王艷玲 譚芳 游意瑩 余小芳 黃菲

【摘要】目的 探討原鈣黏附蛋白7（PCDH7）是否參與脂多糖（LPS）刺激引起的腎小管上皮細胞（HK-2）焦亡過程。方法 構(gòu)建LPS刺激HK-2損傷模型，使用RT-PCR和蛋白免疫印跡法檢測細胞中PCDH7、NLR家族Pyrin域蛋白3（NLRP3）、caspase-1、和IL-1β蛋白的表達變化。MTT法測定細胞活力，TUNEL法確定細胞焦亡率，ELISA法檢測細胞分泌TNF-α、IL-6水平，全自動生化分析儀檢測培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）含量。結(jié)果 與Control組比較，LPS組細胞生存率下降，細胞凋亡率升高，炎癥因子TNF-α和IL-6水平升高，細胞損傷指標LDH含量明顯升高，PCDH7的蛋白和mRNA表達明顯下調(diào)，細胞焦亡指標NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白和mRNA表達明顯上調(diào)（P均< 0.05）。結(jié)論 LPS通過下調(diào)PCDH7的表達，促進腎小管上皮細胞發(fā)生明顯細胞焦亡損傷。

【關(guān)鍵詞】原鈣黏附蛋白7;腎小管上皮細胞;脂多糖;細胞焦亡

【Abstract】Objective To investigate whether protocadherin 7 （PCDH7） participates in the progress of renal tubular epithelial cell pyroptosis induced by lipopolysaccharide （LPS）. Methods HK-2 cell was stimulated by 2 μg/ml LPS to construct renal tubular epithelial cell injury model. The changes in the expression levels of PCDH7， NLRP3， caspase-1， and IL-1β in cells were detected by RT-PCR and western blot. MTT assay was used to detect cell viability. TUNEL assay was employed to determine pyroptosis rate. ELISA was adopted to detect the secretion of TNF-α and IL-6 in cells. The content of lactate dehydrogenase （LDH） in culture medium was detected by automatic biochemical analyzer. Results Compared with the control group， cell viability was decreased， while pyroptosis rate was increased. the expression levels of TNF-α and IL-6 were up-regulated. the expression level of LDH， a biomarker of cell damage， was significantly elevated. the expression levels of PCDH7 and mRNA were significantly down-regulated. the expression levels of NLRP3， caspase-1， IL-1β and mRNA were significantly up-regulated in the LPS group （all P < 0.05）. Conclusion LPS can induce renal tubular epithelial cell pyroptosis by down-regulating the expression of PCDH7.

【Key words】Protocadherin 7; Renal tubular epithelial cell; Lipopolysaccharide; Pyroptosis

膿毒性急性腎損傷（SAKI）是一種重癥患者術(shù)后常見且嚴重影響預(yù)后的并發(fā)癥，發(fā)生率高達50%，是導致患者發(fā)展為慢性腎病甚至死亡的關(guān)鍵原因[1]。前期研究已報道SAKI主要發(fā)生在腎小管上皮細胞，且細胞焦亡是SAKI發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件，通過抑制炎癥反應(yīng)和細胞死亡可明顯減輕SAKI，然而其機制尚未完全闡明[2-4]。

研究表明，細菌等傷害性信號刺激使caspase-1活化，活化的caspase-1一方面切割Gasdermin D誘導細胞膜穿孔和破裂引起細胞死亡。另一方面促進IL-1β和IL-18活化和釋放，引起強烈的炎癥反應(yīng)，導致細胞焦亡，而過度的細胞焦亡會因細胞死亡和級聯(lián)炎癥反應(yīng)而導致器官損傷和疾病的發(fā)生[5-6]。原鈣黏附蛋白7（PCDH7）是鈣黏蛋白超家族的一組跨膜糖蛋白，廣泛參與細胞識別、通信、運動等細胞活動，介導生長分化、炎癥、免疫應(yīng)答及腫瘤轉(zhuǎn)移等復(fù)雜生物學過程[7-8]。

有研究顯示PCDH可通過干預(yù)炎癥因子、趨化因子等的募集和浸潤，控制級聯(lián)炎癥反應(yīng)，參與疾病的防治[9-11]。本研究擬評價脂多糖（LPS）刺激引起腎小管上皮細胞PCDH7表達和細胞焦亡過程的變化。

