司)；CCK8 檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；AnnexinV-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；BCA 蛋白定量試劑盒、全蛋白提取試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；Bcl2 Antibody(美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)12789-1-AP)；Bax Antibody(美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)50599-2-Ig)；Caspase-3 Antibody(美國(guó)CST公司，貨號(hào)9662S)；Caspase-9 Antibody(北京博奧森公司，貨號(hào)bs-0050R)。

1.3 主要儀器 Multiskan 酶標(biāo)儀(Thermo 公司)；FACSAriaⅡ型流式細(xì)胞檢測(cè)儀(美國(guó) BD 公司)；TES-1332A 數(shù)位式照度計(jì)(臺(tái)北泰仕電子工業(yè))。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 配制安全濃度LBP溶液 分別稱量(50%，65%)LBP粉末各5 mg，用5 mL DMEM/F12完全培養(yǎng)基溶解，渦旋振蕩制成終濃度為1 mg/mL LBP原液；取上述原液用0.22 um無(wú)菌過(guò)濾器滅菌過(guò)濾后，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基稀釋10倍，制成終濃度為0.1 mg/mL LBP溶液。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng) 配制含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)基。將ARPE-19置于 5%CO2、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約每2 d換液1次，待倒置顯微鏡下見細(xì)胞鋪滿瓶壁約80%～90%，用含EDTA胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，于顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變成小圓點(diǎn)并浮起時(shí)，立即用完全培養(yǎng)基終止，以1∶3比例傳代，取2～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 構(gòu)建人RPE細(xì)胞光損傷模型 選2～4代人 ARPE-19 細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，將自制三基色LED冷光燈置于培養(yǎng)箱內(nèi)頂端，采取直落式照射。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，測(cè)定光照強(qiáng)度和光照時(shí)間，使被照細(xì)胞同一水平的光照強(qiáng)度為(16500±500)Lux，用上述光照器照射細(xì)胞24 h。培養(yǎng)箱內(nèi)溫度變化控制在 36.5～37.5 ℃之間，排除溫度升高引起細(xì)胞光熱損傷的可能，正常組用錫紙包裹，其他各組細(xì)胞均在相同培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4.4 實(shí)驗(yàn)分組 正常人RPE細(xì)胞組(正常組)、正常人RPE細(xì)胞+光照射組(模型組)、正常人RPE細(xì)胞+光照+50%枸杞多糖組(低純度組)、正常人RPE細(xì)胞+光照+65%枸杞多糖組(高純度組)，于光照24h給予指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.5 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 選取生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞用胰酶消化后，接種于96孔板(密度約5×103個(gè)/孔)。用無(wú)血清DMEM/F12于培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜以同步化細(xì)胞。各組于光照結(jié)束后終止培養(yǎng)，每孔加入10 μL CCK8溶液，37 ℃孵育 2.5 h。酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm 處各孔的OD值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4.6 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率 各組細(xì)胞于光照處理結(jié)束后，收集舊培養(yǎng)液，用溫 PBS 洗滌 2 遍，胰酶消化并收集細(xì)胞于離心管中，用冷 PBS 洗滌3遍，用 400μL AnnexinⅤ結(jié)合液懸浮細(xì)胞，再加入 5 μL FITC 避光孵育15 min，上機(jī)前 5 min 避光加 10 μL PI，在1 h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4.7 Western blot 法檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平 用蛋白裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，利用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，以50 μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入一抗，4℃封閉過(guò)夜，TBST洗滌10min3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，暗室中加發(fā)光液并進(jìn)行曝光。采用Image-J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 枸杞多糖對(duì)光誘導(dǎo)ARPE-19 細(xì)胞損傷的影響 與正常組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，枸杞多糖(50%、65%)干預(yù)組細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.01)；與50%枸杞多糖組比較，65%枸杞多糖組細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 枸杞多糖對(duì)光誘導(dǎo) ARPE-19細(xì)胞存活率的影響

2.2 枸杞多糖對(duì)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞凋亡的影響 與正常組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，枸杞多糖高、低純度組細(xì)胞凋亡率明顯呈下降趨勢(shì)(P<0.01)；與50%枸杞多糖組比較，65%枸杞多糖組細(xì)胞凋亡率呈下降趨勢(shì)(P<0.05)。見表2、圖1。

正常組

模型組

50%枸杞多糖組

65%枸杞多糖組

A.正常組；B.模型組；C.50%枸杞多糖組；D.65%枸杞多糖組

表2 枸杞多糖對(duì)光誘導(dǎo)ARPE-19 細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 枸杞多糖對(duì)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，枸杞多糖各純度組中Bax 、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，Bcl-2蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax比值明顯上升(P<0.01)；與50%枸杞多糖組比較，65%枸杞多糖組中Bax、 Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，Bcl-2蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax比值呈上升趨勢(shì)(P<0.05)。見表3、圖2。

A.正常組 B.模型組 C.50%枸杞多糖組 D.65%枸杞多糖組

表3 枸杞多糖對(duì)光誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞Bax、Bcl-2、Bcl-2/bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

