朱帥 祖玲玲 徐嵩

有數(shù)據(jù)[1]表明，肺癌是全球第二最常見的癌癥，但是肺癌導(dǎo)致的死亡依然占據(jù)最大的比例。84%的肺癌是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），確診的肺癌中只有20%-30%可以通過根治性手術(shù)治療[2]。免疫檢查點抑制劑，如程序性死亡受體-1（programmed cell death protein 1, PD-1）、程序性死亡配體-1（programmed cell death protein ligand 1, PD-L1）和細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4）抑制劑，已在黑色素瘤、腎癌、NSCLC和其他腫瘤中顯示出良好的療效[3-5]。盡管免疫檢查點抑制劑在肺腺癌患者中有顯著的臨床療效和持久的應(yīng)答，但抗PD-1/PD-L1治療在肺腺癌患者群體中的總有效率僅為20%-30%[6]。因此，迫切需要尋找其他有利于預(yù)測免疫治療對肺腺癌患者的生物標記物以提高免疫治療有效率，包括腫瘤細胞相關(guān)生物標記物、腫瘤免疫微環(huán)境（tumor microenviroment, TME）相關(guān)生物標記物、液體活檢相關(guān)生物標記物和宿主相關(guān)標記物。

網(wǎng)狀體家族基因 1（Reticulon family gene 1,RTN1）（以前稱為“神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白”）是一種與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的網(wǎng)狀體編碼基因。網(wǎng)狀體在神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的膜運輸或神經(jīng)內(nèi)分泌分泌中起關(guān)鍵作用。RTN1編碼3個變體，即NSP-A、NSP-B和NSP-C，它們通過同源C末端區(qū)域中的2個假定跨膜結(jié)構(gòu)域連接到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[7-10]。

先前的研究[11,12]已將RTN1作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥的潛在診斷/治療標志物引入。RTN1被認為是具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的癌癥的潛在標記物[8]。已有研究[11]表明，RTN1可降低BCL2樣蛋白1（BCL2L1）編碼的一種蛋白[即B細胞淋巴瘤-特大型（BCL-XL）]的抗凋亡活性。事實上，RTN1可以改變此蛋白的亞細胞定位，從線粒體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而破壞其抗細胞凋亡的作用。

然而在肺腺癌患者中RTN1的表達情況及其對免疫微環(huán)境影響均未有報道。在本研究中，我們旨在使用公共數(shù)據(jù)庫和生物信息學網(wǎng)絡(luò)工具研究RTN1在肺癌中的表達及其與肺癌中免疫浸潤和存活的相關(guān)性。這些發(fā)現(xiàn)或許將有助于確定肺癌預(yù)后的潛在生物標志物，并有助于個體化免疫治療。

1 材料與方法

1.1 The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫 TCGA（https://www.cancer.gov/tcga）是一個公共資助的項目，旨在通過大規(guī)?；蚪M測序，在30多個人類腫瘤的大型隊列中編目和發(fā)現(xiàn)主要的致癌基因組變化[13]。TCGA包括RNA測序、miRNA測序、DNA測序、DNA甲基化測序和臨床信息。從TCGA下載肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）患者的轉(zhuǎn)錄組和臨床資料，通過整理獲得516例患者的表達矩陣和臨床信息。

1.2 GEPIA 2數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA 2（http://gepia2.cancerpku.cn/）是基因表達譜交互分析的更新版，用于分析來自TCGA和GTEx程序的9,736個腫瘤和8,587個正常樣本的RNA測序表達數(shù)據(jù)[14,15]。進行腫瘤/正常組織差異表達分析、患者生存分析、相似基因檢測、相關(guān)分析和降維分析。用GEPIA2軟件分析LUAD患者RTN1表達與TCGA數(shù)據(jù)和GTEx數(shù)據(jù)匹配的差異，并分析RTN1的預(yù)后意義。

1.3 TIMER數(shù)據(jù)庫分析 TIMER是用于系統(tǒng)分析不同癌癥類型的免疫浸潤的綜合資源（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）TIMER應(yīng)用先前發(fā)表的統(tǒng)計方法來從基因表達譜推斷腫瘤浸潤免疫細胞的豐度[16,17]。TIMER數(shù)據(jù)庫包括來自癌癥TCGA的32種癌癥類型的10,897個樣本，用于估計免疫浸潤的豐度[18]。我們通過基因模塊分析了不同類型癌癥中的RTN1表達以及RTN1表達與免疫浸潤豐度的相關(guān)性，包括B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。針對腫瘤純度的基因表達水平顯示在最左側(cè)的面板上。

