范釗瑋，陳晶，楊思宇，劉慧婷，王藍(lán)悅，王然，馬駿，王欣，馮振月，于永忠，崔玉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

奶牛乳腺炎是一種由細(xì)菌感染引起的急性或慢性乳腺疾病，臨床表現(xiàn)為乳房腫脹、疼痛，發(fā)熱、厭食、休克等，嚴(yán)重危害動(dòng)物健康[1]。同時(shí)造成牛奶產(chǎn)量減少、牛奶成分改變和質(zhì)量下降，給全世界奶業(yè)帶來巨大影響[2]。引起奶牛乳腺炎的病原種類很多，但以無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae）、乳房鏈球菌（Streptococcus uberis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli）[3-4]為主。其中，鏈球菌引起的奶牛乳腺感染占比最高，有時(shí)僅S.agalactiae 感染就占到38.61%[5]。過去人們對(duì)奶牛乳腺炎主要使用抗生素類藥物進(jìn)行治療和防控，但隨著抗生素的廣泛持久使用，耐藥菌株大量出現(xiàn)，導(dǎo)致臨床上使用抗生素治療的效果越來越差。因此，針對(duì)這些病原菌感染開發(fā)安全、有效的疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防顯得尤為重要[6-8]。亞單位疫苗具有能夠避免許多無關(guān)抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體、減少疫苗副反應(yīng)和以及誘導(dǎo)良好的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn)，并且蛋白質(zhì)抗原保守性較好，已成為許多預(yù)防病原菌感染疫苗的研究對(duì)象。但引起奶牛乳腺炎的病原菌種類如此之多，使用多種病原菌的多個(gè)抗原作為疫苗在研制和應(yīng)用中存在諸多困難。那么，能否尋找和選擇這些病原菌中具有高度保守性的共同蛋白質(zhì)分子作為疫苗候選抗原是一項(xiàng)非常值得探討的課題。

延伸因子-Tu（Elongation factor Tu，EF-Tu）是存在于真核細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞中參與RNA 翻譯的常見功能性蛋白，在真核生物和細(xì)菌的蛋白質(zhì)生物合成中起著關(guān)鍵作用，具有高度保守性。有研究表明[9]，EF-Tu 可以被分泌到菌體外，并與菌體表面結(jié)合，可作為預(yù)防病原菌感染的疫苗抗原。但這些不同病原菌的EF-Tu 理化及結(jié)構(gòu)特性、同源性、免疫原性等尚缺少比較分析。研究針對(duì)分離保存的引起奶牛乳腺炎的S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus 和E.coli菌株的EF-Tu 基因進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究該蛋白的交叉免疫保護(hù)作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)所用菌株均分離于奶牛乳腺炎病牛乳汁，分離鑒定的S.agalactiae 有8 株、S.dysgalactiae 有1株、S.uberis 有1 株、S.aureus 有1 株、E.coli 有1 株。

1.2 EF-Tu 基因測(cè)序及參考菌株基因序列獲取

將實(shí)驗(yàn)保存的這些菌株送吉林省庫(kù)美生物公司進(jìn)行EF-Tu 基因測(cè)序。參考菌株基因序列來自于NCBI，共選取72 個(gè)菌株的EF-Tu 基因測(cè)序，其中S.agalactiae 27 株、S.dysgalactiae 11 株、S.uberis 7 株、S.aureus 17 株、E.coli 10 株。

1.3 方法

1.3.1 EF-Tu 蛋白基本理化性質(zhì)分析

使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）分析EF-Tu 蛋白的理化性質(zhì)；使用蛋白質(zhì)在線分析軟件ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白EF-Tu 的親水性或疏水性。

1.3.2 EF-Tu 蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用PBIL-GERLAND 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）中HNN 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法對(duì)EF-Tu 蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用Swiss-Model 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：/swissmodel.expasy.org/）同源性模型預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并根據(jù)數(shù)據(jù)分析模型準(zhǔn)確性。

1.3.3 EF-Tu 核苷酸和氨基酸同源性分析及序列比對(duì)

使用NCBI 在線分析網(wǎng)站中的BLAST 功能對(duì)各菌株的EF-Tu 核苷酸和氨基酸的序列同源性分析；使用MEGA7 軟件對(duì)EF-Tu 核苷酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)；使用Geneious Prime 軟件（網(wǎng)址：https：//www.geneious.com/）中Pairwise/Multiple Align 功能對(duì)各菌株的EF-Tu 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3.4 EF-Tu 蛋白T 細(xì)胞和B 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

