趙 君，饒惠玲，王耘籽，黃 偉，吳承禎，李 鍵*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建省高校森林生態(tài)系統(tǒng)過(guò)程與經(jīng)營(yíng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350002；2.武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院,福建 南平 354300)

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育、結(jié)構(gòu)組成和生理生化過(guò)程的關(guān)鍵元素之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常通過(guò)大量施用磷肥來(lái)滿足作物對(duì)磷元素的需求，但磷肥極易與金屬離子形成不溶性磷酸鹽進(jìn)而對(duì)磷素起到固定作用[1]，這極大限制了肥料的利用效率[2-3].因此，如何活化土壤中難溶態(tài)磷并提高其轉(zhuǎn)化利用效率成為當(dāng)前土壤化學(xué)的研究熱點(diǎn)之一[4].

我國(guó)南方林區(qū)土壤的有效磷含量極低[5]，95%～99%的磷以難溶態(tài)存在[6]，嚴(yán)重制約著南方重要用材樹(shù)種杉木(Cunninghamialanceolata)人工林的可持續(xù)經(jīng)營(yíng)[7-9].針對(duì)杉木人工林經(jīng)營(yíng)中面臨的低磷脅迫，諸多學(xué)者從施肥[10]、樹(shù)種共生[11]、硅肥配施[12]等方面做了大量有益嘗試，雖取得了一些成效，但依舊無(wú)法有效、低成本地改善杉木人工林下土壤速效磷短缺的情況.針對(duì)南方林區(qū)杉木林地的磷素受限問(wèn)題，如何有效提升杉木對(duì)磷的利用效率，對(duì)杉木人工林的可持續(xù)經(jīng)營(yíng)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.

活躍在植物-土壤接觸面上的微生物群落對(duì)于維持植物生長(zhǎng)發(fā)育和植物健康起著重要作用[13].現(xiàn)有研究認(rèn)為根際微生物是農(nóng)作物根際的核心，在改善土壤理化性質(zhì)方面發(fā)揮了極大的作用[14-16].利用根際微生物改善林木對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收狀況已有諸多嘗試，前期研究從紅樹(shù)林(mangrove)[17]、巨尾桉(Eucalyptusgrandis)[18]、馬尾松(Pinusmassoniana)[19]、楓香(Liquidambarformosana)[20]、降香黃檀(Dalbergiaodorifera)[21]等植物根際篩選出了一批具有顯著解磷效果的根際微生物[22-23]，這為提升杉木在困難立地條件下的養(yǎng)分吸收效率提供了新思路.吳則焰等[24]提出杉木連栽導(dǎo)致土壤養(yǎng)分逐代降低，進(jìn)而表現(xiàn)為不同林齡杉木的根際微生物群落存在較大差異.杉木根際磷素含量隨著林齡的增加而降低[25]，中幼齡杉木人工林下的土壤微生物數(shù)量顯著高于其他林齡[26]，且中幼林對(duì)養(yǎng)分需求量大.因此，本研究以不同林齡杉木人工林為研究對(duì)象，以杉木根際土壤為供試土壤，通過(guò)平板定性與搖瓶定量篩選出高效解磷菌，鑒定高效解磷菌株類型.在此基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)與正交試驗(yàn)優(yōu)化高效解磷菌生長(zhǎng)條件，以期獲得具有較高解磷能力和生長(zhǎng)量的菌株，為利用根際微生物提升杉木人工林對(duì)根際無(wú)效磷的吸收利用效率奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，亦可探索利用解磷菌改善杉木人工林地力衰退問(wèn)題的可行性.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試土壤樣品采集于福建省南平市建陽(yáng)區(qū)溪東國(guó)有林場(chǎng)(118°08′～120°31′ E，26°40′～27°20′ N)，地處武夷山脈南側(cè)，屬于典型的中亞熱帶季風(fēng)氣候，冬溫夏熱，四季分明，季風(fēng)發(fā)達(dá)，年均降水量1 700 mm，年蒸發(fā)量1 500 mm，年均溫大于18 ℃，十分有利于杉木的生長(zhǎng)發(fā)育.林場(chǎng)前身為低產(chǎn)低效馬尾松人工林，2008—2010年逐年砍伐后營(yíng)造杉桐混交林[27]，林下植被種類主要有苦竹(Pleioblastusamarus)、芒萁(Dicranopterisdichotoma)、觀音座蓮(Strobilanthescyclus)、黃瑞木(Adinandramillettii)等.

