朱吟非，譚美，吳新怡，王超，段翰英

(暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632)

大豆富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維及人體必需的維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價值和廣闊的應(yīng)用范圍。然而，大豆中存在的植酸、胰蛋白酶抑制劑和單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子大大降低了其營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用率。植酸是植物種子中存在的一種天然化合物，通過與蛋白質(zhì)、氨基酸和礦物質(zhì)結(jié)合，形成不溶性化合物，從而阻礙營養(yǎng)物質(zhì)的消化釋放[1]；單寧為水溶性的酚類化合物，也可通過與營養(yǎng)物質(zhì)絡(luò)合、降低細(xì)胞膜的通透性從而使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)難以被溶出利用[2]；胰蛋白酶抑制劑則通過對胰腺絲氨酸蛋白酶的抑制影響蛋白質(zhì)的消化，降低大豆的營養(yǎng)價值[3]。

前期的有關(guān)研究均已表明包括擠壓、發(fā)芽、發(fā)酵、浸泡、酶處理、輻照和熱處理等加工方式可部分提高豆類的蛋白質(zhì)、淀粉的消化率及其綜合營養(yǎng)利用率。例如，發(fā)芽是提高蛋白質(zhì)體外消化率和礦物質(zhì)保留率的有效方法[4]，但也會導(dǎo)致脂肪、碳水化合物、賴氨酸、色氨酸、蘇氨酸和含硫氨基酸的顯著減少[3]；雖然熱處理能夠提高豆類的體外蛋白質(zhì)消化率[5]，但由于大部分營養(yǎng)物質(zhì)熱穩(wěn)定性較差，熱處理也會導(dǎo)致其發(fā)生不良的物理、化學(xué)變化，降低食品的營養(yǎng)價值。此外，上述加工方式都改變了食品本來的形態(tài)、質(zhì)構(gòu)和特性，對其風(fēng)味及可加工性產(chǎn)生了不同程度的不利影響。

超高壓處理(high hydrostatic pressure，HHP)是目前應(yīng)用較廣的一類高效非熱加工技術(shù)，廣泛應(yīng)用于食品的殺菌、鈍酶、改變理化特性等方面。HHP只破壞食品大分子結(jié)構(gòu)(淀粉、蛋白質(zhì)等)中的非共價鍵，但對維生素和氨基酸等小分子沒有影響[6]。已經(jīng)有研究表明[7]，在HHP作用下，蛋白質(zhì)分子的氫鍵、離子鍵、水合作用和疏水相互作用發(fā)生改變，破壞了蛋白質(zhì)的三級和四級結(jié)構(gòu)，提高了蛋白質(zhì)的體外消化率。趙貴川[8]認(rèn)為，這是由于高壓處理后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，暴露出更多的酶切位點，提高了酶對蛋白質(zhì)的催化效率，從而提高了蛋白質(zhì)的可消化性。LINSBERGER-MARTIN等[9]發(fā)現(xiàn)在60 ℃條件下施加600 MPa的壓力，豌豆和大豆中的蛋白質(zhì)消化率顯著增加，但是過高的壓力反而會降低蛋白質(zhì)的體外消化率[10]。HHP處理還可能會通過破壞非共價鍵和二硫鍵等結(jié)構(gòu)，降低胰蛋白酶抑制劑的活性[11]，從而提高蛋白質(zhì)的消化率。此外，適當(dāng)?shù)膲毫μ幚砜商岣叩鞍踪|(zhì)的溶解性，使蛋白質(zhì)更易被消化吸收[12]。HHP還可以破壞淀粉的結(jié)構(gòu)與功能，降低淀粉的消化率，有益于人體健康[13]。

HHP處理還可以通過減少抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量或作用從而減少與氨基酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)與其結(jié)合，使更多的氨基酸和礦物質(zhì)釋放以提高營養(yǎng)物質(zhì)的生理功能和生物利用率[14]。如大豆中的內(nèi)源性植酸酶有可能被HHP激活，從而將植酸水解為磷酸鹽和肌醇衍生物，減少其與蛋白質(zhì)、淀粉和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的結(jié)合，提高營養(yǎng)物質(zhì)的生理活性和消化率。適當(dāng)?shù)腍HP處理可以使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更加松散、反應(yīng)位點暴露，與單寧結(jié)合、凝集進(jìn)而降低單寧的含量[15]。

