趙雪蓮 ,蘭建龍 ,楊正明 , ,李奕松 ,海來(lái)約布 ,崔 琪 ,李文兵 , *,李利民,劉 圓 , ,
1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院,四川 成都 610041
2.四川省羌彝藥用資源保護(hù)與利用技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610225
3.青藏高原民族藥用資源保護(hù)與利用國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610225
4.西南民族大學(xué)青藏高原研究院,四川 成都 610041
5.西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院,四川 成都 610041
6.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院,四川 成都 610041
痛風(fēng)是由嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄能力降低引起的一種終身性的疾病[1],已成為繼糖尿病的第2大代謝疾病?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,長(zhǎng)期食用高嘌呤食物,機(jī)體產(chǎn)生的尿酸鹽超出正常代謝量,使尿酸鹽沉積于結(jié)締組織、骨骼關(guān)節(jié)、腎臟等部位。痛風(fēng)患者體內(nèi)嘌呤代謝紊亂,血液中的尿酸排泄減少或者生成過多,在腎間質(zhì)的髓質(zhì)、遠(yuǎn)端集合管易形成高尿酸鹽的晶體沉積,進(jìn)而導(dǎo)致痛風(fēng)性腎病,其臨床表現(xiàn)為腰部酸痛、尿量增加、輕度尿蛋白、尿血、腎功能不全、高血壓、水腫等,少數(shù)可表現(xiàn)為急性腎衰竭[2,3]?,F(xiàn)代臨床治療痛風(fēng)常用藥物有秋水仙堿、非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素類等,雖在短期可緩解疼痛,但停藥會(huì)復(fù)發(fā),不良反應(yīng)較大,無(wú)法改善病理[4]。因此,安全有效的治療手段及新藥研發(fā)顯得極為迫切。
彝藥痛風(fēng)顆粒(Yi Medicine Tongfeng Granules,YMTG)以萆薢丸為基礎(chǔ)方進(jìn)行加減化裁。萆薢丸出自《太平圣惠方》卷十九,具有堅(jiān)骨益筋、養(yǎng)血固發(fā)的功效,主治風(fēng)濕痹癥、肢體疼痛、不能行步等[5]。YMTG在此方基礎(chǔ)上減去方中附子、白術(shù)、枳殼,加入虎杖、土茯苓、甘草等。土茯苓具有泄?jié)嵘⒔Y(jié)、通利關(guān)節(jié)等功效[6],甘草為補(bǔ)氣健脾之要藥,虎杖為治療痛風(fēng)的傳統(tǒng)中彝藥。YMTG原以湯劑服用,具有清熱祛濕、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)、通絡(luò)止痛之功效,在彝醫(yī)臨床用于治療痛風(fēng)已有30余年,療效確切。因此,本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法結(jié)合G1-熵權(quán)法優(yōu)選YMTG的最佳水提工藝,并評(píng)價(jià)其對(duì)痛風(fēng)性腎病的藥效作用,為YMTG的新藥開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
Waters 2695型高效液相色譜儀,沃特世科技(上海)有限公司;ME電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TSJ-Q型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、BMJ-III型包埋機(jī),常州中威電子儀器廠;萊卡2135輪轉(zhuǎn)式切片機(jī),德國(guó)Leica公司;CX31光學(xué)顯微鏡,日本Olympus公司;D2型大鼠代謝籠,上海澤雅科教儀器有限公司。
對(duì)照品綠原酸(批號(hào)110753-201817,質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%)、虎杖苷(批號(hào)11575-201603,質(zhì)量分?jǐn)?shù)87.3%)、落新婦苷(批號(hào)111798-201805,質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.6%)、咖啡酸(批號(hào)110885-201703,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%),中國(guó)食品藥品檢定研究院;對(duì)照品新綠原酸(批號(hào)2008030,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.56%)、隱綠原酸(批號(hào)20042105,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.37%),成都康邦生物科技有限公司;對(duì)照品新落新婦苷(批號(hào)18051405,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、異落新婦苷(批號(hào)18051404,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%),成都普菲德生物科技有限公司。
