韓科，王夜梅，周胡懌，梁道崴，趙其陽,3，焦必寧,3*

1(西南大學(xué) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶，400712)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，重慶，400712) 3(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，重慶，400712)

柑橘害螨具有極強(qiáng)的繁殖性和抗殺螨性，已對(duì)部分化學(xué)殺螨劑產(chǎn)生了抗性，柑橘產(chǎn)業(yè)中迫切需要新的殺螨劑以解決現(xiàn)有殺螨劑的抗性問題[1-2]。腈吡螨酯是日本日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社研發(fā)的新型高活性吡唑類殺螨劑，具有防效好、對(duì)非靶標(biāo)生物安全等優(yōu)點(diǎn)，在柑橘產(chǎn)業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景[1,3]。但根據(jù)日本食品安全委員會(huì)的研究，攝入腈吡螨酯可能會(huì)對(duì)人體造成肝細(xì)胞肥大、腎臟褐色素沉積和視網(wǎng)膜萎縮等不良影響[4]，但我國尚未建立該藥在食品中的最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)[5]。

柑橘類水果季節(jié)性較強(qiáng)，常通過加工延長保質(zhì)期[6]。橙汁是世界上貿(mào)易量和消費(fèi)量最大的柑橘加工產(chǎn)品[7]，全世界近80%的甜橙被用于生產(chǎn)橙汁或各種提取物[8]，生產(chǎn)橙汁產(chǎn)生的副產(chǎn)物也被應(yīng)用于開發(fā)富含纖維的食品[9]或用作食品調(diào)味劑[10]，但部分加工工序可能會(huì)使產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留水平升高，增加食品的膳食風(fēng)險(xiǎn)[11-13]。柑橘加工產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留水平與農(nóng)藥性質(zhì)和加工方法等因素有關(guān)[14]。LI等[11]研究了吡蟲啉、咪鮮胺等5種農(nóng)藥在橙汁商業(yè)化加工過程中的殘留消解規(guī)律，發(fā)現(xiàn)榨汁是降低柑橘中農(nóng)藥殘留的有效手段，果汁中的農(nóng)藥殘留量僅占鮮果中殘留量的1.0%～4.5%，但是脂溶性農(nóng)藥在皮精油中發(fā)生了富集?？迪见惖萚12]研究了阿維菌素在橙汁加工過程中的殘留行為，發(fā)現(xiàn)阿維菌素的殘留量在榨汁后顯著降低，但在皮精油中的殘留量達(dá)到了3.48 mg/kg，富集倍數(shù)可達(dá)30倍。LI等[13]用家用榨汁機(jī)對(duì)柑橘全果進(jìn)行榨汁，發(fā)現(xiàn)腈吡螨酯的殘留濃度會(huì)在果汁中升高。因此，關(guān)注農(nóng)藥殘留在食品加工過程中的殘留動(dòng)態(tài)，有助于我們對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行更準(zhǔn)確的膳食暴露評(píng)估[15]，但目前尚未見腈吡螨酯在橙汁商業(yè)化加工過程中殘留行為的報(bào)道。

基于此，本研究模擬橙汁商業(yè)化加工過程進(jìn)行加工試驗(yàn)，使用改進(jìn)的QuEChERS法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)定量分析柑橘及其制品中的腈吡螨酯殘留，以明確腈吡螨酯在橙汁商業(yè)化加工過程中的殘留行為，以期為腈吡螨酯在柑橘加工食品中的安全評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腈吡螨酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度97.39%),金諦澤浩科技(北京)有限公司；乙腈、甲醇(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；甲酸(分析純)，成都市科龍化工試驗(yàn)場(chǎng)；無水硫酸鎂、氯化鈉(分析純)，江蘇強(qiáng)盛化工有限公司；乙二胺基-N-丙基(primary secondary amine，PSA)、十八烷基鍵合相硅膠(C18)，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotube，MWCNTs)(純度98%，內(nèi)徑10～20 nm)，成都中科時(shí)代納能科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290-6495 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司；CL31/CL31R多用途離心機(jī)，美國Thermo Fisher公司；IKA VORTEX GENIUS 3渦旋混勻器，重慶市瑞利電子儀器設(shè)備有限公司；CK2000型高通量組織研磨儀，北京Thmorgan生物科技有限公司；有機(jī)相針式濾器(0.22 μm)，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 田間試驗(yàn)