1.1.1 土壤樣品采集及理化性質(zhì)測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)選取中幼林齡(2，4，10，15 a)杉木人工林，各取3塊具有代表性的20 m×20 m樣地，每塊樣地采用五點(diǎn)取樣法，鏟去表土后深挖10～20 cm，選取具有完整根系的土體，采用抖落法采集根際土壤，同一樣地各取樣點(diǎn)土壤均勻混合并標(biāo)號(hào)處理，同時(shí)采集非根際土壤進(jìn)行標(biāo)號(hào)處理，將土樣裝入冰盒帶回至冰箱(4 ℃)保存.其中新鮮根際土樣用于菌株篩選，非根際土樣待風(fēng)干過(guò)篩后進(jìn)行理化性質(zhì)測(cè)定(表1)，土壤類型均為紅壤，其他理化性質(zhì)采取常規(guī)測(cè)定方式：全磷測(cè)定采用鉬銻抗比色法，有效磷測(cè)定采用鹽酸-硫酸浸提法，有機(jī)質(zhì)測(cè)定采用重鉻酸鉀-外加熱法，全氮測(cè)定采用半微量凱氏法，水解氮測(cè)定采用堿解-擴(kuò)散法，全鉀測(cè)定采用堿熔-火焰光度法，速效鉀測(cè)定采用乙酸銨浸提-火焰光度法，pH測(cè)定采用電位法[28].

表1 杉木人工林土壤的基本理化性質(zhì)

1.1.2 培養(yǎng)基

李豆豆等[29]指出以磷酸三鈣為磷源時(shí)，菌株解磷量顯著高于其他磷源類型，因此采用磷酸三鈣無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基(葡萄糖10.0 g，硫酸銨0.5 g，硫酸鎂0.3 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，磷酸三鈣5.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.5)來(lái)分離解無(wú)機(jī)磷菌株.采用蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基(葡萄糖10.0 g，硫酸銨0.5 g，硫酸鎂0.3 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，卵磷脂0.2 g，碳酸鈣5.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.5)來(lái)分離解有機(jī)磷菌株[30].發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基選用LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，氯化鈉0.5 g，pH 7.0～7.2)[31].

1.2 解磷菌的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.1 解磷菌分離與純化

取搖床震蕩后的土壤溶液上清液成倍數(shù)(10-3，10-4，10-5)稀釋，涂于磷酸三鈣無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基和蒙金娜有機(jī)磷平板培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度設(shè)置3組重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中(解有機(jī)磷菌培養(yǎng)3 d,解無(wú)機(jī)磷菌培養(yǎng)7 d)[32-33]，記錄含溶磷圈菌落數(shù).菌落的純化采用劃線法并培養(yǎng)3～7 d，純化后將單菌落轉(zhuǎn)移至牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，保存于4 ℃冰箱備用[34].

1.2.2 解磷菌篩選

解磷菌篩選采用平板初篩與搖瓶復(fù)篩.平板初篩需記錄各菌株的溶磷圈直徑、菌落直徑及二者比值，各菌株設(shè)5組重復(fù),取平均值.搖瓶復(fù)篩需將初篩得到的菌株接種到液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)7 d(28 ℃，160 r/min)，對(duì)培養(yǎng)好的菌株進(jìn)行離心處理(4 ℃，10 000 r/min，10 min)，利用鉬銻抗比色法檢測(cè)上清液中的溶磷量，判斷各菌株的溶磷能力.

1.2.316SrDNA測(cè)序鑒定

利用16SrDNA通用引物序列F27和R1492對(duì)篩選得到的細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增，純化后送往上海邁浦生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交至RDP(http:∥rdp.cme.msu.edu/)及NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)分析，選取與GenBank中同源性最高的序列，初步鑒定菌株.

1.2.4 培養(yǎng)優(yōu)化

培養(yǎng)基組分優(yōu)化：采用不同碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘露醇)代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，根據(jù)菌液在600 nm下的吸光度(A600)確定最佳碳源.改變最佳碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.5%，1.0%，1.5%)進(jìn)行菌株培養(yǎng)以確定最佳濃度.最佳氮源(硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀、蛋白胨、酵母粉、尿素)及其最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.5%，0.8%，1.0%，1.3%，1.5%)的確定采取相同方式.

