◎ 林 巧，江文世，李瑤佳，何劭英

（1.西昌學(xué)院，四川 西昌 615000；2.攀西特色作物研究與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 西昌 615000）

小桐子（Jatropha curcasL.），別名麻瘋樹(shù)，是大戟科麻瘋樹(shù)屬落葉叢生小樹(shù)木。人們最開(kāi)始是在美洲熱帶地區(qū)發(fā)現(xiàn)小桐子這種植物，目前小桐子在中國(guó)西南部有大量人工栽培種植或半野生種[1]。此植物種仁含油量最高值為61.5%，是一種十分理想的熱帶地區(qū)生物柴油原料植物，小桐子目前已被大面積種植于云南、四川、貴州等地。小桐子不僅是世界上古老的藥用植物，還是有毒植物，但其全株均可入藥[2-3]。目前，學(xué)術(shù)界對(duì)小桐子的研究集中在從小桐子枝葉中提取、分離、鑒定得到具有抑菌活性的毒蛋白curcin和β-1,3-葡聚糖酶（β1,3-glucanase），并對(duì)其活性及作用機(jī)理等方面進(jìn)行了研究，但對(duì)小桐子中生物堿以及小桐子果殼中的抗菌活性的研究少有報(bào)道[4]。本文通過(guò)對(duì)小桐子果殼中物質(zhì)進(jìn)行分離并研究了小桐子枝葉中生物堿的最佳提取工藝，以期為使用小桐子果殼研制抗菌藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

項(xiàng)目組分別于2019年和2020年多次前往會(huì)理縣采集小桐子葉片樣品，經(jīng)鑒定為麻瘋樹(shù)的干燥帶枝葉，共采集樣品約20 kg。樣品經(jīng)過(guò)清洗、晾曬、烘干和粉碎過(guò)60目篩，得到干燥粉末樣品約5 kg。

1.2 儀器與設(shè)備

試驗(yàn)中用到的儀器與設(shè)備相關(guān)信息如表1所示。

表1 儀器與設(shè)備信息表

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 待分離樣品的制備

按一定料液比加入小桐子葉樣品粉末和一定體積分?jǐn)?shù)的提取溶劑，用1%的鹽酸溶液定容，調(diào)節(jié)pH值。在一定溫度下超聲提取一定時(shí)間過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，二氯乙烷萃取分離，分離得到的水相中加入pH=10的10%的碳酸鈉溶液堿化，二氯乙烷萃取分離，將得到的有機(jī)相置于烘箱烘干得到生物堿的粗提物。

1.3.2 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

研究不同提取溶劑、超聲溫度、超聲時(shí)間、溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比和鹽酸pH值對(duì)小桐子生物堿提取率的影響。

（1）控制pH=2，超聲溫度40 ℃，超聲時(shí)間30 min，料液比1∶30（g·mL-1），分別采用甲醇、乙醇（體積分?jǐn)?shù)80%）和丙酮、1%HCl-水和10%碳酸鈉-水提取小桐子中的生物堿。

（2）控制pH=2，設(shè)置超聲時(shí)間為30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶30（g·mL-1），在超聲溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃的溫度條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

（3）控制pH=2，超聲溫度40 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶30（g·mL-1），在超聲時(shí)間為10 min、20 min、30 min、40 min和50 min的條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

（4）控制pH=2，超聲時(shí)間、超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為30 min，40 ℃，80%，在料液比（g·mL-1）分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60時(shí)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

（5）控制pH=2，超聲時(shí)間50 min，超聲溫度40 ℃，料液比1∶30（g·mL-1），在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%和90%的條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

（6）控制超聲時(shí)間30 min，超聲溫度40℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶30（g·mL-1），在鹽酸pH值為1、2、3、4和5的條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以生物堿總含量Y為響應(yīng)值，以提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)A、超聲時(shí)間B、超聲溫度C這3個(gè)不同的因素為自變量，并且將每個(gè)自變量都設(shè)置成低、中、高3個(gè)水平[5]，利用Design-Expert8.0.6軟件，采用Box-Behnken對(duì)小桐子枝葉生物堿超聲提取工藝進(jìn)行3因素3水平的研究[6]，因素水平見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將鹽酸川芎嗪對(duì)照品稱取0.018 0 g放入規(guī)格為25 mL的容量瓶中。接著向容量瓶中添加氯仿溶解鹽酸川芎嗪對(duì)照品，并迅速稀釋至刻度線。如上操作后可得濃度為0.720 mg·mL-1的鹽酸川芎嗪對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確量取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和2.5 mL上述方法配制的鹽酸川芎嗪對(duì)照品溶液，先分別裝于規(guī)格為60 mL的分液漏斗中，然后再向其中加入7 mL溴甲酚綠緩沖液，并向其中加入氯仿至溶液體積達(dá)到10 mL。按以上方法完成顯色，分取氯仿層，參比為空白溶液，于420 nm處測(cè)定吸光度。橫坐標(biāo)為鹽酸川芎嗪對(duì)照品質(zhì)量濃度（mg·mL-1），縱坐標(biāo)為吸光度，由此可以進(jìn)行線性擬合，從而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。