田間試驗(yàn)按照NY/T 3095—2017《加工農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》進(jìn)行，供試品種為普通甜橙，試驗(yàn)樣地分別位于重慶和湖南。在柑橘成熟前使用電動(dòng)噴霧器以最高推薦劑量的5倍(750 mg a.i./kg)均勻噴施30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))腈吡螨酯懸浮劑1次，于15 d后(推薦安全間隔期)采收完好無損、無病蟲害的果實(shí)，并立即進(jìn)行橙汁加工。

1.3.2 加工過程

橙汁加工在國家柑桔工程技術(shù)研究中心進(jìn)行，以保證與橙汁商業(yè)化加工過程所使用的技術(shù)保持一致，加工程序參照康霞麗等[12]的方法，每批次加工鮮果質(zhì)量約為1 500 kg，每次加工前使用CIP自動(dòng)清洗系統(tǒng)清洗設(shè)備管道，在不同加工工序下隨機(jī)采集清洗前全果、清洗前果肉、清洗后全果、清洗后果肉、初榨果汁、精濾果汁、非濃縮還原(not from concentrate,NFC)汁、濃縮果汁、皮渣、油水混合物和皮精油共9種樣品，每種樣品平行取樣3次，貯存在-20 ℃下待測(cè)。

1.3.3 檢測(cè)方法

1.3.3.1 前處理方法

采用改進(jìn)的QuEChERS 法進(jìn)行樣品制備。準(zhǔn)確稱取9種基質(zhì)各5.00 g于50 mL離心管中(皮精油稱取2.00 g 并加入5 mL去離子水)，加入10.00 mL乙腈，振蕩提取4 min；加入2.00 g無水硫酸鎂和0.50 g 氯化鈉，振蕩3 min后以10 000 r/min離心4 min；移取3.00 mL上清液于裝有50 mg PSA+50 mg C18+10 mg MWCNTs的離心管中，渦旋30 s后以3 800 r/min離心3 min，移取上清液過0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.3.3.2 色譜條件

色譜柱為Agilent eclipse plus C18柱(2.1 mm×50 mm, 1.8 μm)；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量1 μL；流動(dòng)相A：0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液；流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫程序：0～0.2 min，90% A；0.2～1.0 min，90%～10% A；1.0～4.5 min，10% A，后沖洗時(shí)間0.5 min。

1.3.3.3 質(zhì)譜條件

離子源：AJS-ESI+；干燥氣溫度250 ℃；干燥氣流速14 L/min；氮?dú)鈮毫?0 psi；鞘氣溫度375 ℃；鞘氣流速12 L/min；毛細(xì)管電壓4 000 V；噴嘴電壓 500 V；iFunnel高：200 V，低：100 V。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)模式進(jìn)行離子檢測(cè)，定性轉(zhuǎn)化為m/z394.2→310.3 (碰撞能量，35 V)，定量轉(zhuǎn)化為m/z394.2→254.1 (碰撞能量，30 V)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用加工因子(processing factor, PF)表示加工過程中農(nóng)藥殘留量的變化，其計(jì)算式見公式(1)：

(1)

PF值<1，表明加工過程中農(nóng)藥殘留水平降低，反之則表示殘留水平升高[11]。

使用IBM SPSS Statistics 20和Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗(yàn)證

