易靜，陶寧，呂琳，劉超，張愉寧，段晗，王華

（1.安徽醫(yī)科大學生命科學學院，安徽合肥 230032；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，北京 100850；3.暨南大學附屬第一醫(yī)院，廣東廣州 510630）

不同劑量的電離輻射可導致不同程度損傷［1］造血系統(tǒng)、胃腸道、腎、免疫系統(tǒng)、皮膚和肺等。與胃腸道系統(tǒng)等相比，骨髓造血細胞對輻射更為敏感，更易發(fā)生輻射損傷。亞致死劑量的電離輻射可引起骨髓抑制，造成患者血細胞功能和數(shù)量異常而產生免疫抑制；高劑量的電離輻射將導致骨髓衰竭，嚴重者導致死亡［2］。

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）可改善輻射對骨髓和其他組織的損傷［3］。最近研究發(fā)現(xiàn)，來自MSC 的條件培養(yǎng)液或胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）在逆轉組織損傷方面具有與MSC 類似的作用，如MSC 來源的EV 可修復輻射對骨髓造血細胞的損傷［4］。EV 是細胞釋放出來的球形雙層膜顆粒，能夠選擇性富集其親本細胞中的蛋白質、脂質、DNA 和RNA 等物質，通過轉移其內容物至特定靶細胞調節(jié)細胞的生物學功能，是新發(fā)現(xiàn)的一種高效的細胞間信號交流方式［5］。

牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSC）是一種牙髓組織來源的MSC，能沿典型的中胚層細胞譜系分化（如軟骨、脂肪和成骨），可從脫落的智齒和乳牙、多生牙及阻生牙中獲得，對供體幾乎無損害［6-7］。與臍帶來源的MSC 相比，DPSC 在成骨分化、免疫調節(jié)、抗凋亡和抗衰老方面具有顯著優(yōu)勢，DPSC 來源的EV（DPSC-EV）具有廣闊的臨床應用前景。本研究通過60Co γ 射線單次照射小鼠骨髓FDC-P1 細胞，并在照射后給予DPSC-EV 干預，探討γ 射線照射對小鼠骨髓細胞凋亡的影響及DPSC-EV對造血細胞輻射損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

小鼠骨髓細胞FDC-P1 和DPSC，購自國家生物醫(yī)學實驗細胞資源庫，本實驗室保存。RPMI 1640 培養(yǎng)基和α-MEM 培養(yǎng)基，美國Gbico 公司；胎牛血清，美國Sigma公司；白細胞介素3（interlukin-3，IL-3），美國PeproTech公司；細胞凋亡檢測試劑盒，江蘇凱基生物公司；RIPA 裂解液，上海碧云天公司；BCA 蛋白質定量檢測試劑盒，美國Thermo 公司；兔抗小鼠胱天蛋白酶3（含胱天蛋白酶原和活化胱天蛋白酶）多抗和兔抗小鼠聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）（含活化PARP）多抗，美國CST 公司；兔抗人CD9 和CD73多抗（一抗），美國Abcam 公司；兔抗人β肌動蛋白（β-actin）多抗（一抗），美國Proteintech 公司；兔抗人β 微管蛋白（β-tubulin）多抗（一抗），武漢賽維爾公司；RNA 快速提取試劑盒，上海奕杉生物科技公司；微RNA（microRNA，miRNA）第一鏈cDNA合成（加尾法）和miRNA 實時熒光定量PCR（real time-quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）試劑盒（染料法）、小鼠miR-100-5p（mmumiR-100-5p）引物（上游：5'-CCCTAACCCGTAGATCCGAA-3'；下游：5'-GAGGAGGAAGAAGAGGAGGA-3'）、mmu-miR-100-5p 抑制劑（RNA oligo干粉）（5'-3'序列：（mC）（mA）（mC）（mA）（mA）（mG）（mU）（mU）（mC）（mG）（mG）（mA）（mU）（mC）（mU）（mA）（mC）（mG）（mG）（mG）（mU）（mU））和抑制劑對照（RNA oligo 干粉）（5'-3'序列：CAGUACUUUUGUGUAGUACAA）、mmu -miR-100-5p 模擬物（RNA oligo 干粉）（正義鏈：5'-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'；反義鏈：5'-CAAGUUCGGAUCUACGGGUUUU-3'）和模擬物對照（RNA oligo 干粉）（正義鏈：5'- UUGUACUACACAAAAGUACUG -3'；反義鏈：5'- GUACUUUUGUGUAGUACAAUU -3'）和RNA 轉染試劑，上海生工生物工程公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 單抗（二抗），北京中杉金橋公司；ECL 發(fā)光液，北京莊盟公司。Varioskan Flash 光譜掃描多功能酶標儀和紫外分光光度計，美國Thermo公司；PowerPac164-5050 電泳儀，美國Bio-Rad 公司；Tanon5200 全自動化學發(fā)光成像儀，上海天能公司；BD FACS Calibur 流式細胞儀，美國BD 公司；7500 Fast實時熒光定量PCR系統(tǒng)，美國ABI公司；超速離心機（XPN-80），美國Beckman公司；納米顆粒跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）儀，德國Particle Metrix公司。