使用IEDB 免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.iedb.org/）對(duì)EF-Tu 蛋白進(jìn)行表位預(yù)測(cè)，其中EF-Tu 的T 細(xì)胞表位選擇MHCⅡ類表位，選取IC50 值小于50 nM 的T 細(xì)胞表位；線性B 細(xì)胞表位選擇Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0 預(yù)測(cè)方法，閾值設(shè)置為0.500，選取閾值大于0.500 的線性B 細(xì)胞表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 EF-Tu 蛋白基本理化性質(zhì)

S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus 和E.coli EF-Tu 分別由398、398、398、394、409 個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為44 kda 左右；等電點(diǎn)分別為4.83、4.92、4.97、4.74、5.25；帶負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu）總數(shù)分別為69、66、67、67、63 個(gè)，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）總數(shù)為42、42、44、38、47 個(gè)；不穩(wěn)定系數(shù)分別為37.57、36.69、36.72、35.86、29.70，均屬于理化性質(zhì)穩(wěn)定蛋白；平均親水性數(shù)值分別為-0.329、-0.299、-0.320、-0.251、-0.180、-0.287，EF-Tu 存在大量的親水基團(tuán)（結(jié)果詳見圖1），屬于親水蛋白。

圖1 EF-Tu 蛋白親水性分析Fig.1 Hydrophilic analysis of EF-Tu proteins

2.2 EF-Tu 蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus 和E.coli EF-Tu 蛋白分別含有11、13、11、17、19 個(gè)α-螺旋區(qū)和19、20、20、20、23 個(gè)β-折疊區(qū)；α-螺旋分別占26.63%、24.37%、22.86%、30.96%、29.58%，β-折疊分別占22.11%、24.62%、23.62%、21.07%、26.41%；無 規(guī) 則 卷 曲 分 別 占51.26% 、53.32% 、47.97% 、44.01%、47.59%。表明EF-Tu 可形成結(jié)構(gòu)域，且其中無規(guī)則卷曲占比較多，更易形成T 細(xì)胞或B 細(xì)胞表位，詳見圖2。

圖2 EF-Tu 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Secondary structure prediction of EF-Tu protein

對(duì)EF-Tu 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，與在線網(wǎng)站中的模板相比，其一致性分別為73.54%、72.01%、71.25%、73.79%、73.21%，說明預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)真實(shí)有效。結(jié)果如圖3 所示。

圖3 EF-Tu 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Tertiary structure prediction of EF-Tu protein

2.3 EF-Tu 核苷酸和氨基酸序列同源性分析及序列比對(duì)結(jié)果

對(duì)這些菌株的EF-Tu 核苷酸和氨基酸序列同源性分析顯示，核苷酸序列同源性為100.0%～21.8%，其中S.agalactiae 與S.dysgalactiae 的核苷酸序列同源性最高，為93.8%～94.1%；S.dysgalactiae 和S.uberis與E.coli 的核苷酸序列同源性低，為21.8%～43.9%。而氨基酸序列同源性為100.0%～21.8%，其中S.agalactiae 與S.dysgalactiae 和S.uberis 氨基酸序列同源性高，均超過91%；S.agalactiae 與E.coli 的氨基酸序列同源性最低為68.4%～69.4%（結(jié)果見表1）。說明EF-Tu 核苷酸序列同源性變化范圍大，且無意義核苷酸突變較多，而氨基酸序列同源性較高。

表1 EF-Tu 基因核苷酸與推導(dǎo)氨基酸同源性分析（%）Table 1 Homology analysis of EF-Tu nucleotide and derived amino acid（%）

選取分離株S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、E.coli、S.aureus 各一株的EF-Tu 氨基酸序列為代表進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis EF-Tu 氨基酸序列相似，僅存在少量的氨基酸突變，但三種鏈球菌與S.aureus、E.coli EF-Tu 的氨基酸序列存在一些差異（詳見圖4）。

圖4 EF-Tu 蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Amino acid sequence alignment of EF-Tu protein