培養(yǎng)條件優(yōu)化：在其他條件不變的情況，分別改變菌株發(fā)酵液的pH(5.0，6.0，6.5，7.0，7.2，7.5，8.0，9.0)、裝液量(10，20，30，40，60 mL，于100 mL發(fā)酵瓶)、接種量(1%，3%，5%，7%，9%，均為體積分?jǐn)?shù))、培養(yǎng)溫度(20，25，28，30，35，40 ℃)，測(cè)量對(duì)應(yīng)的A600，確定對(duì)應(yīng)的最適值.

正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，基于初始pH值(A)、裝液量(B)、接種量(C)、培養(yǎng)溫度(D)以及不同水平的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù).

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Exce1 2010軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的整理、分析及圖像繪制，運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(顯著水平0.05)和最小顯著差數(shù)(LSD)法多重比較，采用Pearson相關(guān)系數(shù)法確定pH與溶磷量之間的相關(guān)關(guān)系，運(yùn)用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ v3.1處理正交試驗(yàn)數(shù)據(jù).

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌的篩選結(jié)果

對(duì)分離出的菌落進(jìn)行形態(tài)特征判斷，經(jīng)福建省林業(yè)科學(xué)研究院形態(tài)學(xué)鑒定分析其培養(yǎng)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)4種不同林齡的杉木根際土壤解磷菌形態(tài)各異.所篩選出的解磷菌以不透明的白色、乳白色、淺黃色為主，菌落呈圓形、不規(guī)則形，邊緣基本整齊，中間以凸起為主，菌株表面大多光滑.不同菌株的生長(zhǎng)速度不一致，絕大多數(shù)菌株的生長(zhǎng)速度較快，可在24 h內(nèi)生長(zhǎng)為菌落成型；但亦存在解磷真菌在48 h后才長(zhǎng)勢(shì)較好，生長(zhǎng)速度較緩慢.

不同林齡杉木根際解磷菌數(shù)量及種類亦存在差異(表2).從數(shù)量來(lái)看，杉木人工林下根際解無(wú)機(jī)磷菌的數(shù)量范圍為2.12×105～3.64×105cfu/g(cfu為菌落形成單位)，解有機(jī)磷菌的數(shù)量范圍為1.31×105～2.14×105cfu/g.其中，15 a杉木根際土壤的解無(wú)機(jī)磷菌數(shù)量和解有機(jī)磷菌數(shù)量均顯著高于其他林齡(p<0.05)，且類型數(shù)最多，而解有機(jī)磷菌類型數(shù)為9，與4 a 杉木的類型數(shù)相同.

表2 不同林齡杉木土壤解磷菌的數(shù)量特征

從以上解磷菌中挑選解磷效果具有顯著優(yōu)勢(shì)的菌株進(jìn)行溶磷實(shí)驗(yàn)，對(duì)高效解磷菌進(jìn)行16SrDNA測(cè)序鑒定.通過(guò)對(duì)杉木根際解磷菌進(jìn)行平板初篩，無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基和有機(jī)磷培養(yǎng)基中均出現(xiàn)較明顯的透明圈，表明根際解磷微生物能夠溶解無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷并轉(zhuǎn)化至可被植物或自身吸收利用的有效磷素.本研究共篩選得到具有較明顯作用的25株解無(wú)機(jī)磷菌株和20株解有機(jī)磷菌株.對(duì)以上菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩后發(fā)現(xiàn)，在固體培養(yǎng)基中溶磷圈直徑與菌落直徑比值大的菌株，在液體培養(yǎng)基中的解磷能力并不一定顯著突出，這與黃鵬飛等[35]關(guān)于解磷菌在固體平板和液體培養(yǎng)兩種方式下的解磷效果并不存在線性關(guān)系的研究結(jié)果一致.

圖中數(shù)據(jù)字母不同表示差異顯著(p<0.05)，下同.