1.3.5 提取物中生物堿含量測(cè)定

取小桐子生物堿的粗提物2 mL，放置于規(guī)格為60 mL分液漏斗中，接著向漏斗中加入溴甲酚綠緩沖液7 mL，并向其中加入氯仿至溶液體積達(dá)到10 mL，按以上方法完成顯色，分取氯仿層，參比為空白溶液，于420 nm處測(cè)定吸光度。按照以下的公式計(jì)算生物堿提取率。

式中：m1為小桐子生物堿質(zhì)量，g；m2為小桐子粉末質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對(duì)小桐子枝葉中生物堿提取率的影響

由表3可知，在以下5種不同的提取溶劑中，采用乙醇作為提取溶劑時(shí)，小桐子生物堿提取率最高。這可能是因?yàn)樾⊥┳由飰A是屬于親脂性的仲胺或叔胺生物堿，易溶于極性較小的有機(jī)溶劑中。

表3 不同溶劑對(duì)小桐子生物堿提取率的影響表

2.2 不同超聲溫度對(duì)生物堿提取率的影響

由圖1可知，隨著超聲溫度的增加，小桐子生物堿提取率先增加后降低。當(dāng)超聲溫度為40 ℃時(shí)，生物堿提取率最高；當(dāng)超聲提取溫度＞40 ℃時(shí)，小桐子生物堿提取率不斷下降。這是因?yàn)闇囟冗^(guò)高，提取溶劑乙醇揮發(fā)，生物堿在溶劑中的溶解率下降，生物堿提取率降低。因此，選擇超聲提取溫度為30 ℃、40 ℃和50 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 超聲溫度對(duì)生物堿提取率的影響圖

2.3 不同超聲時(shí)間對(duì)小桐子枝葉中生物堿提取率的影響

由圖2可知，在一定的范圍中，小桐子枝葉中生物堿提取率隨著不同超聲時(shí)間的增加而呈現(xiàn)增加狀況，當(dāng)超聲所用時(shí)間超過(guò)20 min后，隨著超聲時(shí)間的增加，生物堿的提取率卻逐漸下降，這可能是由于超聲時(shí)間的增加破壞了生物堿的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，同時(shí)使提取溶劑揮發(fā)了一部分，導(dǎo)致生物堿提取率下降。因此，選擇超聲提取時(shí)間為10 min、20 min和30 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)生物堿提取率的影響圖

2.4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)小桐子枝葉中生物堿提取率的影響

由圖3可知，在一定范圍中，小桐子枝葉中生物堿提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)逐漸增加的狀態(tài)。當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)，生物堿的提取率達(dá)到最高值，繼續(xù)增加乙醇的體積分?jǐn)?shù)，生物堿繼而提取率下降。因此，本試驗(yàn)選擇乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70%、80%和90%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)生物堿提取率的影響圖

2.5 不同料液比對(duì)小桐子生物堿提取率的影響

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，小桐子生物堿提取率會(huì)隨著料液比的增加而呈現(xiàn)逐漸增大的狀態(tài)，料液比超過(guò)1∶30（g·mL-1）后，生物堿提取率逐漸下降。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，增加料液比有助于增大提取溶劑與浸提物的接觸面積，提取率增加。但是料液比過(guò)大，不利于小桐子生物堿的溶出，生物堿提取率降低。

圖4 料液比對(duì)生物堿提取率的影響圖

2.6 不同鹽酸pH值對(duì)小桐子生物堿提取率的影響

由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，隨著pH值增加，生物堿的提取率不斷降低。這是因?yàn)樯飰A與酸反應(yīng)形成可溶于水的物質(zhì)被萃取出來(lái)。因此，選擇最佳鹽酸pH值為1。

圖5 pH值對(duì)生物堿提取率的影響圖

2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4。利用Design-Expert 8.0.6響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對(duì)表4中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析擬合后得到的二次多項(xiàng)回歸方程為Y=0.61-8.25×10-3A+4.75×10-3B+3×10-3C-5×10-4AB+2×10-3AC+1×10-2BC-0.045A2-0.021B2-0.025C2（R2=0.878 9），該數(shù)據(jù)說(shuō)明該模型的擬合度比較適宜，試驗(yàn)所得誤差值比較小。