1.2 細胞傳代和培養(yǎng)

配制含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，并添加IL-3（終濃度0.5 μg·L-1）作為FDC-P1 細胞培養(yǎng)液，細胞懸浮生長，每2 d 傳代1 次。以含有10%胎牛血清α-MEM 為DPSC 細胞培養(yǎng)基，待細胞生長至80%～90%融合度時傳代。細胞置37℃，5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 DPSC-EV提取

復蘇第3 代（P3 代）的DPSC，擴增培養(yǎng)，細胞密度至60%～70%時，更換無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 d 后收集細胞上清。將上清于300×g，4℃離心10 min，棄沉淀；上清再經(jīng)2000×g，4℃離心20 min，棄沉淀后將上清10 000×g，4℃再次離心30 min。之后將上清進行超速離心，4℃，100 000×g，70 min。離心結束后，棄管中液體，用2～3 mL 冷的PBS 反復吹洗沖刷管壁管底，吸取液體移至新的超速離心管中，進行第2次超速離心，4℃，100 000×g，70 min。離心結束后棄上清，用200 μL 冷的PBS反復吹洗沖刷管壁管底，充分重懸后將提取的EV分裝至小EP管中，即DPSC-EV，于-80℃保存。

1.4 DPSC-EV鑒定

1.4.1 Western印跡法檢測DPSC-EV表面CD9和CD73表達

用Western 印跡法檢測DPSC-EV 中EV 標志CD9 和親本細胞標志CD73 表達，β 微管蛋白作為內參蛋白。BCA 法測定蛋白質濃度后，在樣本中加入5×上樣緩沖液（4∶1）后混勻，于100℃金屬浴加熱10 min。將蛋白質樣本進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，待蛋白條帶分離后轉至PVDF 膜，加入快速封閉液封閉30 min。之后剪切條帶加入相應一抗（抗CD9 抗體，1∶1000 稀釋；抗CD73 抗體，1∶1000 稀釋；抗β 微管蛋白抗體，1∶1000 稀釋），4℃搖床上孵育過夜。TBST 洗膜4 次，每次5 min。加入二抗（1∶5000 稀釋），室溫孵育1 h；TBST 洗膜4 次，每次5 min。在膜表面滴加發(fā)光液，曝光顯影，據(jù)蛋白條帶顯色對待測蛋白進行定性分析。

1.4.2 NTA法分析DPSC-EV粒徑

取凍存于-80℃的DPSC-EV，室溫融化后，置4℃保存，用PBS 進行適當倍數(shù)稀釋，使用NTA 儀初測顆粒密度；隨后調節(jié)顆粒密度至（5～10）×1010L-1，再次檢測DPSC-EV顆粒數(shù)目和粒徑大小分布。

1.5 miR-100-5p抑制劑和模擬物轉染FDC-P1細胞

將生長狀態(tài)良好的FDC-P1細胞按合適的密度接種，使其24 h 內生長密度達到60%～80%。分別將mmu-miR-100-5p 抑制劑和抑制劑對照及mmumiR-100-5p 模擬物和模擬物對照RNA oligo 干粉用DEPC 水溶解后，配制為RNA oligo 20 μmol·L-1的母液。在無血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中分別加入RNA 轉染試劑和上述RNA oligo 母液，使RNA oligo 終濃度為10 nmol·L-1。兩管混勻后，室溫放置5～10 min，以形成miRNA/RNA轉染試劑復合物，之后將復合物加入細胞中，在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育培養(yǎng)24 h。