苯溴馬隆片(批號(hào)1907935),德國(guó)赫曼大藥廠;戊巴比妥鈉(進(jìn)口分裝),中國(guó)醫(yī)藥公司上?;瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站;腺嘌呤(批號(hào)H205BA0016),生工生物工程(上海)股份有限公司;高活性干酵母,安琪酵母股份有限公司;尿酸(批號(hào)20210605)、肌酐(批號(hào)20210615)、尿素氮(批號(hào)20210617)、黃嘌呤氧化酶試劑盒(批號(hào)20210612),南京建成生物工程研究所;甲醇為色譜純,其余試劑均為分析級(jí)。
藥材蘇木、石韋、土茯苓、桃仁、虎杖、萆薢、甘草均購(gòu)自四川新荷花中藥飲片股份有限公司,批號(hào)分別為1911015、2002086、2004063、2003132、1912147、2002133、2002165;紅牛膝采自四川省涼山彝族自治州木里藏族自治縣白碉苗族鄉(xiāng),采集日期2020-11-10;藥材均經(jīng)西南民族大學(xué)青藏高原研究院劉圓教授鑒定,蘇木為豆科蕓實(shí)屬植物蘇木Caesalpinia sappanL.的干燥心材、石韋為水龍骨科石韋屬植物石韋Pyrrosia lingua(Thunb.) Farwell.的干燥葉、土茯苓為百合科菝葜屬植物光葉菝葜Smilax glabraRoxb.的干燥塊莖、桃仁為薔薇科櫻桃屬植物桃Prunus persica(L.) Batsch的干燥成熟種子、虎杖為蓼科蓼屬植物虎杖Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根莖和根、萆薢為薯蕷科薯蕷屬植物萆薢Dioscorea tokoroMakino的干燥根莖、甘草為豆科甘草屬植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖、紅牛膝為莧科杯莧屬植物頭花杯莧Cyathula capitataMoq.的干燥根。
SD大鼠,6~8周齡,SPF級(jí),體質(zhì)量為180~220 g,雌雄各半,四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(川)2018-19。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循四川省中醫(yī)藥科學(xué)院有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定,均符合3R原則。
2.1.1 色譜條件 Agilent Zorbax C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相,梯度洗脫:0~20 min,12%~30%甲醇;20~60 min,30%~60%甲醇;體積流量為1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm(檢測(cè)新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、虎杖苷)、289 nm(檢測(cè)新落新婦苷、落新婦苷、異落新婦苷);柱溫30 ℃;色譜圖見圖1。
圖1 混合對(duì)照品溶液 (A、B)、供試品溶液 (C、D) 的HPLC圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances solution (A, B) and test sample (C, D)
2.1.2 混合對(duì)照品溶液制備 取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、虎杖苷、新落新婦苷、落新婦苷、異落新婦苷對(duì)照品適量,精密稱定,置于25 mL量瓶中,加入甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得質(zhì)量濃度分別為24.6、33.4、25.4、8.1、64.1、24.7、24.3、8.0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。
2.1.3 供試品溶液制備 按處方量稱取方中飲片,按正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表進(jìn)行煎煮,分別合并各煎煮液,加水稀釋至相同體積,取5 mL,5000 r/min離心5 min,取上清液0.45 μm微孔濾膜濾過,即得供試品溶液。