雖然已有文獻(xiàn)報道了對不同豆科植物中發(fā)芽和HHP處理可能提高營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用率，但未直接比較發(fā)芽和HHP處理對大豆中蛋白、淀粉、游離氨基酸、礦物質(zhì)消化率及其與抗?fàn)I養(yǎng)因子植酸和單寧相關(guān)性的報道，對相關(guān)性質(zhì)仍缺乏全面系統(tǒng)的研究。因此，本研究通過綜合比較發(fā)芽和不同HHP處理條件下大豆?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的體外消化率的影響，并分析其與植酸和單寧含量的相關(guān)性，為開發(fā)高品質(zhì)大豆產(chǎn)品，促進(jìn)HHP在大豆加工方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(原產(chǎn)地：中國黑龍江)牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、α-淀粉酶、尿酸、葡萄糖醛酸、豬膽鹽、黏蛋白、氨基葡萄糖鹽酸鹽、胰淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、氨基酸(組氨酸His、苯丙氨酸Phe、賴氨酸Lys、蘇氨酸Thr、谷氨酰胺Gln、亮氨酸Leu、色氨酸Trp、羥脯氨酸Hpro、甘氨酸Gly、天冬氨酸Asp、天冬酰胺Asn、絲氨酸Ser、γ-氨基丁酸GABA、異亮氨酸Ile、谷氨酸Glu、纈氨酸Val、丙氨酸Ala、脯氨酸Pro、蛋氨酸Met、酪氨酸Tyr、精氨酸Arg、瓜氨酸Cit)標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)、Ca、Fe和Zn 標(biāo)準(zhǔn)元素儲備液(1 000 mg/L)，美國Sigma-Aldrich公司；K-PHYT檢測試劑盒，愛爾蘭Megazyme公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CQC-2L-600 MPa HHP設(shè)備，北京速原中天科技股份有限公司；Sorvall ST 16R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾有限公司；SCIENTZ-18 N 冷凍干燥機(jī)，寧波生物科技股份有限公司；氨基酸分析儀、UV-1750紫外可見分光光度計，日本島津公司；ETHOS UP微波消解系統(tǒng)，意大利邁爾斯通公司；7700 X ICP-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，Agilent Technologies公司；采用Milli-Q水凈化系統(tǒng)純化分析用水。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆預(yù)處理

大豆用蒸餾水浸泡16 h后分別進(jìn)行發(fā)芽和HHP處理并保存部分未浸泡的原料大豆。

發(fā)芽處理：發(fā)芽3 d；HHP處理：分為6組，大豆在浸泡完成后瀝水，采用密封袋真空密封，分別用300、450、600 MPa壓力處理5、10 min。以上所有處理均于常溫條件下進(jìn)行。

全部處理完成后將處理后的樣品及原料大豆冷凍干燥2 d并研磨成粉末，于4 ℃冷藏保存待測。

1.3.2 大豆樣品體外消化

采用WANG等[16]的方法進(jìn)行消化，消化液配方如表1所示。圖1為體外消化的具體步驟。完成口腔、胃、腸消化后，取上清液冷凍待測。

對用于測定礦物質(zhì)體外利用率的樣品處理時，為了減少消化液中Ca的干擾，對消化液配方進(jìn)行了調(diào)整。胃液：2.5 g/L胃蛋白酶溶液，pH 2.0；十二指腸液：9.0 g/L胰酶溶液，pH 7.5；膽汁：30.0 g/L豬膽鹽溶液，pH 6.5；用同樣的方法進(jìn)行體外模擬消化處理。

表1 消化液配比Table 1 Chemical composite of digestive juice

圖1 體外消化流程圖Fig.1 Flow diagram of the in vitro digestive procedure

1.3.3 游離氨基酸(free amino acids，F(xiàn)AAs)含量的測定

采用GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》的方法，利用氨基酸分析儀進(jìn)行測定。

配制混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 mol/mL)，用檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=2.2)稀釋為混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 nmol/mL)。取0.2 mL消化后上清液與2 mL 0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液混合，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，得樣品測定液。將混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品測定液分別以相同體積注入氨基酸分析儀，以外標(biāo)法通過峰面積計算樣品測定液中氨基酸的濃度。

色譜條件：進(jìn)樣量20 μL，每個樣品分析時間約53 min。色譜柱：磺酸型陽離子樹脂分離柱；泵1流速：0.40 mL/min；泵2流速：0.35 mL/min；檢測器溫度：137 ℃；柱溫：57 ℃;檢測波長：第一通道570 nm，第二通道440 nm。

