張 銘，張娜娜，余 信，周?chē)?guó)瓊,李 靜

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會(huì)醫(yī)院，陜西 西安710054；2.陜西省人民醫(yī)院中醫(yī)科，陜西 西安710068)

全球近三分之一的死亡是由心血管疾病引起[1]，其中，急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是心血管疾病死亡的主要原因。AMI是由于動(dòng)脈內(nèi)壁形成的斑塊導(dǎo)致流向心臟的血液減少，心肌組織因缺血缺氧而導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡[2]。目前AMI的治療方法是盡早開(kāi)通血管恢復(fù)心臟的血液灌注，這一過(guò)程被稱為再灌注[3]。再灌注可通過(guò)外科手術(shù)和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入球囊血管成形術(shù)[4-5]，或抗血小板、抗血栓治療來(lái)完成[6-7]。然而，再灌注本身又可引起心肌細(xì)胞死亡和梗死面積增大，從而增加AMI患者的病死率，這一過(guò)程被稱為“缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion，I/R)損傷”[8]。因此，心臟I/R損傷后保護(hù)心肌組織的治療可能有助于在結(jié)構(gòu)和功能上保護(hù)AMI患者的心臟。

鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 (Sodium glucose cotransporter 2，SGLT-2)抑制劑是一種治療糖尿病的新藥，已被證明具有良好的代謝特征， 最初認(rèn)為SGLT-2抑制劑只是一種降糖藥物，但其作用已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了這一范圍[9-10]。 EMPA-REG試驗(yàn)研究報(bào)告了SGLT-2抑制劑對(duì)心血管的益處， SGLT-2抑制劑可促進(jìn)糖尿的排出，從而降低葡萄糖毒性和體重，并增強(qiáng)利鈉，從而降低血壓，可顯著降低心力衰竭患者的住院率，減少動(dòng)脈粥樣硬化事件、心血管疾病的總病死率，還可控制慢性腎臟疾病的進(jìn)展[11-12]。盡管SGLT-2抑制劑對(duì)心血管的益處從血流動(dòng)力學(xué)和全身代謝方面進(jìn)行了解釋，但對(duì)心臟潛在的保護(hù)機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討在心臟I/R損傷3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)急性給藥達(dá)格列凈對(duì)大鼠心肌梗死面積及心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性大鼠40只,250～300 g,8周齡，購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤生物公司[SCXK( 湘) 2019-0013 ],馴化7 d后接受同等程度的心臟I/R刺激。40只隨機(jī)分為四組，每組10只。①預(yù)處理組：在心肌缺血前15 min快速給予達(dá)格列凈；②缺血組：在心肌缺血開(kāi)始15 min后快速給予達(dá)格列凈；③再灌注組：再灌注開(kāi)始時(shí)快速給予達(dá)格列凈；④對(duì)照組：給大鼠生理鹽水作為對(duì)照。將達(dá)格列凈溶于生理鹽水中(1 mg /kg溶于1 ml生理鹽水)，定位大鼠左側(cè)股靜脈，注入達(dá)格列凈注射液。從右側(cè)頸動(dòng)脈插入P-V導(dǎo)管至左室，評(píng)估心功能。記錄室速(VT)/室顫(VF)首次發(fā)生的時(shí)間，對(duì)心律失常進(jìn)行量化分析。在I/R損傷結(jié)束時(shí)，立即切除心臟，以便對(duì)心肌高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)和心肌梗死面積的測(cè)量。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 心肌缺血再灌注模型:用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，通過(guò)呼吸模式、眼睛和腳蹬反射的測(cè)定，密切監(jiān)測(cè)麻醉水平。對(duì)大鼠進(jìn)行氣管插管，接動(dòng)物專用簡(jiǎn)易呼吸機(jī)，接心電圖并記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。開(kāi)胸、切開(kāi)心包，暴露大鼠心臟，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)致心肌缺血30 min，通過(guò)心外膜發(fā)紺和心電圖ST段抬高，證實(shí)成功的冠狀動(dòng)脈閉塞和MI起始。解除LAD結(jié)扎后心臟恢復(fù)再灌注120 min[13-14]。心電圖ST段壓低證實(shí)再灌注，左心室區(qū)出現(xiàn)局部充血，之前是局部缺血，顏色蒼白。