1.4 人類蛋白質(zhì)圖譜（Human Protein Atlas, HPA） 人類蛋白質(zhì)圖譜（https://www.proteinatlas.org/）于2003年啟動，利用多種組學技術(shù)繪制細胞、組織和器官中的所有人類蛋白質(zhì)圖譜，包括基于抗體的成像、基于質(zhì)譜儀的蛋白質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學和系統(tǒng)生物學。HPA由組織、單細胞類型、病理、血液、腦和細胞圖譜組成。計算機檢索HPA病理圖譜中的“RTN1”（“肺癌”為癌類型）。然后，我們檢查了每一幅圖像的細節(jié)，并選擇了LUAD中具有代表性的癌癥和鄰近樣本的圖像。

1.5 基因集富集分析 從TCGA下載516例LUAD患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并根據(jù)RTN1表達的中值將RTN1表達高或低分組。GSEA檢測到兩組中排名靠前的基因富集的通路。在每次分析中，基因組排列設(shè)置為1,000。

1.6 統(tǒng)計學分析 本研究統(tǒng)計學分析均通過在線網(wǎng)站TIMER 2.0（http://timer.comp-genomics.org/）完成。使用Wilcoxon檢驗分析兩組樣本的差異。使用Pearson卡方檢驗分析RTN1表達與臨床特征變量之間的關(guān)聯(lián)。Cox比例風險回歸模型用于單變量和多變量分析。統(tǒng)計學差異設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 RTN1表達高低與患者臨床病理特征之間的關(guān)系 我們的分析發(fā)現(xiàn)，RTN1的表達水平與肺腺癌患者的生命狀態(tài)、年齡、性別、吸煙史、腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（Tumor Node Metastasis, TNM）分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移等臨床病理特征之間存在關(guān)聯(lián)。根據(jù)RTN1 mRNA水平的中值，258例患者被歸類為RTN1高表達，258例患者被歸類為RTN1低表達。如表1所示，RTN1表達與肺腺癌患者的生命狀態(tài)（P=0.003）和性別（P＜0.001）顯著相關(guān)。RTN1表達與其他臨床病理因素之間無顯著相關(guān)性，包括年齡（P=0.222）、吸煙史（P=0.068）、TNM分期（P=0.160）、腫瘤大?。≒=0.162）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.166）和遠處轉(zhuǎn)移（P=0.640）。

表1 RTN1高低表達肺腺癌患者臨床基本信息Tab 1 Analysis of clinical data of lung adenocarcinoma patients with high and low expression of RTN1

2.2 RTN1在肺腺癌中表達情況及預(yù)后分析 為了研究腫瘤和正常組織之間RTN1表達水平的差異，我們使用TIMER 2.0和GEPIA 2分析RNA-seq數(shù)據(jù)。TIMER 2.0，將TCGA腫瘤組織與正常組織匹配，GEPIA 2，將TCGA腫瘤組織與GTEx數(shù)據(jù)匹配。應(yīng)用TIMER 2.0分析正常組織樣本和LUAD組織樣本，結(jié)果（圖1A）顯示LUAD組織中RTN1的 mRNA 水平顯著低于正常組織。我們還發(fā)現(xiàn)，RTN1在大多數(shù)實體癌中是較低的，包括結(jié)腸腺癌、肺鱗癌、大腸腺癌和甲狀腺癌。應(yīng)用GEPIA 2的分析結(jié)果也證實了RTN1在LUAD組織中低表達（圖1B）。這些數(shù)據(jù)表明，LUAD患者的RTN1表達降低。同時為了研究RTN1在LUAD中的預(yù)后價值，我們使用GEPIA 2中的Kaplan-Meier生存分析工具分析了TCGA的預(yù)后數(shù)據(jù)。其結(jié)果表明（圖1C），RTN1的高表達與患者更長的OS顯著相關(guān)（HR=0.6,P=0.000）。

圖1 RTN1在LUAD中表達與預(yù)后情況。A: TIMER數(shù)據(jù)庫預(yù)測RTN1在肺腺癌組織表達情況；B: GEPIA2數(shù)據(jù)庫預(yù)測RTN1在肺腺癌組織表達情況；C: RTN1表達與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。 Fig 1 The expression level and prognostic value of RTN1 in patients with lung adenocarcinoma. A: Increased or decreased expression of RTN1 in cancers compared with adjacent normal tissue in TIMER database; B: Decreased expression of RTN1 in cancers compared with adjacent normal tissue in GEPIA database; C: The relationship between RTN1 expression and prognosis of patients with lung adenocarcinoma; LUAD: lung adenocarcinoma.

