岳鍇銘，蒲旭東，高文文，劉國(guó)文，王 哲，李心慰 (吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

酮病是圍產(chǎn)期高產(chǎn)奶牛常見(jiàn)高發(fā)的能量代謝障礙疾病，圍產(chǎn)期奶牛由于干物質(zhì)攝入不足，啟動(dòng)泌乳等導(dǎo)致奶牛處于能量負(fù)平衡(negative energy balance,NEB)狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪組織的大量動(dòng)員，脂解產(chǎn)生大量的非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids,NEFA)，使血液中NEFA濃度顯著升高，少量NEFA進(jìn)入肝臟后能被完全氧化，而大量NEFA在肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不完全氧化，產(chǎn)生大量的酮體，進(jìn)而導(dǎo)致奶牛酮病的發(fā)生[1-2]。酮病奶牛產(chǎn)奶量降低，乳品質(zhì)受損，且乳腺存在明顯的氧化應(yīng)激和升高的非感染性炎癥[3]。酮病奶牛脂解產(chǎn)生的NEFA約有1/2被乳腺上皮細(xì)胞吸收[4]。高濃度的NEFA具有顯著的細(xì)胞脂毒性，所以酮病奶牛乳腺組織的高水平非感染性炎癥可能與高濃度的NEFA有關(guān)，但需要進(jìn)一步確證。奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cell,BMEC)是負(fù)責(zé)奶牛乳腺中合成乳脂、乳蛋白的主要細(xì)胞[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的易位、折疊和翻譯后修飾且參與脂質(zhì)的合成[6]。當(dāng)細(xì)胞代謝壓力過(guò)大時(shí)，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積聚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)被改變，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[7]。因此，當(dāng)奶牛處于圍產(chǎn)期，乳腺組織面臨著巨大的泌乳壓力，BMEC對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白和脂質(zhì)生物合成功能的需求增加，易發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞的防御性機(jī)制，短暫的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)激活未折疊反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)和減少蛋白質(zhì)聚集恢復(fù)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，而長(zhǎng)期或嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷[8]。已有研究表明，在肝細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、β細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均參與炎性反應(yīng)，是炎性反應(yīng)的上游重要信號(hào)通路[9-11]。炎性反應(yīng)是細(xì)胞的適應(yīng)性機(jī)制，可以保護(hù)機(jī)體免受病原或其他異體物質(zhì)的侵害。核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)是炎性反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與了許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路和遺傳信息的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。其中，p65與DNA的反式結(jié)合是NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用的關(guān)鍵[12]。當(dāng)炎性反應(yīng)過(guò)度時(shí)，NF-κB信號(hào)通路被激活，細(xì)胞釋放過(guò)量的炎性因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素- 6(IL-6)、白介素- 1β(IL-1β)，導(dǎo)致組織損傷和生產(chǎn)性能下降[13]。

研究表明，高濃度的NEFA可以引起奶牛肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和激活NF-κB炎性信號(hào)通路。目前，關(guān)于高濃度的NEFA對(duì)BMEC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和炎性通路影響的研究報(bào)道較少。本研究采用BMEC體外細(xì)胞模型，探究高濃度NEFA對(duì)BMEC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎性通路的影響及潛在機(jī)制，為揭示酮病導(dǎo)致乳腺組織損傷的機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑D-37520低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Thermo Fisher公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)恒溫箱購(gòu)自日本三洋公司；通用型電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Red公司；膠原酶Ⅲ購(gòu)自索萊寶公司；DMEM/F12培養(yǎng)液、青霉素/鏈霉素、澳源特級(jí)胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；NEFA、焦磷酸二乙酯(DEPC)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸和雙抗均購(gòu)自Sigma公司;蛋白酶及磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液、BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;TRIzol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；Lipofectamine 3000購(gòu)自Invitrogen 公司；GRP78、P-p65、p65抗體購(gòu)自Abcam公司；P-IRE1α、IRE1α、β-actin抗體均購(gòu)自CST公司。