1.2.2 心律失常參數(shù)與左室功能測(cè)定:根據(jù)朗伯斯公約指南[15]對(duì)心律失常進(jìn)行量化，分析每只大鼠缺血性心律失常發(fā)作的差異。

1.2.2.1 左室功能測(cè)量：在心臟I/R損傷時(shí)，定位右側(cè)頸動(dòng)脈，插入P-V環(huán)導(dǎo)管至左室，評(píng)估左室功能。采用Labscribe程序測(cè)定心率(HR)、左室收縮壓和舒張壓(LVESP和LVEDP)、左室內(nèi)壓變化率(dp/dtmax)、左室舒張期壓力下降最大變化率(dp/dtmax)、每搏輸出量(SV)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)[13-15]。P-V環(huán)數(shù)據(jù)分析:①選擇缺血前50個(gè)循環(huán)作為基線；②冠脈閉塞結(jié)束時(shí)選擇50個(gè)循環(huán)代表缺血期；③再灌注結(jié)束時(shí)選擇50個(gè)循環(huán)代表再灌注期。

1.2.2.2 梗塞尺寸測(cè)量:再灌注120 min后將伊文思藍(lán)注入大鼠主動(dòng)脈內(nèi)，然后處死大鼠，快速取出心臟。評(píng)估左室危險(xiǎn)區(qū)域(AAR)面積。將心臟置于-20 ℃的低溫下，第2天早晨取出后切片，厚度為1～2 mm。將切片后的心臟浸泡于2,3,5-三苯基四唑(TTC)緩沖鹽水中。TTC染色區(qū)域?yàn)榛罱M織，用紅色染色檢測(cè)。梗死面積由白色區(qū)域確定，沒(méi)有任何染料染色。使用圖像分析程序?qū)Ｋ烂娣e(IS)和高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域面積(AAR)的百分比進(jìn)行計(jì)算，各心臟的AAR值和IS值通過(guò)對(duì)切片數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總并計(jì)算平均值得到。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析均按隨機(jī)化進(jìn)行。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差分析和t檢驗(yàn)來(lái)測(cè)試組間的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 達(dá)格列凈對(duì)各組心肌梗死面積的影響 達(dá)格列凈在缺血再灌注大鼠模型中對(duì)心肌高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)面積的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)處理組、缺血組、再灌注組與對(duì)照組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，說(shuō)明四組之間心肌高風(fēng)險(xiǎn)面積大小無(wú)差異。達(dá)格列凈在缺血再灌注大鼠模型中對(duì)心肌梗死面積的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)給予達(dá)格列凈治療后，預(yù)處理組和缺血組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，可顯著減少心肌梗死的面積；再灌注組與對(duì)照組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，心肌梗死面積沒(méi)有顯著減少。見(jiàn)表1。

表1 達(dá)格列凈對(duì)各組心肌梗死面積的影響(%)

2.2 達(dá)格列凈對(duì)各組心肌I/R期間心律的影響 考察達(dá)格列凈對(duì)I/R期間心律的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)處理組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明在缺血前期給予達(dá)格列凈可延長(zhǎng)大鼠第1次發(fā)生VT/VF的時(shí)間，減少心臟I/R損傷心律失常的頻次。而缺血組和再灌注組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。說(shuō)明在缺血時(shí)以及再灌注時(shí)給予達(dá)格列凈治療并不能延長(zhǎng)大鼠第1次發(fā)生VT/VF的時(shí)間,減少I(mǎi)/R期間的心律失常。見(jiàn)表2。

表2 達(dá)格列凈對(duì)各組I/R期間心律的影響(min)

2.3 達(dá)格列凈對(duì)心肌I/R損傷時(shí)左室功能的影響 考察達(dá)格列凈對(duì)心肌I/R損傷時(shí)左室功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LV功能在基線時(shí)四組之間各參數(shù)比較差異沒(méi)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。LAD閉塞后，每搏輸出量(SV)、dp/dtmax、dp/dtmin和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)均逐漸下降，舒張末期壓逐漸升高(圖1A-F)。給予達(dá)格列凈治療后，缺血組和再灌注組與對(duì)照組比較，在HR、SV、dp/dtmax、dp/dtmin以及LVEF等參數(shù)上差異沒(méi)有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，預(yù)處理組與對(duì)照組比較，在HR、SV、 ESP、dp/dtmin等參數(shù)上沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)；而在EDP、dp/dtmax和LVEF%參數(shù)上比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。達(dá)格列凈處理的預(yù)處理組dp/dtmax和LVEF%有所改善(圖1E、G)。