1.3.4 淀粉消化量(invitrostarch digestibility，IVSD)的測定

用胰淀粉酶(2 500 U/mg)混懸液(0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH=6.9)酶解淀粉后測定不同處理的大豆粉(50 mg/mL)的IVSD。按照修改后SINGH等[17]的方法，將消化后上清液和酶懸浮液按3∶1的體積比在37 ℃水浴酶解2 h后，加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑。溶液于100 ℃水浴9 min后立即冷卻，靜置顯色20 min。以試劑空白(即不加樣品)做參比，在550 nm處測量過濾后溶液的吸光度[18]，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出消化前后葡萄糖含量差值并換算為淀粉的消化量。

1.3.5 Fe、Zn、Ca體外消化率(invitroprotein digestibility，IVPD)的測定

根據(jù)GB 5009.268—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測定》的方法，采用電感耦合等離子質(zhì)譜儀測定。

測定前用密閉微波消解系統(tǒng)(最大壓力1 450 psi，最高溫度300 ℃)進(jìn)行微波消解。取0.2 g消化后上清液放入聚四氟乙烯容器中，加入10 mL濃HNO3在微波消解系統(tǒng)中消解，待冷卻至室溫后用雙去離子水稀釋至50 mL，并設(shè)置空白對照組。然后用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定Fe、Zn、Ca的含量。通過各元素特定的分子質(zhì)量進(jìn)行定量，測定待測元素和內(nèi)標(biāo)元素的信號響應(yīng)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到消解液中待測元素的濃度。

1.3.6 植酸含量的測定

使用Megazyme檢測試劑盒K-PHYT進(jìn)行植酸含量的測定[19]。

取1 g不同處理的豆粉樣品加入20 mL鹽酸(0.66 mol/L)中，振蕩16 h后離心。在11 000 r/min條件下離心10 min，中和后得磷提取液。分別進(jìn)行總磷和游離磷的脫磷酸化，加入植酸酶和堿性磷酸酶，植酸即水解為肌醇和無機(jī)磷酸鹽。取離心所得上清，加入顯色劑顯色，磷酸基團(tuán)(Pi)將鉬酸銨還原成鉬藍(lán)，在655 nm處測定所得溶液的吸光度即與Pi的含量成正比。同時繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度值計算總磷和植酸。

1.3.7 單寧含量的測定

采用GB/T 27985—2011《飼料中單寧的測定》的方法，通過分光光度法測定消化后上清液中的單寧含量(以單寧酸計)。

取樣品消化后上清液1.00 mL，置盛有約30 mL水的50 mL容量瓶中，加鎢酸鈉-磷鉬酸混合溶液2.5 mL、碳酸鈉溶液5.0 mL，用水定容至50 mL，搖勻。放置30 min顯色后，以0.00 mg/L單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白，同樣測定試樣溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算試液中單寧酸的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗均進(jìn)行3次平行，結(jié)果用平均數(shù)±方差表示。采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并用IBM SPSS Statistics 24、STATA14軟件進(jìn)行ANOVA方差分析與多重比較(P<0.05)，用Origin 2018進(jìn)行柱形圖的繪制，用R3.4.0進(jìn)行熱圖聚類分析和偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對大豆體外消化后FAAs含量的影響

蛋白質(zhì)消化率低是導(dǎo)致豆科植物營養(yǎng)價值下降的主要原因之一[20]，由FAAs含量的測定結(jié)果可以直接反映不同處理組之間蛋白質(zhì)的IVPD差異。對不同處理組的各FAAs體外消化后的含量歸一化處理后繪制聚類熱圖(圖2)。結(jié)果表明，相對于原料大豆，300 MPa以及發(fā)芽處理未能提高FAAs含量，而450 MPa和600 MPa處理后FAAs含量有明顯提升，其中經(jīng)600 MPa/5 min處理的樣品各氨基酸體外消化率最高，說明較高壓力HPP處理能促進(jìn)FAAs的體外釋放和IVPD。有報道指出[21]，發(fā)芽使綠豆IVPD從15%增加到25%，鷹嘴豆由6%增加到17%，豇豆由6%增加到17%；XIA等[22]報道了經(jīng)不同HHP條件處理的紅豆粉FAAs均有明顯提升，ZHONG等[23]則發(fā)現(xiàn)在600 MPa和60 ℃處理30 min的條件下，黑豆的IVPD顯著提高了約2.8%。這可能是因為適當(dāng)?shù)膲毫μ幚砜梢允沟鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)松散，水分子進(jìn)入內(nèi)部，同時酶促位點暴露從而加速酶促反應(yīng)，促進(jìn)FAAs的釋放從而使含量提高。同時，HHP處理改變了蛋白質(zhì)及酶抑制劑的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)更易被水解，從而提高了大豆的IVPD[24]。