2.3 GO及KEGG富集分析RTN1調(diào)節(jié)相關(guān)通路 對TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者的測序數(shù)據(jù)分析，取logFC＜1及FDR＜0.05做差異分析，我們發(fā)現(xiàn)共有245個基因上調(diào)，23個基因下調(diào)。對這些差異表達基因通過GO及KEGG富集分析后，我們發(fā)現(xiàn)其可能參與吞噬體的形成、造血細胞形成和細胞黏附的過程，且在GO富集分析中可以發(fā)現(xiàn)RTN1在T細胞活化起著重要作用，這提示我們該基因可能可以參與免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)（圖2A，圖2B）。

圖2 RTN1高表達患者基因通路富集分析。A：火山圖；B：KEGG及GO富集分析。Fig 2 GSEA pathways enriched in samples with high RTU1 expression. A: Volcanic map; B: KEGG and GO analysis.

2.4 LUAD中與RTN1共表達的基因分析 為了進一步研究RTN1在LUAD中的抑癌作用，我們使用cBioPortal與TCGA數(shù)據(jù)來分析與RTN1共表達正相關(guān)的基因。我們選擇了與RTN1最顯著相關(guān)的6個基因（圖3A-圖3F）。我們使用TIMER進一步驗證了RTN1與這些基因之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，RTN1與BTK、CD4、ECSF1R、MNDA、NCKAP1L和SNX20顯著相關(guān)（圖3G-圖3L）。

圖3 LUAD中RTN1的共表達基因。A-F: cBioPortal數(shù)據(jù)庫肺腺癌隊列鑒定與RTN1共表達的基因；G-L：TIMER數(shù)據(jù)庫肺腺癌隊列鑒定與RTN1共表達的基因。Fig 3 Co-expressed genes of RTN1 in LUAD. A-F: The genes co-expressed with RTN1 in LUAD were assessed in cBioPortal database; G-L: The genes co-expressed with RTN1 in LUAD were assessed in the TIMER database.

2.5RTN1及其共表達基因?qū)Ψ伟┙M織免疫相關(guān)細胞浸潤水平的影響分析 我們使用TISCH數(shù)據(jù)集在單細胞水平上（EMTAB6149和GSE131907）研究了LUAD腫瘤微環(huán)境中RTN1的表達。在EMTAB6149中，RTN1主要在免疫細胞中表達，包括B細胞、漿細胞、CD8 T ex細胞、CD8 T細胞、CD4 Tconv細胞、單/巨噬細胞、肥大細胞和調(diào)節(jié)性T細胞。RTN1在惡性細胞中輕度表達；然而，它幾乎不在內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和肺泡細胞中表達。在GSE131907中，RTN1主要在B細胞、CD4 Tconv細胞、漿細胞、CD8 T細胞、CD8 Tex細胞、樹突細胞、單/巨噬細胞和肥大細胞中表達，而在內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、上皮細胞和少突膠質(zhì)細胞。此外，我們使用TIMER數(shù)據(jù)庫來探索RTN1表達與免疫細胞浸潤之間的關(guān)系。TIMER顯示RTN1表達與幾種類型的浸潤免疫細胞呈正相關(guān)，包括B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞（圖 4）。

我們發(fā)現(xiàn)RTN1與幾種免疫細胞之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（圖5）。CIBERSORT結(jié)果顯示，RTN1高表達組CD4+T細胞、肥大細胞、單核細胞、髓樣樹突狀細胞和M1型巨噬細胞顯著上調(diào)（圖5），提示LRMP可能與免疫檢查點有關(guān)。為進一步研究RTN1與免疫檢查點之間的關(guān)系，我們將12例LUAD患者分為兩組，比較兩組免疫檢查點的表達水平。G1組RTN1高表達，而G2組RTN1低表達。

圖5 RTN1不同表達分組間的肺腺癌患者免疫微環(huán)境差異（續(xù)圖）。G1：高表達; G2：低表達。Fig 5 Changes of immune microenvironment in lung adenocarcinoma patients with different expression of RTN1 (continued). G1: high expression of RTN1; G2: low expression of RTN1.