材料與方法

一、材 料

腎小管上皮細胞株（HK-2）購自美國ATCC公司，SYBR Green RT-PCR試劑盒購自日本TOYOBO，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司， PCDH7、NLR家族Pyrin域蛋白3（NLRP3）、caspase-1和IL-1β抗體購自美國Santa Cruz公司，MTT試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、TNF-α和IL-1β含量測定試劑盒均購自廣州杰特偉生物科技有限公司，原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)（TUNEL）試劑盒購自美國 Roche公司。

二、方 法

1. 細胞培養(yǎng)

配制含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，將HK-2復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，加入7 mL培養(yǎng)基，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。待細胞生長達到80%融合時，用0.05%胰蛋白酶消化并傳代，每4～5 d傳代1次，選取處于對數(shù)生長期并且狀態(tài)良好的細胞進行后續(xù)實驗。

2. 實驗分組與處理

HK-2以1.5×104個/mL 的密度接種于96孔培養(yǎng)板，研究分為Control組和LPS組。Control組置于常氧恒溫培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2-21%O2-74%N2）中培養(yǎng)24 h;LPS組加入含2 μg/mL LPS（Sigma公司， 美國）的培養(yǎng)基，置于常氧恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h;每組設(shè)置復(fù)孔5個。

3. 檢測方法

MTT法檢測細胞活力，流式細胞儀測定細胞焦亡率，ELISA法檢測細胞分泌TNF-α和IL-6的水平，全自動生化分析儀檢測LDH含量，分別參照產(chǎn)品說明書完成檢測。

4. 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達

根據(jù)總蛋白提取裂解液說明書按步驟操作，取適量蛋白樣本進行電泳，分離后轉(zhuǎn)膜、封閉。洗膜后加入一抗4℃孵育過夜，再加入二抗（1∶5000） 室溫下孵育1 h。洗膜3次后顯色曝光。采用Tanon-4500凝膠圖像處理系統(tǒng)進行結(jié)果分析。

5. RT-PCR法檢測mRNA表達

按照RNA快速提取試劑盒說明書提取各組細胞中的RNA，測定RNA純度與濃度，逆轉(zhuǎn)錄后測定目的基因，選擇β-actin作為內(nèi)參基因。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件和GraphPad prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析及作圖，使用Kolmogorov-Smirnov檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性，Levene檢驗用于檢驗方差齊性。正態(tài)分布的計量資料以? 表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、LPS刺激對腎小管上皮細胞生存率和焦亡率的影響

與Control組比較，LPS組明顯降低腎小管上皮細胞的生存率（P < 0.001），增加腎小管上皮細胞的焦亡率（P < 0.05），見表1。

二、LPS刺激對腎小管上皮細胞炎癥因子和LDH水平的影響

與Control組比較，LPS組炎癥因子TNF-α和IL-6水平明顯升高（tTNF-α = -24.381，P < 0.001;tIL-6 = -15.205，P < 0.001），細胞損傷指標LDH水平也明顯升高（tLDH = -8.771，P < 0.001），見圖1。

三、LPS刺激對腎小管上皮細胞PCDH7表達的影響

與Control組比較，LPS組PCDH7表達明顯下調(diào)，見圖2。

四、LPS刺激對腎小管上皮細胞PCDH7蛋白表達的影響

蛋白免疫印跡法灰度分析結(jié)果顯示，LPS組細胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、caspase-1及IL-1β表達均高于Control組（tNLRP3 = -7.359，P = 0.009;tcaspase-1 = -22.390，P = 0.001;tIL-1β = -8.717，P = 0.006），見圖3。

五、LPS刺激對腎小管上皮細胞PCDH7、NLRP3、caspase-1和IL-1β mRNA表達的影響

與Control組比較，LPS組PCDH7 mRNA的表達下調(diào)，NLRP3、caspase-1和IL-1β mRNA的表達上調(diào)，見表2。

討論

重癥患者常由于感染或腸黏膜屏障破壞、腸道菌群改變和微生物易位，引起全身性炎癥反應(yīng)，改變宿主的免疫和代謝穩(wěn)態(tài)，引起膿毒血癥，并驅(qū)動術(shù)后急性腎損傷（AKI）的發(fā)生，而AKI期間炎癥介質(zhì)和代謝產(chǎn)物的清除減少，進一步導致腸道損傷和黏膜屏障破壞，加重SAKI，導致惡性循環(huán)從而造成嚴重后果[12]。膿毒血癥患者圍術(shù)期病理生理變化非常復(fù)雜，術(shù)后AKI的高發(fā)生率是影響患者預(yù)后和導致患者死亡的重要原因之一[13]。