2.1.4 線性關(guān)系考察 分別吸取混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 μL,按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,以測(cè)得峰面積(Y)與各對(duì)照品質(zhì)量(X)進(jìn)行線性回歸,得到相應(yīng)的回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r),結(jié)果分別為新綠原酸Y=2 136 333.83X+14 716.49,r=0.999 2,線性范圍24.6~246.5 ng;綠原酸Y=3 107 086.15X+15 162.74,r=0.999 7,線性范圍33.4~334.0 ng;隱綠原酸Y=2 351 663.02X+7 766.79,r=0.999 8,線性范圍25.4~254.0 ng;咖啡酸Y=4 902 635.63X+8 500.47,r=0.999 2,線性范圍8.1~81.0 ng;虎杖苷Y=3 543 062.67X+26 742.37,r=0.999 9,線性范圍64.1~641.0 ng;新落新婦苷Y=2 072 512.33X+7 350.55,r=0.999 7,線性范圍24.7~247.0 ng;落新婦苷Y=2 283 757.89X+6 822.31,r=0.999 9,線性范圍24.3~243.0 ng;異落新婦苷Y=2 370 275.61X+960.45,r=0.999 9,線性范圍8.0~80.0 ng。
2.1.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液10 μL,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,連續(xù)6次,記錄各指標(biāo)成分峰面積,結(jié)果顯示新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、虎杖苷、新落新婦苷、落新婦苷、異落新婦苷8種指標(biāo)成分峰面積的RSD分別為0.73%、0.53%、0.74%、0.56%、1.46%、0.91%、0.93%、1.45%,表明該儀器精密度良好。
2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 量取設(shè)計(jì)方案試驗(yàn)號(hào)1供試品溶液10 μL,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,分別在制樣后的0、2、6、12、18、24、30、36 h進(jìn)樣檢測(cè),考察各成分峰面積的變化情況,計(jì)算峰面積RSD值,得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、虎杖苷、新落新婦苷、落新婦苷、異落新婦苷8種指標(biāo)成分峰面積的RSD分別為1.61%、1.75%、1.81%、1.98%、2.13%、2.56%、1.90%、2.29%,說明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取6份處方量樣品,精密稱定,按設(shè)計(jì)方案試驗(yàn)號(hào)1進(jìn)行配制,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄測(cè)得峰面積,計(jì)算各成分含量,得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、虎杖苷、新落新婦苷、落新婦苷、異落新婦苷8種指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.81%、0.62%、1.85%、0.86%、0.62%、0.78%、1.06%、0.82%,說明該方法重復(fù)性良好。
2.1.8 專屬性試驗(yàn) 取除虎杖、土茯苓和石韋以外的方中飲片,按最佳提取工藝,制備陰性對(duì)照液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明,陰性樣品未同時(shí)出現(xiàn)與虎杖苷、落新婦苷、新落新婦苷和異落新婦苷色譜保留時(shí)間一致的色譜峰,表明處方中其他藥味對(duì)4種指標(biāo)成分的測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾,專屬性強(qiáng)。而酚酸類成分,方中其他藥味對(duì)測(cè)定結(jié)果存在一定干擾,專屬性不強(qiáng)。
2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 按處方稱取1/2處方量飲片,稱取6份,按各成分含量的50%加入新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、虎杖苷、新落新婦苷、落新婦苷、異落新婦苷8種對(duì)照品,按設(shè)計(jì)方案試驗(yàn)號(hào)1制備方法制供試品溶液,濾過,以“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算8種成分的加樣回收率,結(jié)果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、虎杖苷、新落新婦苷、落新婦苷、異落新婦苷的平均加樣回收率分別為99.81%、97.94%、97.53%、99.60%、101.7%、97.19%、97.17%、99.49%,RSD分別為1.00%、1.07%、0.71%、1.28%、1.85%、0.72%、1.10%、1.62%。
2.1.10 樣品測(cè)定 取各供試品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,外標(biāo)法計(jì)算各指標(biāo)成分含量及其提取率。