1.6 FDC-P1細胞分組和處理

1.6.1 觀察輻射對細胞的損傷作用

設正常對照、2 和6 Gy 照射組，將生長狀態(tài)良好的FDC-P1 細胞接種于6 孔板內，使用60Co γ 射線2 和6 Gy 對細胞進行照射，之后立即更換新鮮的完全培養(yǎng)基。照射后24 和48 h 檢測細胞凋亡率和凋亡標志物蛋白表達水平。

1.6.2 觀察DPSC-EV對輻射損傷細胞的保護作用

設正常對照、2和6 Gy照射組及2和6 Gy+DPSCEV 干預組，DPSC-EV 干預組照射后立即加入DPSC-EV 5×1011L-1孵育24 h，隨后檢測細胞凋亡率、凋亡標志物蛋白表達水平和miR-100-5p 表達水平。

1.6.3 觀察miR-100-5p 在DPSC-EV 保護輻射損傷細胞中的作用

設miR-100-5p 抑制劑組和抑制劑對照組。在FDC-P1 細胞照射前24 h，轉染miR-100-5p抑制劑以敲低miR-100-5p，轉染抑制劑對照作為陰性對照。2組細胞經(jīng)2 Gy照射后，加入DPSC-EV 5×1011L-1孵育24 h，檢測細胞miR-100-5p 表達水平和細胞凋亡率。

1.6.4 觀察miR-100-5p對細胞輻射損傷的干預作用

設miR-100-5p 模擬物組和模擬物對照組。在FDC-P1 細胞照射前24 h，轉染miR-100-5p 模擬物以過表達miR-100-5p，轉染模擬物對照作為陰性對照。2 組細胞經(jīng)2 Gy 照射后更換新鮮完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后檢測細胞miR-100-5p 表達水平和細胞凋亡率。

1.7 流式細胞術檢測FDC-P1細胞凋亡率

收集1.6.1～1.6.4 處理的細胞懸液于流式管中，400×g離心5 min；PBS 洗2 次，300×g離心5 min；每管加入結合緩沖液500 μL，F(xiàn)ITC-Annexin-Ⅴ5 μL 和PI 5 μL，室溫避光孵育15 min；使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 Western印跡法檢測FDC-P1細胞胱天蛋白酶3和PARP及其活化蛋白表達

收集1.6.1 和1.6.2 處理的細胞，加入RIPA 裂解細胞，在冰上置30 min 后12 000×g，4℃離心15 min，吸取上清。用Western 印跡法檢測FDCP1 細胞胱天蛋白酶3 和PARP 及其活化蛋白表達。以β 肌動蛋白作為內參對照。顯影曝光后使用Image J 軟件定量分析蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA）值，用IA待測活化蛋白/IA待測蛋白比值表示待測蛋白相對活化水平。

1.9 RT-qPCR檢測FDC-P1細胞miR-100-5p表達

收集1.6.2～1.6.4 處理的細胞懸液，離心后加入500 μL 裂解緩沖液，用力吹吸數(shù)次使細胞充分裂解；再加入500 μL無水乙醇充分混勻，將液體加入離心柱，12 000×g離心1 min；加入500 μL洗液洗滌。之后向RNA 柱膜中心部位加入25 μL 洗脫液以洗脫RNA，用紫外分光光度計測定RNA 濃度。配制20 μL cDNA 合成反應體系：miRNA 逆轉錄反應混合液10 μL，miRNA 逆轉錄反應酶混合物2 μL，總RNA 2 μg，無RNA 酶水補至20 μL，反應混合物于37℃溫浴60 min，然后85℃加熱5 min 使酶失活，4℃保存。將獲得的cDNA 反應液稀釋50 倍后作為模板。配制20 μL miRNA RT-PCR 反應體系：miRNA RT-PCR 反應混合液10 μL，上游引物和下游引物0.5 μL，模板cDNA 1.5 μL，ROX 染料1 μL，無RNA 酶水補至20 μL，在ABI Prism7500 Fast 儀器上設置反應程序：預變性95℃30 s，變性95℃5 s；退火、延伸各60℃30 s，40個循環(huán)，據(jù)儀器設置熔解曲線程序。miR-100-5p表達水平用2-△△Ct表示。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 γ射線照射導致FDC-P1細胞凋亡

流式細胞術測定結果（圖1）顯示，與細胞對照組相比，2 和6 Gy 照射組在照射后24 和48 h，細胞凋亡率均顯著增加（P＜0.01），且6 Gy照射組均顯著高于2 Gy 照射組（P＜0.01），表明FDC-P1 細胞對γ射線敏感，γ射線照射可導致FDC-P1細胞凋亡。