1.2 BMEC的分離與培養(yǎng)選用的荷斯坦奶牛均來(lái)自吉林省長(zhǎng)春市某奶牛場(chǎng)。動(dòng)物使用方案經(jīng)吉林大學(xué)動(dòng)物使用與護(hù)理倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。首先，對(duì)所有的奶牛都進(jìn)行了常規(guī)體檢，以確保沒(méi)有其他并發(fā)癥，然后挑選處于泌乳期(120±20)d的荷斯坦奶牛，從乳腺的右或左后1/4處采集乳腺組織樣本。解剖后，從乳腺取出實(shí)質(zhì)樣本。將組織切成片狀，用0.5%的膠原酶Ⅲ在38℃下消化3 h。溶液用74 μm的濾網(wǎng)依次過(guò)濾，并在4℃下以150×g離心10 min。將細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清，500 μg/L氫化可的松、1 μg/L催乳素、10 μg/L表皮生長(zhǎng)因子和100 IU/mL青霉素/鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。然后先用100 μmol/L的胰酶消化3min以去除成纖維細(xì)胞，再用胰酶消化5 min，將細(xì)胞傳代培養(yǎng)，重復(fù)此操作以純化上皮細(xì)胞。

1.3 BMEC的鑒定為了檢驗(yàn)分離純化的BMEC，使用免疫熒光分析檢測(cè)BMEC中細(xì)胞角蛋白-18(CK-18)的表達(dá)情況。固定細(xì)胞后，用TritonX-100進(jìn)行細(xì)胞打孔，用山羊血清封閉45 min，加入一抗孵育過(guò)夜，以熒光二抗孵育45 min后用DAPI染核，封片后鏡下觀察。

1.4 不同濃度NEFA處理BMEC將BMEC置于含有10%胎牛血清，5%青霉素/鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將BMEC接種于6孔板中，加入含2% BSA的F12培養(yǎng)基，分別用濃度為0，0.3，0.6，1.2 mmol/L NEFA對(duì)BMEC進(jìn)行處理。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與重組慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞針對(duì)IRE1α參考序列，根據(jù)RNAi序列的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)合成IRE1α基因特異性shRNA，序列如表1所示，送往上海吉瑪基因公司構(gòu)建載體shIRE1α及其陰性對(duì)照shNC重組慢病毒質(zhì)粒。使用含10% FBS的RMPI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)BMEC細(xì)胞，并置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿底面積的80%，用0.25%的胰酶常規(guī)消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL,接種至12孔板中，培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)基更換為OptiMEM，按Lipofectamine 3000使用說(shuō)明書(shū)方法將shIRE1α或shNC轉(zhuǎn)染入BMEC，沉默IRE1α表達(dá)，6 h后將培養(yǎng)基更換為含10% FBS的RMPI-1640培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)。BMEC轉(zhuǎn)染試驗(yàn)分為4組，分別是shNC組，NEFA(1.2 mmol/L)+shNC組，shIRE1α組、NEFA(1.2 mmol/L)+shIRE1α組。

表1 shRNA序列及相關(guān)信息

1.6 Western blot法檢測(cè)GRP78、P-IRE1α、IRE1α、P-p65、p65 將細(xì)胞置于冰上，加入1 mL預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)，用細(xì)胞刮輕柔地將細(xì)胞刮下并收集于離心管內(nèi)，洗滌細(xì)胞3次(4℃，800 r/min離心5 min)，棄上清，加入適量含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min,每10 min充分振蕩細(xì)胞以充分裂解，裂解完成后收集裂解上清(4℃，14 000×g離心10 min)。使用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，按照體積比4∶1加入5×蛋白上樣緩沖液。95℃金屬浴5 min使蛋白變性。按照電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4℃過(guò)夜孵育、TBST洗膜(6 min，3次)、二抗室溫孵育45 min和TBST洗膜(6 min，3次)的試驗(yàn)步驟進(jìn)行Western blot。最后將PVDF膜放入數(shù)字成像儀，滴入適量顯影液進(jìn)行曝光。

1.7 qRT-PCR法檢測(cè)GRP78、TNF-α、IL-6、IL-1β細(xì)胞總RNA的提取按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定RNA質(zhì)量濃度，取2 μg總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA，采用Roche SYBR Green (ROX)染料法進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)GRP78、TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 BMEC的免疫熒光鑒定利用免疫熒光法對(duì)分離培養(yǎng)的BMEC中的骨架蛋白CK-18的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。如圖1所示，純化后細(xì)胞的胞漿染為綠色，細(xì)胞核染為藍(lán)色，表明細(xì)胞中有CK-18表達(dá)，證明所分離的細(xì)胞是上皮細(xì)胞。