解磷菌常通過(guò)分泌有機(jī)酸來(lái)溶解難溶性磷，發(fā)酵液的pH降低，從側(cè)面可反映出菌株溶磷能力的高低[36-37].本研究在探究解無(wú)機(jī)磷菌株的溶磷能力時(shí)，對(duì)菌株培養(yǎng)液的pH進(jìn)行測(cè)定，所測(cè)值均低于對(duì)照組，這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論.發(fā)酵液的無(wú)機(jī)磷溶解量與pH呈極顯著負(fù)相關(guān)性(p<0.01，R2=0.749 7，r=-0.865 9)，解磷能力強(qiáng)的菌株培養(yǎng)液pH較低，反之pH較高，只有個(gè)別菌株呈現(xiàn)差異(圖1).有機(jī)磷溶解量與pH的相關(guān)關(guān)系并不顯著(p>0.05)，解有機(jī)磷菌株的溶液pH主要集中于6.58～7.42之間，僅菌株Y3溶液的pH為1.89，呈現(xiàn)出強(qiáng)酸性，與其他菌株差異較大，究其原因，可能是由于大部分解磷菌以酶解為主[38]，而Y3以分泌有機(jī)酸來(lái)發(fā)揮溶磷作用[39-40].

圖1 無(wú)機(jī)磷溶解量與培養(yǎng)液pH的關(guān)系

通過(guò)復(fù)篩，采用單因素方差分析各菌株的無(wú)機(jī)磷溶解量.無(wú)機(jī)磷溶解量較空白對(duì)照組(CK)均有增加(圖2)，增量范圍為4.01～235.88 μg/mL，溶磷量范圍為6.31～238.08 μg/mL.W1的解磷效果顯著高于其他菌株(p<0.05)，溶磷量達(dá)238.08 μg/mL；溶解無(wú)機(jī)磷效果最差的是W15，溶磷量?jī)H為6.31 μg/mL.W1溶磷量是W15溶磷量的37.73倍.

有機(jī)磷溶解量較空白對(duì)照組均有增加(圖3)，增量范圍為1.07～11.33 μg/mL，溶磷量范圍為4.78～15.04 μg/mL.Y9的解磷效果顯著高于其他菌株(p<0.05)，溶磷量達(dá)15.04 μg/mL；解磷效果最差的是Y10，溶磷量?jī)H為4.78 μg/mL.Y9溶磷量為Y10溶磷量的3.15倍.

圖3 解有機(jī)磷菌株的溶磷量

2.2 菌株鑒定結(jié)果

經(jīng)PCR擴(kuò)增后的16SrDNA基因序列(附錄(http:∥jxmu.xmu.edu.cn/upload/html/20220115.html)圖S1和S2)通過(guò)核酸BLAST序列比對(duì)后，得到相似菌株的登錄號(hào)與相似度.經(jīng)鑒定，W1為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.，登錄號(hào)MZ145066.1)(圖4)，Y9為克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.，登錄號(hào)MZ145064.1)(圖5).

圖4 菌株W1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖5 菌株Y9的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 解磷菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用解無(wú)機(jī)磷效果最好的W1與解有機(jī)磷效果最好的Y9進(jìn)行培養(yǎng)基組分優(yōu)化和培養(yǎng)條件優(yōu)化.

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)篩選

菌株生長(zhǎng)量對(duì)于不同碳源、氮源、初始pH、裝液量、接種量、溫度的響應(yīng)有顯著差異(圖6).

GL.葡萄糖；SU.蔗糖；MA.麥芽糖；LA.乳糖；MAN.甘露醇；SS.可溶性淀粉；AS.硫酸銨；AC.氯化銨；PN.硝酸鉀；PE.蛋白胨；YE.酵母粉；UR.尿素.

碳源是微生物進(jìn)行新陳代謝等活動(dòng)的主要能量來(lái)源[41].6種不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇和可溶性淀粉)對(duì)W1和Y9的生長(zhǎng)量的影響差異顯著，W1和Y9以葡萄糖為碳源時(shí)的A600值均顯著高于其他碳源時(shí)，菌株生長(zhǎng)效果最好(圖6(a))，其次為甘露醇、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖.故改變最適碳源葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(圖6(b))，W1在1.0%時(shí)生長(zhǎng)量顯著大于其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，而Y9在0.5%時(shí)生長(zhǎng)量最大.