2.2 γ射線照射上調FDC-P1 細胞胱天蛋白酶3 和PARP蛋白活化水平

Western 印跡實驗結果（圖2）顯示，照射后24 h，2 和6 Gy 照射組FDC-P1 細胞胱天蛋白酶3和PARP 蛋白活化水平與細胞對照組相比均顯著升高（P＜0.01），且6 Gy 照射組明顯高于2 Gy 照射組（P＜0.05，P＜0.01）；照射后48 h，與細胞對照組相比，2 Gy 照射組PARP 蛋白活化水平顯著升高（P＜0.01），6 Gy 照射組胱天蛋白酶3 和PARP 蛋白活化水平均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），且PARP蛋白活化水平高于2 Gy照射組（P＜0.05）。

2.3 DPSC-EV抑制γ射線導致的FDC-P1細胞凋亡

Western印跡法和NTA結果（圖3）顯示，提取的DPSC-EV表達EV特異分子CD9和DPSC表面標志CD73，其粒徑大小均值為156.7 nm。流式細胞術結果（圖4）顯示，與細胞對照組相比，經(jīng)γ 射線照射后24 h，2和6 Gy照射組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；加入DPSC-EV干預后，與相同劑量照射組相比，細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。由此表明，DPSC-EV對γ射線所致FDC-P1細胞凋亡具有抑制作用。

2.4 DPSC-EV 抑制γ 射線照射FDC-P1 細胞胱天蛋白酶3和PARP蛋白活化水平

圖5A 顯示，與正常對照組相比，2 和6 Gy 照射組FDC-P1 細胞胱天蛋白酶3 活化水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；加入DPSC-EV 后，與相同劑量照射組比較，胱天蛋白酶3 活化水平未明顯變化。圖5B 顯示，與細胞對照組相比，2 和6 Gy 照射組PARP 蛋白活化水平顯著升高（P＜0.01）；加入DPSC-EV 可顯著降低PARP 蛋白活化水平（P＜0.05，P＜0.01）。

2.5 DPSC-EV 增強γ 射線照射FDC-P1 細胞miR-100-5p表達水平

圖6 顯示，與細胞對照組相比，經(jīng)γ 射線2 Gy照射后24 h，F(xiàn)DC-P1細胞miR-100-5p表達水平顯著降低（P＜0.01）；加入DPSC-EV 干預后，細胞miR-100-5p表達水平，明顯高于2 Gy照射組（P＜0.01）。

2.6 miR-100-5p抑制劑減弱DPSC-EV對FDC-P1細胞凋亡的抑制作用

圖7顯示，F(xiàn)DC-P1細胞經(jīng)2 Gy γ射線照射后24 h，與抑制劑對照組相比，mmu-miR-100-5p抑制劑處理組FDC-P1 細胞miR-100-5p 表達水平顯著降低（P＜0.01），且細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01），提示敲低miR-100-5p 表達可減弱DPSC-EV 對FDC-P1細胞凋亡的抑制作用。

2.7 miR-100-5p模擬物抑制γ射線照射所致FDC-P1細胞凋亡

RT-qPCR 結果（圖8A）顯示，經(jīng)2 Gy γ 射線照射后24 h，mmu-miR-100-5p模擬物處理組FDC-P1細胞miR-100-5p 表達水平明顯高于模擬物對照組（P＜0.01）。流式細胞儀測定結果（圖8B）表明，與模擬物對照組相比，mmu-miR-100-5p 模擬物處理組FDC-P1 細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。提示上調miR-100-5p表達可降低γ射線誘導的FDC-P1細胞凋亡。

3 討論

越來越多的研究認為，MSC 對輻射損傷的干預作用可能并不主要依賴于細胞在損傷部位的定植和分化，如靜脈注射MSC 后，損傷區(qū)域內檢測到的MSC 數(shù)量很少，但組織造血功能顯著恢復［8-9］。據(jù)報道，MSC對輻射等損傷的修復作用主要依賴于其旁分泌功能，即通過分泌EV 并釋放多種細胞因子作用于局部微環(huán)境［4］。