A.藍(lán)色熒光部分為染色的細(xì)胞核；B.綠色熒光部分為染色的CK-18；C.A與B疊加圖像圖1 免疫熒光法檢測(cè)BMEC中CK-18的表達(dá)(標(biāo)尺=10 μm)

表2 PCR引物序列及相關(guān)信息

2.2 不同濃度NEFA對(duì)BMEC的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響分別用濃度為0，0.3，0.6和1.2 mmol/L的NEFA處理BMEC 24 h。如圖2所示，NEFA處理后，IRE1α磷酸化水平、GRP78的蛋白與mRNA水平呈現(xiàn)NEFA濃度依賴性升高，0.6，1.2 mmol/L NEFA處理組顯著高于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)。

A.0，0.3，0.6，1.2 mmol/L NEFA刺激BMEC 24 h后P-IRE1α、IRE1α、GRP78的蛋白豐度；B.A中IRE1α磷酸化水平定量分析結(jié)果；C.A中GRP78蛋白水平定量分析結(jié)果；D.0，0.3，0.6，1.2 mmol/L NEFA刺激BMEC 24 h后BMEC中GRP78的mRNA表達(dá)水平圖2 不同濃度NEFA對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

2.3 不同濃度NEFA對(duì)BMEC的NF-κB信號(hào)通路與TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA水平的影響如圖3所示，0.6，1.2 mmol/L NEFA處理組NF-κB p65的磷酸化水平，TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

A.0，0.3，0.6，1.2 mmol/L NEFA刺激BMEC 24 h后P-p65和p65的蛋白豐度；B.A中p65磷酸化水平定量分析結(jié)果；C.0，0.3，0.6，1.2 mmol/L NEFA刺激BMEC 24 h后TNF-α的mRNA水平；D.0，0.3，0.6，1.2 mmol/L的NEFA刺激BMEC 24 h后IL-6的mRNA水平；E.0，0.3，0.6，1.2 mmol/L NEFA刺激BMEC 24 h后IL-1β的mRNA水平圖3 不同濃度NEFA對(duì)BMEC的NF-κB信號(hào)通路與TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA水平的影響

2.4 IRE1α對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與NF-κB信號(hào)通路的影響如圖4所示，與shNC組相比，shIRE1α組的IRE1α與p65磷酸化水平、GRP78蛋白水平顯著降低(P<0.01)；與NEFA(1.2 mmol/L)+shNC組相比，NEFA(1.2 mmol/L)+shIRE1α組的IRE1α與p65磷酸化水平、GRP78蛋白水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

A.用1.2 mmol/L NEFA,shNC,shIRE1α分別以及共同處理BMEC后P-IRE1α、IRE1α、P-p65、p65和GRP78的蛋白豐度；B.A中IRE1α磷酸化水平定量分析結(jié)果；C.A中p65磷酸化水平定量分析結(jié)果；D.A中GRP78蛋白水平定量分析結(jié)果圖4 IRE1α對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與NF-κB信號(hào)通路的影響

2.5 沉默IRE1α對(duì)BMEC中TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA水平的影響如圖5所示，與shNC組相比，shIRE1α組的TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。與NEFA(1.2 mmol/L)+shNC組相比，NEFA(1.2 mmol/L)+shIRE1α組的TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA水平顯著降低(P<0.01)。

A.用1.2 mmol/L NEFA、shNC、shIRE1α分別以及共同處理BMEC后的TNF-α表達(dá)水平；B.用1.2 mmol/L NEFA、shNC、shIRE1α分別以及共同處理BMEC后的IL-6表達(dá)水平；C.用1.2 mmol/L NEFA、shNC、shIRE1α分別以及共同處理BMEC后IL-1β的表達(dá)水平圖5 沉默IRE1α對(duì)NEFA誘導(dǎo)的BMEC的TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA水平的影響