分別取各煎煮液25 mL,放入已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中,蒸干,于105 ℃烘箱中干燥3 h,取出,置干燥器中冷卻30 min,精密稱定質(zhì)量,計(jì)算出膏率。
2.3.1 G1主觀賦權(quán) G1法是一種計(jì)算快、無(wú)需一致性檢驗(yàn)的主觀評(píng)價(jià)方法。首先確定評(píng)級(jí)指標(biāo)序的關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)根據(jù)YMTG復(fù)方的藥效物質(zhì),確定YMTG中9個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的序關(guān)系為新綠原酸(1)=綠原酸(2)=隱綠原酸(3)=咖啡酸(4)=虎杖苷(5)=新落新婦苷(6)=落新婦苷(7)=異落新婦苷(8)>出膏率(9);其次確定相鄰指標(biāo)間的相對(duì)重要程度,確定其r1=r2=r3=r4=r5=r6=r7=r8=1,r9=1.2[8]。最后進(jìn)行各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)(wk)的計(jì)算。
wk-1=rkwk,k=m,m-1,…,2(m為評(píng)價(jià)指標(biāo)個(gè)數(shù))
2.3.2 熵權(quán)法客觀賦值 熵權(quán)法是根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)值的變異程度來(lái)確定指標(biāo)權(quán)數(shù)的,這是一種客觀賦權(quán)法,避免了人為因素帶來(lái)的偏差,使精度較高客觀性更強(qiáng),能夠更好的解釋所得到的結(jié)果。指標(biāo)的變異程度越小,所反映的信息量也越少,其對(duì)應(yīng)的權(quán)值也應(yīng)該越低。根據(jù)原理計(jì)算YMTG各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)(wj),計(jì)算的具體步驟按王繼龍等[9]所用方法。
2.3.3 組合權(quán)重確定 設(shè)由G1法得到的主觀權(quán)重為w1,熵權(quán)法得到的客觀權(quán)重為w2,則組合權(quán)重為wj,按計(jì)算公式(2)進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果見表1。
表1 提取工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重值Table 1 Weight values of extraction process evaluation indexes
2.3.4 綜合評(píng)價(jià)方法 由式(2)計(jì)算得到各指標(biāo)的組合權(quán)重值(w),并進(jìn)一步得到各實(shí)驗(yàn)條件的指標(biāo)綜合評(píng)分(H),按公式(3)計(jì)算。再進(jìn)行直觀分析與方差分析。
2.4.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平 通過預(yù)實(shí)驗(yàn),本實(shí)驗(yàn)以加水倍數(shù)(X1)、浸泡時(shí)間(X2)、提取時(shí)間(X3)、提取次數(shù)(X4)為主要考察因素,根據(jù)Box-Behnken法設(shè)計(jì)原則,每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平,結(jié)果見表2。
2.4.2 Box-Behnken響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案,對(duì)應(yīng)稱取方中藥材,對(duì)YMTG的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,提取液按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,分別計(jì)算8種指標(biāo)成分及出膏率,結(jié)合“2.3.3”項(xiàng)下的組合權(quán)重,進(jìn)行綜合評(píng)分,結(jié)果見表2。
2.4.3 模型的建立與方差分析 應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合及顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見表3。因素X1、X2、X3、X4與H之間的2次多項(xiàng)回歸方程H=67.62+1.51X1+0.58X2-1.6X3+5.16X4+0.37X1X2+4.29X1X3-0.53X1X4-3.36X2X3+4.1X2X4-1.54X3X4+3.78X12-0.85X22-0.71X32+0.51X42,結(jié)果可以看出,模型P<0.01,說明2次多元回歸方程模型良好,模型具有顯著性意義。R2=0.836 3,Radj2=0.672 6,變異系數(shù)(CV)=4.54%,說明該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況擬合良好,相關(guān)度也良好,誤差較小。