圖2 不同處理的FAAs含量熱圖Fig.2 Heatmap of different treatments on the FAAs content

就氨基酸種類而言，各處理組前后變化差別不大。比較值得注意的是，精氨酸(Arg)和瓜氨酸(Cit)發(fā)芽與原料大豆的FAAs含量幾乎沒有差別；而游離酪氨酸含量(Tyr)除原料大豆外，其他所有處理組的稍有提高；此外，樣品經(jīng)過300 MPa/10 min處理后，蛋氨酸(Met)含量有較為明顯的提高，與蛋氨酸相對含量最高的600 MPa/5 min處理組相近。

利用PLS-DA法對不同處理組總氨基酸含量進(jìn)行分析(圖3)。PLS-DA相較于主成分分析(principal component analysis，PCA)有監(jiān)督功能，具有更加客觀的優(yōu)勢，適合用于進(jìn)行特征選擇。圖中每個點代表一個含量值，各處理組的相關(guān)性與距離有關(guān)，距離越近，相關(guān)性越高。從圖3中可以看出，部分處理組有較明顯的區(qū)分。其中發(fā)芽組在分析圖的中部偏左下方；450 MPa/10 min與600 MPa/10 min處理組的結(jié)果有較強(qiáng)的相關(guān)性，位于分析圖的中部偏右上方；450 MPa/5 min 位于中部偏上方；300 MPa/5 min處理組與未處理組相關(guān)性較強(qiáng)，聚在分析圖上部偏左側(cè)；300 MPa/10 min處理組聚在上部；600 MPa/5 min在右下方。該結(jié)果與熱圖分析大致相同，表明模型穩(wěn)定可靠。

圖3 不同處理對FAAs含量影響的分析(PLS-DA)Fig.3 Effects of different treatments on the content of FAAs (PLS-DA)

2.2 不同處理對大豆體外IVSD的影響

將不同處理對體外消化后IVSD的影響以含量(%)形式表示(圖4)。發(fā)芽顯著提高大豆的體外IVSD，提高到未處理組的2.42倍(P<0.05)。而HHP處理中，600 MPa/10 min的大豆體外IVSD顯著比未處理組降低了38%(P<0.05)，其余HHP處理條件的影響則不明顯(P>0.05)。高壓處理可能使得淀粉晶體結(jié)構(gòu)和其他層次結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致淀粉的吸收消化減少，消化率降低[25]。LIU等[26]發(fā)現(xiàn)HHP處理高粱淀粉會使得其快速消化淀粉含量減少，慢性消化淀粉和抗性淀粉含量增加。故將HHP技術(shù)應(yīng)用到進(jìn)行以大豆為原料食品的開發(fā)中，可以用于生產(chǎn)抗性淀粉含量高、升糖指數(shù)低的功能性食品。但也有報道認(rèn)為，HHP的處理會使得淀粉消化率升高[27]，這與其他食物成分(如蛋白質(zhì)、脂類、抗?fàn)I養(yǎng)因子)、含量和加工技術(shù)的影響有關(guān)[28]。

圖4 不同處理對體外IVSD的影響Fig.4 Effects of different treatments on IVSD注:不同小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 不同處理對大豆中Fe、Zn、Ca的IVPD的影響

未處理組大豆的Fe、Zn、Ca的初始含量分別為94.19、32.1、1 950 mg/kg，不同處理的大豆在體外消化后Ca、Fe、Zn的消化率如圖5～圖7所示。發(fā)芽處理能顯著提高Fe和Zn的消化率(P<0.05)，分別提高到2.07、3.50倍，但對Ca消化率沒有影響。450 MPa/10 min 和600 MPa/10 min的HHP處理也能顯著提高Fe的消化率，分別提高到2.06和1.63倍，此外600 MPa/5 min處理也能將Fe的消化率提高12%(P<0.05)。HHP所有處理對Zn的消化率提高都達(dá)到了顯著水平，其中300 MPa/10 min達(dá)到了未處理組的3.51倍。對于Ca，300 MPa/10 min后消化率提升了1.91倍，其次是600 MPa/5 min、450 MPa/5 min和450 MPa/5 min，分別提高了1.38、1.37和1.35倍(P<0.05)。礦物質(zhì)消化率的提高可能是大豆在發(fā)芽和HHP處理過程中更多地將與大分子螯合的金屬釋放從而游離出來。此外，食物中的抗?fàn)I養(yǎng)因子(植酸、單寧等)也會影響到Ca、Fe的吸收。也有研究表明，食品中不同礦物質(zhì), 如Na與K、Ca與Mg、Mn與Fe、Fe與Cu、Zn與Cu同時存在時，會產(chǎn)生一定程度的抑制吸收作用[29]。