分別使用9種空白基質(zhì)提取液配置質(zhì)量濃度分別為2.5、10、50、200、500、1 000 μg/L的腈吡螨酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積(y)和質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性擬合，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)(R2)。通過加標(biāo)回收試驗(yàn)來檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度和精密度，每種基質(zhì)設(shè)置0.01、0.1、2 mg/kg 3個(gè)添加水平，每個(gè)添加水平重復(fù)5次，從而得到不同基質(zhì)中腈吡螨酯的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)，以3倍信噪比作為檢出限(limit of detection，LOD)，以最低添加水平作為定量限(limit of quantitation，LOQ)。結(jié)果如表1所示，腈吡螨酯在2.5～1 000 μg/L質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，R2>0.99。3個(gè)添加水平下柑橘及其制品中腈吡螨酯的平均回收率為77%～109%，RSD為0.99%～9.57%，LOD為0.005～0.093 μg/kg，LOQ均為10 μg/kg。方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》的要求，適用于不同柑橘加工產(chǎn)品中腈吡螨酯殘留的檢測(cè)。

表1 腈吡螨酯在柑橘及其加工產(chǎn)品中的檢測(cè)方法驗(yàn)證Table 1 Validation of the method for the determination of cyenopyrafen in citrus and its processing products

2.2 腈吡螨酯在橙汁商業(yè)化加工過程中的殘留行為

2.2.1 加工試驗(yàn)可行性分析

在試驗(yàn)開展前使用自來水清洗加工設(shè)備并采集清洗液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明設(shè)備和自來水中不含腈吡螨酯殘留；在加工當(dāng)日隨機(jī)檢測(cè)3份未清洗果，結(jié)果如表2所示，兩地原料果中腈吡螨酯的殘留量均大于0.1 mg/kg，滿足NY/T 3095—2017《加工農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》的要求(原料果中目標(biāo)農(nóng)藥的殘留量要大于10倍LOQ或0.1 mg/kg)。因此，可以確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可接受性。

2.2.2 腈吡螨酯在清洗果中的殘留

清洗是橙汁商業(yè)化加工的第1步，本試驗(yàn)使用自來水和鼓泡機(jī)清洗原料果5 min后獲得清洗果。如表2所示，清洗分別去除了兩地柑橘全果中9.3%和17.2%的腈吡螨酯殘留，PF分別為0.907和0.828，而去皮分別使柑橘中的腈吡螨酯殘留量降低了86.4%和75.9%，表明腈吡螨酯的主要?dú)埩舨课粸楣?，這與LI等[13]的研究結(jié)果一致。清水清洗可以不同程度地降低柑橘中的農(nóng)藥殘留，對(duì)于正辛醇/水分配系數(shù)(Kow)較小的農(nóng)藥，如谷硫磷(Kow=2.96)、噻苯咪唑(Kow=2.47)等，清水清洗后殘留去除率很高[16]；脂溶性農(nóng)藥和內(nèi)吸性農(nóng)藥容易遷移到柑橘果皮的蠟質(zhì)層或果肉中[17]，因此清洗僅能去除果皮表面的腈吡螨酯(Kow=5.60)殘留，而對(duì)柑橘內(nèi)部的農(nóng)藥殘留影響有限。LI等[11]和康霞麗等[12]研究了橙汁加工過程對(duì)農(nóng)藥殘留的影響，發(fā)現(xiàn)清洗可以去除柑橘果皮表面的農(nóng)藥殘留，但很難去除果肉中的農(nóng)藥殘留，其中氟啶胺(Kow=4.87)的去除率僅為16.6%，但多菌靈(Kow=1.51)的去除率可達(dá)85.4%。

表2 腈吡螨酯在柑橘及其加工產(chǎn)品中的殘留量和PFTable 2 Residue levels and PF for orange products and by-products during commercial processing

除農(nóng)藥本身的性質(zhì)外，清洗方法、清洗時(shí)間等也會(huì)影響清洗效果[14]。楊沖等[18]比較了臭氧水浸泡、自來水浸泡和自來水超聲對(duì)草莓中乙唑螨酯等12種農(nóng)藥的去除效果，發(fā)現(xiàn)浸泡時(shí)間相同，臭氧水浸泡對(duì)草莓中的農(nóng)藥殘留去除率最高，其次為自來水超聲和自來水浸泡。楊霄鴻等[19]比較了奶粉浸泡、清水浸泡等6種方法對(duì)黃瓜和草莓中吡唑嘧菌酯和嘧菌酯的去除效果，發(fā)現(xiàn)使用奶粉溶液浸泡處理可以去除黃瓜和草莓中60%～69%的農(nóng)藥殘留，而清水浸泡僅能去除黃瓜和草莓中22%～41%的農(nóng)藥殘留。IM等[20]研究了不同清洗時(shí)間和不同清洗溶液對(duì)棗果中毒死蜱殘留的去除效果，發(fā)現(xiàn)2%(體積分?jǐn)?shù))乙酸溶液能夠去除棗果中87%～99%的毒死蜱殘留，并且當(dāng)清洗時(shí)間為60 min時(shí)去除率最高，而使用清水沖洗僅能去除約50%的毒死蜱殘留。