P失擬=0.123 7>0.05,表示失擬性不顯著,可以用該實(shí)驗(yàn)?zāi)P瓦M(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。自變量1次項(xiàng)X4極顯著(P<0.001),自變量2次項(xiàng)X12高度顯著(P<0.01),自變量2次項(xiàng)X1X3、X2X3、X2X4顯著(P<0.05),表明模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表2 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Scheme and results of Box-Behnken response surface design
表3 多元回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance on multiple regression model
2.4.4 響應(yīng)面分析與預(yù)測(cè) 用Design-Expert 8.0.6軟件得到2次回歸方程及響應(yīng)面圖評(píng)價(jià)選定提取因素之間的相互作用強(qiáng)弱,繪制出各因素之間相互作用的三維響應(yīng)曲面圖,通過觀察,以傾斜度觀察兩者相互的影響作用,傾斜度越高,證明兩者相互作用越明顯,且交互作用越顯著,顏色越深,結(jié)果見圖2。兩兩因素交互作用可通過等高線得出,等高線呈橢圓形則表明2個(gè)因素的交互作用顯著,若等高線呈圓形則表明2個(gè)因素的交互作用不顯著。
由圖2可知,加水倍數(shù)與浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、提取次數(shù),以及提取時(shí)間與浸泡時(shí)間兩兩因素交互呈橢圓形,故對(duì)提取工藝的影響顯著;提取次數(shù)和浸泡時(shí)間、提取時(shí)間交互作用不明顯,故對(duì)提取工藝影響不顯著。根據(jù)所建模型回歸方程選擇出YMTG的最佳提取工藝為加11.75倍水,浸泡時(shí)間為61.02 min,提取時(shí)間為76.69 min,提取2.96次。通過結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)選擇出YMTG的提取工藝為加12倍水,浸泡60 min,提取80 min,提取3次。
圖2 4因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface diagram of four factor interaction on comprehensive score
2.4.5 提取工藝驗(yàn)證 根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件分析所得最佳提取工藝,對(duì)YMTG進(jìn)行提取工藝的驗(yàn)證。分別稱取樣品3份,加12倍水,浸泡60 min,煎煮80 min,煎煮3次,測(cè)定各指標(biāo)含量與出膏率,結(jié)果見表4。測(cè)得綜合評(píng)分的平均值為80.249 1,與預(yù)測(cè)值(82.227 3)相差1.978 2%,RSD為1.13%,表明該提取工藝合理可行,可操作性強(qiáng),具有實(shí)用價(jià)值。
表4 最佳提取工藝驗(yàn)證Table 4 Verification of best extraction process
2.5.1 分組與給藥 SPF級(jí)SD實(shí)驗(yàn)大鼠60只,隨機(jī)分為對(duì)照組,模型組,YMTG低、中、高劑量組,苯溴馬隆組,每組10只。除對(duì)照組ig蒸餾水外,其余各組ig含1.25%腺嘌呤的10%干酵母液10 mL/kg,連續(xù)4周,造成痛風(fēng)性腎病模型。造模成功后,低、中、高劑量組分別給予YMTG水提液生藥4.2、8.4、16.8 g/kg,苯溴馬隆組ig給藥10 mg/kg苯溴馬隆,對(duì)照組和模型組給以等體積蒸餾水,1次/d,連續(xù)給藥3周。
2.5.2 取樣與各指標(biāo)檢測(cè)及HE染色 給藥結(jié)束時(shí)用代謝籠取大鼠24 h尿液,24 h后將大鼠麻醉,腹主動(dòng)脈采血,分離血清,根據(jù)各試劑盒說明書測(cè)定血尿酸、尿液尿酸、尿酸腎臟清除率、血清肌酐、尿素氮水平以及黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)活性;采血后打開腹腔,取腎臟,沿腎門做橫斷面取材,梯度乙醇脫水,二甲苯透明浸蠟、包埋,切片,HE染色,觀察腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。
2.5.3 對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠尿酸水平及尿酸清除率的影響 與對(duì)照組相比,模型組尿液尿酸水平降低,血液中尿酸水平增高,腎臟對(duì)尿酸的清除率明顯降低。與模型組比較,給藥3周后,各給藥組動(dòng)物尿量有所減少,尿液中尿酸水平增加,24 h尿液尿酸排出量增加,各給藥組血清尿酸水平明顯降低(P<0.05、0.01),尿酸清除率明顯增加(P<0.05、0.01),YMTG與陽(yáng)性組相比,各給藥組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明YMTG與陽(yáng)性藥藥效相當(dāng),結(jié)果見表5。