圖5 不同處理對體外消化過程中Fe的消化率的影響Fig.5 Effects of different treatments on the digestibility of Fe

圖6 不同處理對體外消化過程中Zn的消化率的影響Fig.6 Effects of different treatments on the digestibility of Zn

圖7 不同處理對體外消化過程中Ca的消化率影響Fig.7 Effects of different treatments on the digestibility of Ca

2.4 不同處理對大豆植酸含量的影響

植酸含量結(jié)果如圖8所示。與未處理組相比，除發(fā)芽、300 MPa HHP處理組的植酸含量顯著下降外(P<0.05)，其他處理組的植酸含量均無顯著變化(P>0.05)。這與LINSBERGER-MARTIN等[9]的HHP處理豆類結(jié)果相似，植酸含量未見顯著變化。然而，LEE等[20]報道了400、500及600 MPa可以顯著降低紅豆粉中的植酸含量(P<0.05)，任順成等[30]也發(fā)現(xiàn)麥麩在400 MPa/20 min的處理后，植酸含量出現(xiàn)了顯著降低(P<0.05)。這些研究結(jié)果的差異可能與不同研究對象及處理條件有關(guān)。另有報道發(fā)現(xiàn)，羽扇豆的植酸含量隨發(fā)芽過程中植酸酶活性的提高而顯著下降[31](P<0.05)，結(jié)論與本研究相符。

圖8 不同處理對植酸含量的影響Fig.8 Effects of different treatments on phytic acid content

2.5 不同處理對大豆單寧含量的影響

單寧含量結(jié)果如圖9所示。與未處理組相比，發(fā)芽處理組的單寧含量顯著提高；HHP處理中只有450 MPa/10 min組的單寧含量有顯著下降(P<0.05)，其余無顯著變化(P>0.05)，且不同HHP處理條件之間并無顯著性差異。BELMIRO等[32]的研究結(jié)果表明，50 MPa/1 min、50 MPa/10 min和600 MPa/1 min的處理降低了豆類30%～40%的單寧含量；ZHONG等[23]也發(fā)現(xiàn)黑豆經(jīng)600 MPa和60 ℃處理30 min后，單寧含量顯著降低(P<0.05)。因此，可以通過HHP預(yù)處理降低大豆中的可溶性單寧含量，減少其對營養(yǎng)物質(zhì)的抑制吸收作用，并增強(qiáng)以大豆為原料的產(chǎn)品適口性。

圖9 不同處理對單寧含量的影響Fig.9 Effects of different treatments on Tannin content

3 結(jié)論

結(jié)果表明，較高壓力(450、600 MPa)的HHP處理能提高大豆各FAAs含量和IVPD，但未影響氨基酸種類的分布。發(fā)芽提高了大豆的IVSD至2.42倍而600 MPa/10 min則降低了38%。Fe的消化率經(jīng)發(fā)芽、450 MPa/10 min和600 MPa/10 min處理后分別提高至2.07、2.06和1.63倍，經(jīng)600 MPa/5 min處理后則提高了12%(P<0.05)。發(fā)芽和各超高壓處理組均能顯著提高Zn的消化率(P<0.05)，最高為3.51倍(300 MPa/10 min)。發(fā)芽未對Ca的消化率產(chǎn)生影響，而HPP處理中最高提高到1.91倍(300 MPa/10 min)。發(fā)芽、300 MPa處理組的植酸含量顯著降低(P<0.05)，450 MPa/10 min的HHP處理可以顯著降低單寧含量(P<0.05)。綜上，一定壓強(qiáng)和時間的HHP處理能夠顯著提高大豆中主要營養(yǎng)物質(zhì)的消化率并且降低植酸、單寧的含量，但是對每種營養(yǎng)物質(zhì)影響的HHP處理條件不同；發(fā)芽可以提升大多數(shù)營養(yǎng)物質(zhì)的利用率并且有效降低植酸含量，但不能降低單寧的含量，也不能提高Ca的體外消化率。本研究為開發(fā)新的大豆非熱加工工藝提供了理論依據(jù)。