3 討論

AMD是一種引起視網(wǎng)膜黃斑區(qū)光感受器和視網(wǎng)膜色素上皮退行性改變和新生血管生成為特征的年齡相關(guān)性疾病，由于視覺的高分辨率及色覺辨別主要依靠于黃斑，因此AMD可以引起嚴(yán)重的視覺障礙甚至永久失明[5]。其主要表現(xiàn)為脈絡(luò)膜新生血管形成(choroidal neovascularization，CNV)及黃斑部出血、滲出，導(dǎo)致瘢痕組織生成，破壞中心部視網(wǎng)膜。AMD的發(fā)病率高，已成為致盲的重要因素，但可以得到治療的患者卻極其有限，因此對(duì)AMD病因病機(jī)探討成為眼科學(xué)的研究熱點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)將AMD歸為“視瞻昏渺”、“視物異形”、“暴盲”等范疇，與肝、脾、腎的功能失調(diào)有關(guān)。現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為肝腎陰虛、精血耗傷為本病發(fā)病的根本病機(jī)，陰虧血少可以致瘀；同時(shí)陰虧則火旺，火旺也可煎熬脈絡(luò)而致瘀；血瘀又可阻礙氣機(jī)，進(jìn)而濕蘊(yùn)成痰。瘀血、痰濕、郁火既是病理產(chǎn)物，又是致病因素。目前中醫(yī)藥在治療AMD的進(jìn)程中做出了有益的探索，并取得了一定的臨床效果，研究表明枸杞子防治眼病療效顯著，是作為防治AMD的首選藥[6]。枸杞子性平，味甘，入肝經(jīng)、腎經(jīng)、肺經(jīng)，中醫(yī)認(rèn)為它有補(bǔ)腎、滋陰、益精、養(yǎng)血，養(yǎng)肝，明目等功效。枸杞多糖是枸杞子主要的生物活性成分，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，枸杞多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、防輻射、抗疲勞、保護(hù)生殖系統(tǒng)、抗缺氧等多種功效，這與其具有Glycan-O-Ser結(jié)構(gòu)的糖綴合物—枸杞糖肽(LbGP)密切相關(guān)[7]。枸杞糖肽(LbGP)是從 枸杞多糖中分離純化得到一種有免疫活性的糖蛋白，分子量為 88 ku，糖含量為70 %，LbGP中含有天然氨基酸，其中Ser含量最高，后續(xù)又分離、純化得到5個(gè)糖綴合物L(fēng)bGP l一LbGP 5，均具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫功能及抗氧化作用[8]。目前對(duì)枸杞糖肽功能的研究報(bào)道較少：枸杞糖肽能減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鈣超載以及對(duì)缺氧心肌有明顯的保護(hù)作用[9]；枸杞糖肽對(duì)壓力應(yīng)激導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)具有免疫調(diào)節(jié)效果[10]；枸杞糖肽可提高rd10小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的存活率[11]。枸杞多糖的提取率受提取溫度、次數(shù)、料液比、時(shí)間等因素的影響[12]，王杉杉等[13]采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，枸杞多糖平均得率58.91%；李玲梅等[14]采用的超聲法枸杞多糖提取率為86.98%，隨著枸杞多糖提取工藝的更新和提高，枸杞子的資源化利用將會(huì)更加廣泛。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，由多種基因調(diào)控的主動(dòng)的、程序化的死亡過(guò)程。近年來(lái)大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，線粒體通路在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵性作用[15]，在眾多的凋亡基因中Bcl-2蛋白家族和Caspase家族是當(dāng)前最受關(guān)注的研討論點(diǎn)。其中Bcl-2和Bax是一對(duì)拮抗基因，Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡因子，Bax則屬于促凋亡因子，研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2的過(guò)度表達(dá)可與Bax形成異源二聚體而抑制細(xì)胞凋亡[16]，Bcl-2/Bax比值是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用的關(guān)鍵因素，隨著Bcl-2/Bax比值降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高；反之，細(xì)胞存活率顯著升高[17]。Caspase-3是Caspase家族目前已知最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶[18]。Caspase-9是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性蛋白，活化的Caspase-9可激活Caspase-3，而活化后的Caspase-3可特異性的水解細(xì)胞內(nèi)各種底物，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞形成凋亡小體，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。Bcl-2家族參與線粒體凋亡通路，使線粒體膜損傷，細(xì)胞色素CytC釋放到胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Caspase-3 家族在細(xì)胞凋亡機(jī)制中與凋亡蛋白酶激活因子-1、Procaspase-9形成凋亡復(fù)合體，激活Caspase-9，進(jìn)一步激活Caspase-3從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[20-21]。

本研究結(jié)果顯示：提升枸杞多糖的純度后，其Caspase-3、Caspase-9、bax蛋白的表達(dá)水平得到了明顯抑制，而Bcl-2/Bax比值、Bcl-2的蛋白水平升高，這些結(jié)果提示枸杞子對(duì)RPE細(xì)胞的保護(hù)作用可能與線粒體介導(dǎo)凋亡信號(hào)通路有密切的聯(lián)系。枸杞多糖純度的提升可降低RPE細(xì)胞凋亡率，高、低純度組的比較，表明其保護(hù)作用具有一定的差異性[22]，隨著其純度的升高，枸杞多糖相對(duì)分子含量就越高，使得藥物療效進(jìn)一步提高。

綜上所述，LBP對(duì)光誘導(dǎo)的ARPE-19 細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，采用提升枸杞多糖純度的方法，有助于降低細(xì)胞凋亡率，提升保護(hù)效果，由于本實(shí)驗(yàn)條件有限，未能選用更高純度的枸杞多糖，因此對(duì)其保護(hù)作用的差異性需待進(jìn)一步研究證實(shí)。