表5 YMTG對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠尿酸水平及尿酸清除率的影響 ( )Table 5 Effects of YMTG on uric acid level and uric acid clearance rate in gout nephropathy rats ( )
表5 YMTG對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠尿酸水平及尿酸清除率的影響 ( )Table 5 Effects of YMTG on uric acid level and uric acid clearance rate in gout nephropathy rats ( )
與對(duì)照組比較:#P<0.05 ##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05 **P<0.01;下表同#P < 0.05 ##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group; same as the following table
組別 劑量/(g·kg?1) n/只 24 h尿量/mL尿液尿酸/(mg·L?1)24 h尿酸排出量/mg血清尿酸/(mg·L?1)尿液尿酸清除率/(mL·h?1)對(duì)照 ? 10 28.2±7.8 165.1±66.3 4.3±0.6 32.7±2.7 5.4±0.7模型 ? 8 37.0±10.2 96.8±37.1# 3.4±1.1# 43.5±8.4## 3.3±1.1##YMTG 4.2 10 30.4±6.2 135.9±34.3* 4.2±1.3 34.4±6.1* 5.0±1.4*8.4 10 35.0±7.2 139.9±27.0* 4.8±0.6** 35.6±5.8* 5.8±1.6**16.8 9 27.0±4.8* 182.5±41.9** 4.8±1.0* 33.6±4.4** 6.0±1.3**苯溴馬隆 0.01 10 31.4±8.3 130.9±30.5* 4.0±1.1 34.4±3.9** 4.9±1.2*
2.5.4 對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠腎功能及XOD的影響模型組大鼠血清肌酐、尿素氮水平明顯升高,與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。模型組血清XOD水平較對(duì)照組有所升高,但并無(wú)顯著性差異。YMTG給藥后能降低血液中血清肌酐、尿素氮的水平,中、高劑量組與模型組比較有明顯差異(P<0.05、0.01),YMTG給藥組XOD活性有降低趨勢(shì),中劑量給藥組與模型組比較有明顯差異(P<0.05)。YMTG與陽(yáng)性組相比,各給藥組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明YMTG與陽(yáng)性藥藥效相當(dāng)。結(jié)果見表6。
表6 YMTG對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠腎功能及XOD的影響( )Table 6 Effects of YMTG on renal function and XOD of gout nephropathy rats ( )
表6 YMTG對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠腎功能及XOD的影響( )Table 6 Effects of YMTG on renal function and XOD of gout nephropathy rats ( )
組別 劑量/(g·kg?1) n/只 尿素氮/(mmol·L?1)血清肌酐/(μmol·L?1)XOD/(U·L?1)對(duì)照 ? 10 6.2±1.3 125.7±14.6 13.1±1.7模型 ? 8 10.5±2.8## 175.2±32.3## 14.6±2.0 YMTG 4.2 10 8.9±2.8 132.0±31.7* 13.8±1.9 8.4 10 6.8±1.5** 124.7±25.6** 13.1±0.6*16.8 9 7.0±1.1** 123.5±27.9** 13.1±1.4苯溴馬隆 0.01 10 8.2±1.4* 141.4±21.9* 13.6±1.7
2.5.5 對(duì)痛風(fēng)性腎病模型大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)影響模型組腎臟體積不同程度增大,部分腎臟顏色變淺呈大白腎。鏡下見造模組腎小管損傷,表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞萎縮變矮,管腔擴(kuò)張或小管上皮增生腫大擠滿小管腔,間質(zhì)纖維增生,炎細(xì)胞浸潤(rùn),以及少量嘌呤結(jié)晶體在小管內(nèi)的沉積等。與模型組比較,各給藥組腎小管損傷面積及損傷程度均有所減輕。治療組給藥后,間質(zhì)纖維及小管上皮增生不明顯,腎小管損傷程度較模型組明顯減輕,結(jié)果見圖3。