SAKI同心源性、缺血再灌注等原因引起AKI明顯不同的病理學表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細胞凋亡和炎性細胞浸潤，而在其他原因AKI中常見的細胞壞死幾乎不存在[14]。有證據(jù)表明，SAKI的起源是多方面的，存在幾種并發(fā)機制，其中特有的募集和誘導炎癥因子、趨化因子、其他黏附分子等的浸潤，級聯(lián)放大炎癥反應(yīng)在誘導最早期的細胞損傷尤為重要[1， 15]。組織修復(fù)與細胞死亡相關(guān)基因PCDH7具有促進細胞運動優(yōu)于維持細胞黏附穩(wěn)定性的特點，介導動態(tài)細胞過程[16]。多項研究顯示PCDH可通過調(diào)控炎癥因子和趨化因子等的募集和浸潤，參與多種疾病的防治[9-11]。本研究基于上述研究背景，發(fā)現(xiàn)LPS刺激腎小管上皮細胞引起細胞焦亡，伴隨PCDH7的表達抑制，提示PCDH7的表達減少可能參與LPS引起的腎小管上皮細胞焦亡過程。

本研究使用LPS刺激腎小管上皮細胞建立腎小管上皮細胞損傷模型，基于前期研究和預(yù)實驗結(jié)果，選取濃度為2μg/mL的LPS刺激腎小管上皮細胞，結(jié)果表明LPS引起以細胞焦亡損傷形式為主的腎小管上皮細胞損傷過程，表現(xiàn)為腎小管上皮細胞生存率下降，細胞焦亡率升高，炎癥因子IL-6和TNF-α、細胞損傷指標LDH水平明顯升高，細胞焦亡指標NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白及mRNA水平升高，此研究結(jié)果與同行相關(guān)研究結(jié)果一致[4， 17]。在此基礎(chǔ)上，為了確定 PCDH7是否參與LPS誘導的腎小管上皮細胞焦亡過程，本研究進一步觀察組織修復(fù)和細胞死亡相關(guān)基因PCDH7的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS刺激腎小管上皮細胞損傷過程伴隨PCDH7蛋白和mRNA的表達明顯下調(diào)，提示PCDH7的表達減少參與LPS引起腎小管上皮細胞焦亡過程。研究報道了內(nèi)皮細胞中的“組織修復(fù)相關(guān)基因”PCDH可通過細胞骨架動力學調(diào)控，在多種損傷修復(fù)過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)炎性細胞極性遷移的作用[9]。研究已證實PCDH1是氣道功能的重要物理屏障，吸煙明顯降低肺組織PCDH1的表達，誘導中性粒細胞增多和氣道高反應(yīng)性[10]。PCDH17前體在潰瘍性結(jié)腸炎的受損黏膜中高表達，參與創(chuàng)傷早期朝向創(chuàng)傷位點的細胞極化遷移[11]。因此，我們認為 LPS可能通過調(diào)控腎小管上皮細胞PCDH7的表達，介導細胞焦亡損傷過程。

DNA甲基化是一種介導多種疾病發(fā)生過程的表觀遺傳修飾[18]。研究揭示了PCDHB基因甲基化在膿毒性炎癥反應(yīng)過程中調(diào)節(jié)白細胞的黏附和遷移功能，影響膿毒癥的嚴重程度并導致不良預(yù)后[19]。受損腎臟組織即使在起始的AKI完全恢復(fù)以后，部分AKI仍會向慢性腎臟病轉(zhuǎn)變，這種被稱為“損傷記憶”的現(xiàn)象就是由表觀遺傳學的改變介導，肯定了以表觀遺傳學手段為靶向防治腎損傷的可行性[20]。未來我們將進一步從PCDH7甲基化的角度深入探究其參與LPS引起腎小管上皮細胞焦亡的分子機制，進而從表觀遺傳學角度為重癥患者術(shù)后SAKI的精準防治提供新思路。

綜上所述，LPS刺激腎小管上皮細胞損傷的細胞焦亡過程與其對PCDH7表達的調(diào)控有關(guān)。

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（收稿日期：2021-12-25）

（本文編輯：楊江瑜）