氮源也是微生物生長(zhǎng)發(fā)育的重要元素之一.當(dāng)以酵母粉為唯一氮源時(shí)，W1和Y9的生長(zhǎng)量顯著大于其他氮源時(shí)(圖6(c))，其次為蛋白胨，且酵母粉和蛋白胨對(duì)菌株生長(zhǎng)量的影響顯著大于其他4種氮源.故設(shè)置含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)酵母粉的培養(yǎng)基，結(jié)果表明W1在1.50% 時(shí)生長(zhǎng)量顯著大于其他處理，而Y9在1.25%時(shí)生長(zhǎng)量最大(圖6(d))，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高時(shí)菌株的A600值變化差異并不明顯，表明該菌株對(duì)高濃度酵母粉氮源變化并不敏感.

pH 8.0處理下W1生長(zhǎng)量最大，但pH 7.0和 7.5 處理下差異性并不顯著，故后續(xù)正交試驗(yàn)采取上述3種初始pH處理;而Y9生長(zhǎng)量主要在pH 5.0～6.0之間呈上升趨勢(shì)，后續(xù)A600值隨著pH增加而降低(圖6(e)).不同裝液量下，菌株生長(zhǎng)量顯著不同，W1與Y9的最適裝液量均為30 mL(圖6(f)).不同接種量下，3%，5%，7%接種量的W1菌液A600值差異不顯著，而Y9在9%接種量時(shí)生長(zhǎng)量顯著大于其他處理.溫度過(guò)高或過(guò)低也不利于菌株的生長(zhǎng)，35 ℃處理下W1生長(zhǎng)量顯著大于其他處理，而Y9生長(zhǎng)量在28，30和35 ℃處理下的差異不顯著，因此設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)一步確定最適溫度.

2.3.2 正交試驗(yàn)

設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，選擇4個(gè)因素(初始pH值、裝液量、接種量和溫度)及每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平.W1的因素A為初始pH值(7.0，7.5和8.0)，因素B為裝液量(20，30和40 mL)，因素C為接種量(3%，5%和7%)、因素D為溫度(30，35和40 ℃).其中，因素A對(duì)W1生長(zhǎng)量影響最大，因素C和D次之，W1的最佳培養(yǎng)條件為A2B2C1D3，即初始pH 7.5、裝液量30 mL、接種量3%、溫度40 ℃(表3).

表3 菌株W1培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

Y9的因素A為初始pH值(5.0，6.0和6.5)，因素B為裝液量(20，30和40 mL)，因素C為接種量(5%，7%和9%)、因素D為溫度(28，30和35 ℃).由于RD>RB>RC>RA，4個(gè)因素對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響程度為溫度>裝液量>接種量>初始pH，則Y9的最佳培養(yǎng)條件為A2B1C3D1，即初始pH為 6.0、裝液量20 mL、接種量9%、溫度28 ℃(表4).

表4 菌株Y9培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，表明各因素之間存在交互作用，而正交試驗(yàn)結(jié)果更具備準(zhǔn)確性.

3 討論與結(jié)論

逆境情況下，植物受環(huán)境影響會(huì)激發(fā)自身的應(yīng)激性.鄒顯花等[42]提出杉木根系通過(guò)大量增生來(lái)應(yīng)對(duì)低磷脅迫,加快向地生長(zhǎng)以應(yīng)對(duì)高磷環(huán)境.當(dāng)土壤有效磷含量豐富時(shí)，林木通過(guò)自身調(diào)節(jié)便可獲取足夠的營(yíng)養(yǎng)元素，但處于低磷脅迫條件下的林木除自身的應(yīng)激性外，還需要解磷微生物來(lái)推動(dòng)土壤中無(wú)效磷元素的轉(zhuǎn)化以保證供給.

南方地區(qū)杉木人工林下土壤有效磷在固定作用的影響下含量降低，根際解磷微生物的應(yīng)用能夠有效緩解低磷壓力[43].本研究在杉木根際篩選出的解無(wú)機(jī)磷菌W1的溶磷量高達(dá)238.08 μg/mL，解有機(jī)磷菌Y9的溶磷量達(dá)15.04 μg/mL.Y9菌株的有機(jī)磷溶解量大于范丙全等[44]在杉木根際篩選出的烏博內(nèi)氏伯克霍爾德菌(Burkholderiaubonensis)的解磷菌P5(溶磷量為195.61 mg/L)，這可能是因?yàn)椴煌N類的微生物代謝機(jī)制具有多樣性，進(jìn)而導(dǎo)致分泌物種類和數(shù)量的不同，影響解磷微生物的解磷能力[45]；但也有研究指出，微生物、土壤的空間異質(zhì)性[46]以及生存環(huán)境[47]的差異均會(huì)對(duì)微生物與植物互作產(chǎn)生影響.