人體幾乎所有類型的細胞均能分泌EV。根據(jù)其來源、釋放途徑和顆粒大小，EV 可分為不同的亞型。MSC分泌的EV主要包括外泌體和微囊泡。多囊體與細胞膜融合，釋放其內容小泡至細胞外所形成的直徑30～150 nm 的囊泡為外泌體［10］；細胞直接出芽、脫落形成的直徑150～1000 nm的囊泡稱為微囊泡［11］。它們可通過內吞作用或直接與細胞膜融合，或通過受體配體相互作用進入細胞質，將生物信息傳遞給靶細胞，發(fā)揮生物功能，調節(jié)異常微環(huán)境［12］。MSC 分泌的EV 已被提出作為干細胞治療的替代方案，用于一些受損器官再生［13］。DPSC是一種理想的干細胞來源，其提取過程簡便且易于量產，不涉及倫理問題，還可用于基因工程［14］。DPSC-EV 具有低免疫原性特點和促組織再生等功能，已在多種疾病和損傷修復中廣泛應用［15］。

本研究收集DPSC 細胞培養(yǎng)上清，使用超速離心法分離提取DPSC-EV。Western 印跡法及粒徑分析的鑒定結果顯示，提取的DPSC-EV 表達EV 特異性CD9 和DPSC 特異性表面標志CD73，其顆粒直徑均值為156.7 nm。本研究結果表明，DPSCEV 可有效抑制γ 射線照射所導致的小鼠骨髓細胞FDC-P1發(fā)生凋亡，且抑制PARP 的激活，具有良好的抗凋亡作用。但本研究未區(qū)分外泌體和微囊泡的作用。

EV 可在細胞間傳遞蛋白質、脂質和核酸等，從而影響受體和親本細胞的各種生理和病理功能［16］，它可通過調節(jié)miRNA 對受體細胞發(fā)揮調控作用［17］。miRNA是重要的表觀遺傳調控因子，其對細胞生長、增殖、凋亡、分化、遷移和代謝均有影響［18］。本實驗室前期研究表明，DPSC-EV 在體外對細胞凋亡有抑制作用；還發(fā)現(xiàn)EV 中的miRNA 可能在減輕輻射損傷中發(fā)揮重要作用［15］。miR-100-5p 是miRNA 家族的重要成員，與多種疾病和病理過程相關聯(lián)［19-20］。例如，轉染miR-100-5p 模擬物可增強細胞活力，抑制腎癌細胞凋亡，促進其遷移和侵襲［21］；MSC-EV 中的miR-100-5p 可抑制環(huán)狀菌株誘導的關節(jié)軟骨細胞活性氧產生和細胞凋亡［22］。本研究結果表明，輻射后的FDC-P1 細胞miR-100-5p 表達水平顯著降低，給予DPSC-EV 處理后其表達水平又明顯恢復，同時伴隨著細胞凋亡率降低；用miR-100-5p 抑制劑處理FDC-P1 細胞會減弱DPSC-EV 對細胞凋亡的抑制作用。另外還發(fā)現(xiàn)，轉染miR-100-5p 模擬物對γ 射線導致的FDC-P1細胞凋亡也同樣具有改善作用。上述結果提示，DPSC-EV 可通過調節(jié)靶細胞miRNA 的表達發(fā)揮其對細胞凋亡的調控作用。

綜上，本研究結果表明，DPSC-EV 可通過調控照射后FDC-P1細胞miR-100-5p表達水平、抑制細胞凋亡而發(fā)揮對輻射細胞的保護作用。該研究結果將為抗輻射損傷提供潛在靶點。

本研究還存在許多不足和局限性。例如，本研究以小鼠骨髓細胞系作為研究對象進行實驗，實驗結果尚需在人造血細胞系、原代細胞以及體內實驗驗證；FDC-P1 細胞miR-100-5p 水平的改變如何影響細胞凋亡及其下游靶蛋白和信號分子仍待闡明。另外，在照射后的FDC-P1 細胞中，除miR-100-5p外，本研究還檢測到了其他表達水平顯著改變的miRNA，如miR-23a-5p，miR-92a-2-5p 等（待發(fā)表），這些相關的miRNA 可能在細胞的輻射損傷中發(fā)揮了其他重要作用，如影響細胞增殖、調節(jié)炎癥反應等，提示DPSC-EV 對靶細胞的調控信號復雜多樣，在后續(xù)實驗中應進一步闡明DPSC-EV 在輻射損傷及修復過程中發(fā)揮作用的分子機制。