表4 Box－Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果表

2.7.1 方差分析與顯著性檢驗(yàn)

對(duì)方程進(jìn)一步進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，模型P=0.016 3＜0.05，說(shuō)明本次試驗(yàn)回歸模型中的自變量與因變量這兩個(gè)變量的回歸關(guān)系顯著，失擬項(xiàng)P=0.46＞0.05，說(shuō)明由本試驗(yàn)數(shù)據(jù)所得的二次多項(xiàng)回歸方程的擬合程度較好。綜上，本試驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A、B、C3個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)中小桐子枝葉生物堿提取率的影響大小的順序?yàn)锳＞B＞C，并且得出二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值的影響比其他項(xiàng)更為顯著，綜上所述各因素與響應(yīng)值之間并不是單一的線性關(guān)系。交互項(xiàng)對(duì)生物堿總含量影響的強(qiáng)弱可表示為BC＞AC＞AB，由此說(shuō)明超聲所用時(shí)間與所設(shè)溫度比對(duì)響應(yīng)值的影響明顯。

表5 方差分析結(jié)果表

2.7.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)響應(yīng)面圖中評(píng)價(jià)此試驗(yàn)各個(gè)不同的因素之間的交互性強(qiáng)度，優(yōu)選出最佳提取工藝。由圖6可知，因素A（提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)）的曲面比其他兩圖較為陡峭，說(shuō)明提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)的不同對(duì)生物堿成分提取效率的影響比其他兩個(gè)因素大一些。BC交互作用強(qiáng)，說(shuō)明超聲所用時(shí)間與設(shè)置的溫度的交互作用對(duì)生物堿總含量的影響比較明顯，AB和AC交互作用是比較弱的，綜上，溶劑的體積分?jǐn)?shù)與超聲所用的時(shí)間、設(shè)置的溫度與超聲所用的時(shí)間的交互作用對(duì)生物堿提取量的影響小一些。

圖6 各因素與生物堿總提取量的響應(yīng)面圖

2.8 最優(yōu)工藝與驗(yàn)證

通過(guò)本次試驗(yàn)得出最佳的提取方案為超聲所用時(shí)間20.15 min，提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)為79.15%，超聲溫度為40 ℃。基于對(duì)試驗(yàn)本身實(shí)際操作情況的理解和后續(xù)試驗(yàn)的簡(jiǎn)便性的考慮，本試驗(yàn)最終確定的最優(yōu)提取工藝為取樣0.5 g的小桐子枝葉藥材樣品磨成粉末，加入79.15%乙醇，超聲提取20.15 min，設(shè)置溫度為40 ℃。分別選取3批小桐子葉藥材飲片，在綜上所述的最優(yōu)工藝條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)。試驗(yàn)所得生物堿成分總含量分別為0.606 0%、0.595 8%、0.601 4%，平均值為0.601 1%（RSD=0.85%），與模型中預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.59%，表明試驗(yàn)所建立的模擬回歸方程擬合度高，經(jīng)試驗(yàn)所得出的優(yōu)化方案是穩(wěn)定的、可靠的。

3 結(jié)論

有學(xué)者研究表明生物堿是以鹽的形態(tài)存在于植物中的含氮有機(jī)化合物，其治病功效強(qiáng)，如毛莨科黃連根莖中的小蘗堿具有消炎作用，罌粟果皮中所含的嗎啡堿可鎮(zhèn)痛，三尖杉?jí)A和長(zhǎng)春花堿是治癌的良藥。生物堿具有良好的應(yīng)用前景，如何更加高效地從相關(guān)植物種提取出生物堿是當(dāng)前生物用藥方面必要的研究?jī)?nèi)容。

本試驗(yàn)采用超聲法將小桐子枝葉藥材中生物堿提取出來(lái)，相比于傳統(tǒng)的酸（堿）性水溶液提取法、樹(shù)脂吸附法、浸漬法用時(shí)更短，能耗更小，提取率增加且有效成分保留完整。在后續(xù)操作中，本試驗(yàn)利用單因素試驗(yàn)法結(jié)合Box－Behnken響應(yīng)面法[8]，對(duì)各個(gè)單因素試驗(yàn)水平連續(xù)分析，從不同單因素中篩選出最適合小桐子枝葉生物堿提取條件，避免了因提取方案不佳造成的生物堿提取損失問(wèn)題發(fā)生。本試驗(yàn)得到的小桐子枝葉中生物堿的最優(yōu)提取工藝，操作簡(jiǎn)便、效率高、穩(wěn)定可靠。