對(duì)兩株菌株基因序列進(jìn)行Blast對(duì)比得到W1為不動(dòng)桿菌屬，Y9為克雷伯氏菌屬.李文等[48]提出不動(dòng)桿菌可以在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用以提高磷素的溶解量，他所篩選出的JL-1菌株溶磷量為118.04 mg/L，解磷效果顯著弱于W1.李夢(mèng)嬌等[49]研究得出克雷伯氏菌屬(K.pneumoniae)對(duì)于增強(qiáng)植物的溶磷能力具有重要作用，本研究的結(jié)果驗(yàn)證了高效解磷菌的溶磷作用顯著.莊馥璐等[46]將篩選出的不動(dòng)桿菌屬PsbM8菌株回接擬南芥(Arabidopsisthaliana)后，根系附近有明顯的溶磷圈出現(xiàn)，進(jìn)一步得出不動(dòng)桿菌屬在解磷微生物的篩選與鑒定研究中應(yīng)用較廣泛的結(jié)論.目前常見(jiàn)報(bào)道的解磷菌主要有固氮菌屬(Azotobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、歐文氏菌屬(Erwinia)、根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)和鏈霉菌屬(Streptomyces)[9,34,46].下一步亦可針對(duì)不同種屬解磷菌的解磷效果差異進(jìn)行探索.

選用高效菌株進(jìn)行培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件優(yōu)化，明晰菌株的最適宜生存環(huán)境，促進(jìn)其發(fā)揮最大功效，為日后田間根際大規(guī)模應(yīng)用奠定基礎(chǔ).培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：W1菌株與Y9菌株分別以1.0%和0.5% 的葡萄糖為最佳碳源，這與李文等[50]提出的不動(dòng)桿菌的最佳碳源為葡萄糖的結(jié)論一致；氮源的最佳選擇分別為1.50%和1.25%的酵母粉.南方紅壤區(qū)多呈酸性，Y9菌株偏向酸性環(huán)境，適宜應(yīng)用于南方杉木根際；而W1菌株偏向堿性環(huán)境，可在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中加以調(diào)節(jié)土壤酸堿度，為其生長(zhǎng)創(chuàng)造最適環(huán)境.韋宜慧等[51]在杉木根際篩選出烏博內(nèi)氏伯克霍爾德菌的P5菌株生長(zhǎng)的pH最適范圍為5～6，最適溫度為25～30 ℃.目前發(fā)現(xiàn)的解磷菌的最優(yōu)培養(yǎng)條件偏向高溫環(huán)境，解磷菌的功效可能與溫度密切相關(guān)，針對(duì)杉木主產(chǎn)區(qū)土溫較低的情況，有效降低目前現(xiàn)有優(yōu)勢(shì)解磷菌的最優(yōu)培養(yǎng)溫度是值得探索的方向.

隨著微生物與植物互作機(jī)制研究的日趨完善，根際微生物在解決林木根際營(yíng)養(yǎng)元素脅迫問(wèn)題領(lǐng)域中的應(yīng)用前景將更加廣闊.現(xiàn)有研究主要探討解磷菌的篩選、鑒定、培養(yǎng)條件優(yōu)化及其作用機(jī)制，以期獲得菌株最大生長(zhǎng)量，發(fā)揮高效解磷菌的最大效用.王志康等[52]提出土壤有機(jī)質(zhì)含量、碳氮比等是解磷微生物發(fā)揮作用的限制因子.為了更好地將解磷微生物應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，在下一步研究中應(yīng)深入探討解磷菌與植物的互作機(jī)制，可通過(guò)適當(dāng)調(diào)控環(huán)境因子，提升為解磷微生物生存、生長(zhǎng)所能提供的最大資源供應(yīng)量，以滿足接種解磷菌的繁殖與生長(zhǎng)需求，從而為利用微生物改善低磷脅迫環(huán)境提供最優(yōu)的菌種資源支持.