腈吡螨酯脂溶性較強(qiáng)，在水中的溶解度很小(0.30 mg/L，20 ℃)[13]，因此用清水清洗殘留去除率較低，在橙汁加工過程中可使用不同的清洗方式增加柑橘中腈吡螨酯殘留的去除率。

2.2.3 腈吡螨酯在果汁中的農(nóng)藥殘留

使用JBT全果榨汁機(jī)直接壓榨清洗后全果可得到初榨果汁。如表2所示，在初榨果汁中腈吡螨酯的殘留量分別為0.040和0.097 mg/kg，殘留量分別降低了94.8%(PF=0.052)和93.6%(PF=0.064)，PF均小于0.1，榨汁過程顯著降低了柑橘中的腈吡螨酯殘留。根據(jù)IM等[20]的報(bào)道，內(nèi)吸性農(nóng)藥的Kow值越大，柑橘榨汁后越不容易殘留在果汁中。腈吡螨酯脂溶性較強(qiáng)，在柑橘皮渣和果汁分離過程中仍然大量殘留在皮渣中，所以在初榨果汁中只有很低的殘留量。YIGIT等[14]也發(fā)現(xiàn)，殘留在蘋果和番茄中的脂溶性農(nóng)藥在榨汁后殘留量會(huì)顯著降低。但可能由于水果的類型和加工工藝不同，農(nóng)藥的Kow值與葡萄汁和番茄汁中的農(nóng)藥殘留率沒有關(guān)聯(lián)[20]。

初榨果汁經(jīng)過螺旋榨汁機(jī)加工后，可得到精濾果汁。如表2所示，兩地的精濾果汁中腈吡螨酯的殘留量分別為0.029和0.091 mg/kg，僅占原料果中殘留量的3.8% (PF=0.038)和6.0% (PF=0.060)，可能由于精濾過濾掉了附著在果汁顆粒物上的農(nóng)藥分子，因此精濾果汁中的農(nóng)藥殘留量比初榨果汁中的農(nóng)藥殘留量低。LI等[11]和康霞麗等[12]也發(fā)現(xiàn)吡蟲啉、阿維菌素等農(nóng)藥的殘留量會(huì)在精濾后少量降低。

精濾果汁真空脫氣后經(jīng)95 ℃殺菌45 s，然后迅速冷卻至37 ℃左右可得到NFC果汁。由表2可知，NFC果汁中的腈吡螨酯殘留量分別為0.067和0.112 mg/kg，分別是原料果中殘留量的8.6% (PF=0.086)和11.2% (PF=0.112)。熱處理可以有效控制加工產(chǎn)品中的有害微生物，同時(shí)也可能降低加工產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留水平。JANKOWSKA等[21]研究了熱處理對(duì)水果中24種農(nóng)藥殘留的影響，發(fā)現(xiàn)多數(shù)農(nóng)藥在熱處理后去除率超過50%。但可能受殺菌時(shí)水分少量散失以及腈吡螨酯熱穩(wěn)定高的影響，本試驗(yàn)NFC果汁中的農(nóng)藥殘留量比初榨果汁和精濾果汁中的農(nóng)藥殘留量高。