圖5 RTN1不同表達分組間的肺腺癌患者免疫微環(huán)境差異。G1：高表達; G2：低表達。 Fig 5 Changes of immune microenvironment in lung adenocarcinoma patients with different expression of RTN1. G1: high expression of RTN1; G2: low expression of RTN1.

2.6 RTN1表達與免疫檢查點密切相關(guān) 高低表達患者并將其分別G1（高表達）組及G2（低表達）組，使用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，RTN1表達與常見免疫檢查點CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1LG2、TIGIT、SIGLEC15等的表達顯著相關(guān)（圖6），提示我們RTN1可能與免疫檢查點密切相關(guān)，且有望在免疫治療中發(fā)揮作用。

圖6 RTN1表達量對免疫檢查點表達的影響Fig 6 The influence of RTN1 on the expressions of immune checkpoints

3 討論

基因表達異常與肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，并預(yù)示著肺腺癌患者的預(yù)后。然而，肺腺癌和其腫瘤微環(huán)境相互作用的分子機制尚不清楚。在本研究中，我們證明RTN1在LUAD組織中的表達顯著降低，并且與LUAD患者的生命狀態(tài)、性別等有關(guān)。此外，RTN1的低表達與預(yù)后和總存活率有關(guān)。這些結(jié)果提示RTN1可能是一種腫瘤抑制基因，參與了肺腺癌的進展。

RTN1是一種與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的網(wǎng)狀體編碼基因。RTN1在神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的膜運輸或神經(jīng)內(nèi)分泌分泌中起關(guān)鍵作用，同時RTN1作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥的潛在診斷/治療標志物。然而在肺腺癌患者中RTN1的表達情況及其對免疫微環(huán)境影響均未有報道。本研究旨在使用公共數(shù)據(jù)庫和生物信息學網(wǎng)絡(luò)工具研究 RTN1在肺癌中的表達及其與肺癌中免疫浸潤和存活的相關(guān)性。在本項研究中，我們發(fā)現(xiàn)RTN1在多種癌癥中異常表達，表明它可能在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用。在LUAD中，我們發(fā)現(xiàn)RTN1在腫瘤組織中的表達明顯低于在正常組織中的表達，提示RTN1可能參與了LUAD的腫瘤抑制作用。此外，本研究還驗證了RTN1在LUAD細胞系和腫瘤組織中的表達降低。

為了進一步探討RTN1在LUAD腫瘤發(fā)生中的分子功能和可能的機制，我們進行了GSEA分析，以探索在RTN1高表達的樣本中豐富的途徑。共選擇了15條與細胞黏附、免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路。在KEGG富集分析中發(fā)現(xiàn)其與“Hematopoietic cell lineage”信號通路可能有密切關(guān)系，同時GO富集分析發(fā)現(xiàn)其與T細胞的活化可能有密切關(guān)系。

我們通過TCGA和TIMER數(shù)據(jù)庫雙重驗證，發(fā)現(xiàn)RTN1與BTK、CD4、ECSF1R、MNDA、NCKAP1L和SNX20顯著相關(guān)。進一步對其共表達相關(guān)基因進行分析后，我們發(fā)現(xiàn)RTN1表達改變時也會引起免疫效應(yīng)細胞如CD4+T細胞，CD8+T細胞比例的升高[19,20]。免疫微環(huán)境中效應(yīng)細胞比例的升高往往提示著患者的較好預(yù)后。最后我們發(fā)現(xiàn)RTN1表達與常見免疫檢查點CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1LG2、TIGIT、SIGLEC15等的表達顯著相關(guān)。

盡管我們的研究結(jié)果表明RTN1與免疫浸潤相關(guān)并可作為LUAD的預(yù)后生物標志物，但該研究仍有一些局限性。首先，我們的研究基于有限的數(shù)據(jù)樣本，可能存在一定的偏差。其次，該發(fā)現(xiàn)是否適用于所有具有不同分子改變的LUAD患者仍有待證實。綜上所述，RTN1可能作為一種腫瘤抑制基因并表明更好的預(yù)后。此外，RTN1與可能參與LUAD中免疫治療反應(yīng)的免疫浸潤有關(guān)。需要進一步的研究來驗證這些發(fā)現(xiàn)。

Author contributions

Zhu S wrote the article. Zu LL completed the figures and tables. Xu S conceived, organized and edited the text. All authors contributed to the article and approved the submitted version.