圖3 YMTG對(duì)痛風(fēng)性腎病模型大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響 (×200)Fig.3 Effects of YMTG on renal histomorphology of gout nephropathy model rats (× 200)
YMTG是在經(jīng)方萆薢丸的基礎(chǔ)上加減化裁而來(lái)。方中虎杖具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛之功效,可用于風(fēng)濕痹痛、跌打損傷,其中虎杖苷為虎杖主要藥效成分,具有使滑膜細(xì)胞凋亡,減少炎癥分子,控制關(guān)節(jié)炎癥[16-17],降低尿酸吸收蛋白分泌[18]的作用;土茯苓以解毒、除濕、通利關(guān)節(jié)見長(zhǎng),善治筋骨攣痛,為臨床防治痛風(fēng)的常用中藥,黃酮類化合物落新婦苷、異落新婦苷為土茯苓的藥效成分,具有的抗炎、抗氧化、抗痛風(fēng)等功效[19-21]。酚酸類成分具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化等藥理作用[22]。YMTG藥味眾多,成分復(fù)雜,本研究在選擇評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí),綜合考慮到與痛風(fēng)藥效相關(guān)及可測(cè)性,故以方中虎杖苷、落新婦苷等8種成分作為YMTG提取工藝中的化學(xué)成分指標(biāo),以此篩選出最佳提取工藝。
多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià),權(quán)重的確定最為重要,主要有主觀賦值和客觀賦值。G1法是對(duì)層次分析法進(jìn)行改進(jìn)的一種主觀賦權(quán)法,計(jì)算速度快、無(wú)需一致性檢驗(yàn)、同一層次中元素個(gè)數(shù)的伸展性強(qiáng)、具有保序性。熵權(quán)法是一種根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)觀測(cè)值所提供信息量的大小來(lái)確定指標(biāo)權(quán)重的方法,決策準(zhǔn)確性和可靠性較強(qiáng)[9]。本實(shí)驗(yàn)采用基于G1-熵權(quán)法的組合賦權(quán)方法,可同時(shí)兼顧決策者的主觀性和待評(píng)價(jià)對(duì)象各指標(biāo)的內(nèi)在聯(lián)系,使彝藥痛風(fēng)顆粒提取工藝的多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)結(jié)果更加科學(xué)合理。
痛風(fēng)性腎病是由于嘌呤代謝障礙導(dǎo)致的機(jī)體血清尿酸增加,并長(zhǎng)期蓄積于腎小管和腎間質(zhì)中誘發(fā)的一系列腎臟疾病[23]。臨床上的藥效評(píng)價(jià)多以腺嘌呤致痛風(fēng)性腎病模型,因?yàn)楫?dāng)機(jī)體攝入大量腺嘌呤時(shí),高濃度腺嘌呤在黃嘌呤氧化酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?,8-二羥基腺嘌呤,其易沉積于腎小管,阻塞腎小管而引起腎功能衰竭[24]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)YMTG對(duì)痛風(fēng)性腎病研究結(jié)果表明,YMTG可降低腺嘌呤致痛風(fēng)性腎病模型大鼠血液和尿液尿酸濃度,增加尿液尿酸清除率,降低血液中血清肌酐、尿素氮水平;病理結(jié)果表明,YMTG可減輕腎臟損傷,減輕腎小管損傷面積和質(zhì)纖維增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn),說明YMTG對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠具有較好改善作用。
現(xiàn)代研究表明,虎杖苷具有腎功能保護(hù)作用,可通過腺苷酸活化蛋白激酶或沉默信息調(diào)節(jié)子1信號(hào)途徑,抑制NF-kB/NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3炎性小體活化減輕腎臟炎癥[25];還可降低高尿酸血癥大鼠的血尿酸、肌酐和血尿素氮水平,以維持代謝平衡[26-27]。落新婦苷可通過降低氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)降低順鉑誘導(dǎo)的急性腎毒性[28],還可通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidyl inositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)途徑抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞自噬和凋亡[29]。因此,YMTG治療痛風(fēng)性腎病可能與這些成分有關(guān),還有待于進(jìn)一步研究。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突