2.4 EF-Tu 蛋白T 細(xì)胞和B 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

以 分 離 株S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus、E.coli 各一株為代表，將其EF-Tu 氨基酸序列輸入到IEDB 免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢，篩選出共同T 細(xì)胞表位和B 細(xì)胞表位。如圖4 所示，在預(yù)測(cè)的T細(xì)胞表位和B 細(xì)胞表位中，S.aureus 和E.coli 的EFTu 氨基酸序列54～64 位，存在3 個(gè)氨基酸缺失，且其他氨基酸全部突變；在第186～190、269～273、377、388位均存在突變。各個(gè)菌株均保守的CD4+T 細(xì)胞表位11 個(gè)、線性B 細(xì)胞表位7 個(gè)。結(jié)果如表2、表3。

表2 CD4+T 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果Table 2 Prediction results of CD4+T cell epitopes

表3 線性B 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果Table 3 Prediction results of linear B-cell epitopes

3 討論

由于引起奶牛乳腺炎的病原菌種類多，且隨著耐藥菌株的不斷增加，抗生素的治療效果越來越差，使得接種疫苗成為防治奶牛乳腺炎感染的重要策略。在以往的奶牛乳腺炎疫苗研究中，雖然研究確定了很多候選疫苗抗原，但到目前為止，尚缺少單一抗原蛋白防治多種病原菌感染的候選疫苗的研究。1975 年Lancefield 和同事[10]首次證實(shí)，B 群鏈球菌免疫后，兔體內(nèi)存在多種特異性保護(hù)性抗體以及多血清型交叉保護(hù)，使人們認(rèn)識(shí)到GBS 表面蛋白的多樣性及其在免疫方面的作用。近年的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法與體內(nèi)外免疫保護(hù)作用研究方法相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了許多具有良好免疫原性的蛋白質(zhì)抗原，并用于各種疫苗研究開發(fā)。由于多種鏈球菌感染均可引起奶牛乳房炎，因而可誘導(dǎo)機(jī)體抗多種鏈球菌感染的疫苗對(duì)預(yù)防鏈球菌性奶牛乳房炎具有重要價(jià)值。過去實(shí)驗(yàn)室對(duì)鏈球菌共同抗原蛋白GapC 的對(duì)小鼠免疫接種發(fā)現(xiàn)其可對(duì)三種鏈球菌均具有抗感染能力，由此認(rèn)為EF-Tu 蛋白作為抗原同樣可以誘導(dǎo)交叉免疫保護(hù)作用。

早在1981 年，Weiser，J[11]對(duì)S.aureus 的EF-Tu蛋白研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的免疫原性，血清學(xué)實(shí)驗(yàn)證明S.aureus 的EF-Tu 與E.coli 的EF-Tu 有部分交叉免疫反應(yīng)，推斷其具有結(jié)構(gòu)相似性。后來，在E.coli[12]、豬鏈球菌[13]、非分型流感嗜血桿菌[14]、豬肺炎支原體[15]、枯草芽孢桿菌[16]、幽門螺旋桿菌[17]等也證明EFTu 蛋白可誘導(dǎo)宿主動(dòng)物產(chǎn)生免疫反應(yīng)，且免疫保護(hù)率高于60%。這些研究結(jié)果為我們選擇EF-Tu 蛋白作為預(yù)防和控制多種病原菌引起的奶牛乳腺炎的疫苗候選抗原提供了依據(jù)。EF-Tu 蛋白種屬間具有良好的保守性，且能分泌到胞外并粘附到菌體表面，有成為誘導(dǎo)抗多種病原菌感染候選疫苗抗原的潛力，因此，研究對(duì)分離于奶牛乳腺炎病牛乳汁的S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus、E.coli 菌 株EFTu 進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明在三種鏈球菌中EF-Tu 同源性超過91%，與S.aureus 和E.coli同源性也超過68%。對(duì)其表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，選取共同T表位11 個(gè)，B 細(xì)胞表位7 個(gè)，說明其具有良好的免疫原性和一定的交叉免疫保護(hù)作用，但尚需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

研究使用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)分析，證明S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus、E.coli EF-Tu 發(fā)現(xiàn)EF-Tu 在不同種屬中均具有較高的核苷酸和氨基酸同源性，并篩選其共同的T、B 細(xì)胞表位，說明其具有良好的免疫原性和一定的交叉免疫保護(hù)作用，對(duì)進(jìn)一步探討EF-Tu 作為抗S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus、E.coli 感染疫苗候選抗原提供了參考。