3 討論

圍產(chǎn)期是奶牛酮病和脂肪肝等能量代謝障礙疾病的高發(fā)期，在此過(guò)程中奶牛乳腺面臨著巨大的代謝壓力,由于代謝紊亂，乳腺泌乳能力降低并引起一些病理?yè)p傷，例如酮病奶牛產(chǎn)奶量降低，乳腺非感染性炎癥水平顯著增加，進(jìn)而加劇氧化應(yīng)激等，這均與圍產(chǎn)期奶牛的高NEFA血癥密切相關(guān)[1-2]。因?yàn)橥∧膛４嬖趪?yán)重的能量負(fù)平衡，脂肪組織脂解產(chǎn)生大量的NEFA，高濃度NEFA具有細(xì)胞脂毒性，但NEFA是如何引起乳腺炎性水平增加的目前未見(jiàn)報(bào)道。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生物合成、折疊、脂質(zhì)生物合成、凋亡和鈣穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞器[14]。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志分子，能與UPR的中心分子PERK、ATF6、IRE1α相結(jié)合，使機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)[15]。當(dāng)代謝壓力過(guò)大時(shí)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)加工失調(diào)，大量未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蓄積，與GRP78競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PERK、ATF6、IRE1α，導(dǎo)致GRP78增多，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[16-17]。為了探究圍產(chǎn)期奶牛高NEFA血癥對(duì)BMEC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，本試驗(yàn)使用不同濃度的NEFA處理BMEC，結(jié)果表明NEFA能夠通過(guò)激活I(lǐng)RE1α通路加劇BMEC的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。此外，溫佳楠等[18]報(bào)道BHBA也能夠誘導(dǎo)永生化牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

IRE1是最保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器，能通過(guò)其C端胞質(zhì)部分的激酶和核糖核酸內(nèi)切酶活性調(diào)節(jié)炎性通路[19]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎性反應(yīng)都是由壓力刺激引發(fā)的防御反應(yīng)，然而，炎性反應(yīng)是一把雙刃劍，炎性反應(yīng)釋放的炎性物質(zhì)可通過(guò)免疫和代謝途徑靶向特定細(xì)胞，從而幫助激活適應(yīng)性免疫，修復(fù)受損組織[8]；但如果炎性反應(yīng)長(zhǎng)期持續(xù)，則會(huì)引發(fā)細(xì)胞功能障礙和死亡[20]。NF-κB是炎性反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它由5個(gè)成員組成，p50、p52、p65 (RelA)、c-Rel和RelB，其中p65是調(diào)控炎性反應(yīng)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，p65的過(guò)度活化及其效應(yīng)分子的激活是許多慢性疾病發(fā)病機(jī)制的組成部分，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、多發(fā)性硬化甚至神經(jīng)退行性病變[21]。史曉霞[22]研究表明，NEFA能激活奶牛肝細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路，從而提高下游炎性因子的含量。此外，由于圍產(chǎn)期巨大的泌乳壓力，酮病奶牛的乳腺常伴隨較嚴(yán)重的炎性反應(yīng)[23]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，NEFA能夠使BMEC的p65磷酸化水平升高，激活NF-κB信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA水平增加，說(shuō)明高濃度的NEFA可以激活BMEC的炎性通路。

最近的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的UPR信號(hào)能夠激活NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生炎性因子TNF-α，進(jìn)一步促進(jìn)炎性反應(yīng)[24-25]。此外，WEN等[26]報(bào)道，通過(guò)添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑可以激活乳腺細(xì)胞系MCF-7 NF-κB信號(hào)通路引起炎性反應(yīng)。因此，為了檢測(cè)在BMEC中NEFA誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)炎性反應(yīng)的作用，本試驗(yàn)用shIREα轉(zhuǎn)染BMEC，結(jié)果顯示沉默BMEC的IRE1α后可以顯著降低高NEFA所活化的NF-κB信號(hào)通路，p65磷酸化水平顯著降低，TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)水平也顯著降低。說(shuō)明沉默IRE1α能夠緩解NEFA所引起的乳腺上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)，所以IRE1α是未來(lái)防控圍產(chǎn)期奶牛乳腺炎性損傷的重要靶點(diǎn)，為篩選作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的藥物奠定了研究基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NEFA能誘導(dǎo)BMEC產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并激活NF-κB炎性信號(hào)通路，引起炎性損傷，沉默IRE1α能夠緩解NEFA所引起的乳腺上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)。本研究為探究圍產(chǎn)期奶牛高NEFA血癥引起乳腺損傷的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。