A:HR(次/min);B：SV(μl);C：ESP(mmHg);D：EDP(mmHg);E：dp/dtmax(mmHg/s×103);F：dp/dtmin(mmHg/s×103);G：LVEF%

3 討 論

缺血心肌的快速再灌注在幾十年前就被確立為是一種非常有益的心肌梗死治療方法，但在再灌注恢復(fù)后仍會(huì)發(fā)生明顯的心肌細(xì)胞死亡。因此，心臟I/R損傷是AMI發(fā)病和死亡的重要原因。目前我們的實(shí)驗(yàn)研究還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)直接有效的治療方法來(lái)保護(hù)心臟免受IR損傷。因此，有必要發(fā)現(xiàn)或開(kāi)發(fā)新的策略來(lái)預(yù)防心肌再灌注損傷，以改善心血管患者的臨床結(jié)局。EMPA-REG試驗(yàn)揭示了SGLT-2抑制劑在降血糖的同時(shí)對(duì)患者心血管事件的影響，它對(duì)心臟的保護(hù)作用是通過(guò)降低血糖、血壓、改善血管彈性、通過(guò)尿鈉的排出減少心臟負(fù)荷、降低體重等全身作用而發(fā)揮心臟保護(hù)作用[16-19]。

本研究發(fā)現(xiàn)了達(dá)格列凈的益處可能主要是由于其對(duì)心臟的直接作用，因?yàn)樗窃谛呐KI/R損傷前15 min才給予大鼠。本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)以下幾個(gè)方面的數(shù)據(jù):①LVEF %增加，LV功能得到改善；②首次VT/VF發(fā)生時(shí)間的延遲；③心肌梗死面積的減小，表明在心臟I/R損傷期間，急性給藥達(dá)格列凈可直接發(fā)揮心臟保護(hù)作用，改善心功能，并且在I/R損傷不同時(shí)間點(diǎn)給藥，發(fā)揮的心臟保護(hù)作用是不同的。我們的研究證實(shí)，在心臟I/R損傷前急性給藥達(dá)格列凈可以減少心肌梗死面積約38%，在心臟缺血期間急性給藥達(dá)格列凈可以減少心肌梗死面積約14%。除梗死面積減少外，研究還證實(shí)，與對(duì)照組相比，缺血前急性給藥達(dá)格列凈可使大鼠VT/VF的首次發(fā)病時(shí)間明顯延遲，心律失常的頻次減少，左室功能參數(shù)LVEF、dp/dtmax有所改善。因此，在心臟I/R損傷前急性給藥達(dá)格列凈可通過(guò)減少心肌梗死面積、控制心律失常來(lái)發(fā)揮心臟保護(hù)作用，通過(guò)提高LVEF、dp/dtmax來(lái)改善左室功能。

缺血/再灌注損傷是一種嚴(yán)重的疾病，對(duì)我們醫(yī)生提出了一個(gè)重要的治療挑戰(zhàn)，人們已經(jīng)在I/R損傷的途徑及引起的代謝紊亂方面做了大量的工作。SGLT-2抑制劑對(duì)心臟的直接保護(hù)作用可能是通過(guò)改善心肌局部炎癥、活性氧的失控生成而減少心肌細(xì)胞凋亡、自噬、壞死，使活性心肌細(xì)胞得到保護(hù)，通過(guò)降低心肌氧化應(yīng)激、纖維化和心臟重構(gòu)的途徑使心肌梗死面積得到減少，通過(guò)維持線粒體的正常生物功能和細(xì)胞能量代謝等途徑而控制心律失常、改善心功能[20-22]，目前還需要我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究以證實(shí)。這些發(fā)現(xiàn)可以為今后急性心肌梗死患者使用達(dá)格列凈的臨床研究提供重要的依據(jù)。