將離心后的精濾果汁在三效四體降膜蒸發(fā)器中濃縮，設(shè)置進(jìn)料溫度為107 ℃，出料溫度為50～60 ℃，可得到固形物含量為65%的濃縮果汁。如表2所示，濃縮果汁中腈吡螨酯的殘留質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.158和0.535 mg/kg，PF分別為0.205和0.350，濃縮果汁中的農(nóng)藥殘留量仍然顯著低于鮮果中的殘留量，并且濃縮果汁食用前一般會(huì)加水稀釋，因此腈吡螨酯的殘留水平會(huì)進(jìn)一步降低[11]。果汁濃縮過程中會(huì)散失大量水分，腈吡螨酯熱穩(wěn)定性較高，濃縮時(shí)不易揮發(fā)和降解，因此與其他3種果汁相比，腈吡螨酯的濃度在濃縮果汁中較高。

2.2.4 腈吡螨酯在皮渣和皮精油中的殘留

柑橘全果在經(jīng)過JBT全果榨汁機(jī)壓榨后，在廢料出口可收集到皮渣。如表2所示，皮渣中腈吡螨酯的殘留量分別達(dá)到了1.185和1.680 mg/kg，PF均大于1(1.538和1.101)，可能由于腈吡螨酯主要?dú)埩舨课粸楣?，所以在皮渣中的濃度較高。

將榨汁過程中噴淋榨汁機(jī)收集的油水混合物泵入一級(jí)離心機(jī)中進(jìn)行分離，可得到皮精油。如表2所示，兩地的皮精油中腈吡螨酯的殘留量顯著高于其他加工產(chǎn)品中的殘留量，殘留量分別為11.841和19.005 mg/kg，是清洗前全果殘留量的15.360和12.456倍?？赡苡捎陔孢硫ヒ兹芙庠谟退旌衔镏校?dāng)進(jìn)行油/水分離時(shí)，其便富集在皮精油中；也可能是皮精油中富含具有良好溶解性的d-苧烯，使農(nóng)藥易滲透進(jìn)入果皮蠟質(zhì)層，導(dǎo)致皮精油中腈吡螨酯的殘留量升高[12]。LI等[11]和康霞麗等[12]的研究也發(fā)現(xiàn)，阿維菌素(Kow=4.4)和氯氰菊酯(Kow=6.6)等脂溶性農(nóng)藥在皮精油中易富集，但吡蟲啉(Kow=0.57)和多菌靈(Kow=1.51)等水溶性農(nóng)藥的殘留量卻低于原料果中的殘留量。因此在利用柑橘皮精油的過程中，需重視腈吡螨酯等脂溶性農(nóng)藥的殘留風(fēng)險(xiǎn)。

2.2.5 腈吡螨酯在柑橘加工產(chǎn)品中的PF

如表2所示，腈吡螨酯在不同產(chǎn)地的橙汁加工產(chǎn)品中，PF存在一定差異，可能是兩地氣候條件和栽培模式不同，使得腈吡螨酯在柑橘果實(shí)中的分布不同導(dǎo)致[14]。此外，腈吡螨酯在不同橙汁加工產(chǎn)品中的PF不同。清洗果和4種果汁中腈吡螨酯的PF均小于1，表明腈吡螨酯在清洗和榨汁后殘留量降低；腈吡螨酯在皮渣和皮精油中的PF>1，表明腈吡螨酯在皮渣和皮精油中殘留量升高。2個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的初榨果汁中，PF均較小(0.052和0.097)，表明榨汁是降低腈吡螨酯殘留的有效手段。

3 結(jié)論

本研究通過橙汁商業(yè)化加工，明確了腈吡螨酯在橙汁加工過程中的PF和殘留行為。結(jié)果表明，4種果汁中腈吡螨酯的殘留量均顯著低于柑橘鮮果中的殘留量，PF均小于1，證明榨汁是降低柑橘中腈吡螨酯殘留的有效途徑；在柑橘皮精油中，腈吡螨酯的殘留量顯著高于原料果中的殘留量，富集倍數(shù)可達(dá)15倍，因此在綜合利用皮精油的過程中應(yīng)該注意腈吡螨酯的殘留風(fēng)險(xiǎn)。本研究有助于對(duì)腈吡螨酯進(jìn)行更準(zhǔn)確的膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，推進(jìn)腈吡螨酯在柑橘產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用以及柑橘中腈吡螨酯MRL的制定。