陳 歡 ,王 靜 ,高榮榮

河北省衡水市人民醫(yī)院:1.婦科;2.兒科,河北衡水 053000

卵巢癌(EOC)是婦科常見的癌癥,也是全球婦科惡性腫瘤致癌死亡的主要原因。目前,EOC的主要治療方法是手術(shù)結(jié)合鉑基療法[1]。在EOC 治療方面,臨床上取得了較大進(jìn)步,但鉑基療法抗藥性(PR)也出現(xiàn)了進(jìn)展,這導(dǎo)致晚期疾病患者的5 年總生存率較低[2-3]。母體表達(dá)的印記長鏈非編碼RNA(lncRNA)基因H19,在出生后顯著下調(diào),然后在腫瘤中過表達(dá)。先前的研究報(bào)道顯示,H19在各種癌癥的生物學(xué)進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用,包括乳腺癌、胃癌、肝細(xì)胞癌和EOC[3]。已有研究表明,H19 基因的異常表達(dá)與肝母細(xì)胞瘤、生殖細(xì)胞腫瘤、食道癌和腎細(xì)胞癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤有關(guān)[4]。在人的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中,H19基因座上印跡丟失,而H19表達(dá)的上調(diào)是獲得性順鉑抗藥性的重要和關(guān)鍵因素。lncRNA 基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)可能會(huì)顯著影響基因表達(dá)和功能,從而導(dǎo)致腫瘤易感性和化學(xué)治療敏感性的改變。已有證據(jù)表明,H19基因的遺傳變異可能會(huì)改變多種腫瘤化療的敏感性,且在中國女性中,H19 rs2839698 與結(jié)直腸癌和胃癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[5]。此外,最近的證據(jù)表明,H19基因的SNP與肺癌患者鉑類化療反應(yīng)顯著相關(guān)[6]。目前,EOC患者基于鉑類化療反應(yīng)與H19基因的SNP關(guān)系尚不清楚。本研究擬探討H19基因多態(tài)性對(duì)上皮性EOC 患者鉑類化療應(yīng)答和預(yù)后的影響,為上皮性EOC 治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年9月至2019年12月本院136例接受鉑類化療的上皮性EOC 為研究對(duì)象。收集患者2 mL 血液標(biāo)本用于H19多態(tài)性的基因分型。所有患者均接受化療,化療方案為175 mg/m2紫杉醇+卡鉑劑量,卡鉑劑量(mg)=所設(shè)定的曲線下面積[AUC,mg/(mL· min)]× [肌酐清除率(mL/min)+25],AUC取值為5 mg/(mL·min),肌酐清除率=(140-年齡)×1.23×0.85/(血清肌酐值)[7],每3周進(jìn)行1次治療,共6個(gè)周期。根據(jù)患者對(duì)治療的反應(yīng),將患者分為兩類:(1)敏感應(yīng)答組66例:在隨訪期內(nèi)達(dá)到完全反應(yīng)并保持緩解的患者;(2)無敏感應(yīng)答組70例:患者在治療期間或治療后疾病復(fù)發(fā)。本研究得到本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者年齡大于18歲;(2)患者在組織學(xué)上證明為上皮性EOC;(3)重要臟器器官功能正常;(4)獲得患者及家屬知情。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患者依從性差;(2)患有心血管疾病。(3)早期使用鉑類化學(xué)療法治療。

1.2 方法 抗凝管收集血液標(biāo)本,使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)將200 μL 全血樣品用于全基因組DNA 分離,檢測H19基因中4種常見的SNP(rs3741206 T/C、rs3842761 C/G、rs4244809 A/G、rs7924316 G/T),采用多重PCR 對(duì)SNPs進(jìn)行基因分型,包括H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G、rs4244809 A/G、rs7924316 G/T。引物序列如下:rs3741206,正向5'-TGA TCT CGA TGC TAC GTC GTA GCT AGC TAG CTA GCT-3',反向5'-TGC GAG AGC TAG CTA GCT AGT GAT CGA TGT AG-3'。rs3842761,正向5'-TGA CGC TAG TCA GTC GAT GCT AGC TAG CTA GCT AGT-3',反向5'-TGC TAG CTA GTC GAT GTA GCT AGT CGA TCG ATC GT-3'。rs4244809,正向5'-CGA GTA GCT GAT CGA TGC TAG TCG ATC GTA GCT AGC-3',反向5'-TGC TAG TCG ATC GTA GCT AGC TGA TCG ATC GTA GCT A-3'。rs7924316,正向5'-TGA CGT AGC TGA TCG ATC GTA GCT AGC TAG TCG AT-3',反向5'-TGG GCT AGA TGC TAG GGA TCG TAG CTG ATC GTG-3'。使用多基因特異性引物通過PCR 對(duì)高質(zhì)量的基因組DNA 樣品進(jìn)行基因分型,富集特定的SNP和索引引物,在離子質(zhì)子系統(tǒng)(Life Technologies)上進(jìn)行大規(guī)模并行測序。同時(shí)收集所有研究對(duì)象的一般資料,包括腫瘤最大徑、國際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)(FIGO)分期、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)情況等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);采用多因素Logistic回歸分析探討H19基因型與化療敏感性的關(guān)系,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型與上皮性EOC 臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系 H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型與年齡無關(guān)(P>0.05);與腫瘤最大徑、FIGO 分期、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān),且腫瘤最大徑≥5 cm、FIGO分期越高、淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā),H19 rs3741206 CT/TT、rs3842761 CC/CG 基因型比例越高(P<0.05)。見表1。

表1 H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型與上皮性EOC臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.2 H19 rs4244809 A/G、rs7924316 G/T 基因型與上皮性EOC 臨床病理特征與預(yù)后復(fù)發(fā)關(guān)系 H19 rs4244809 A/G、rs7924316 G/T 基因型與年齡、腫瘤最大徑、FIGO 分期、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 H19 rs4244809 A/G、rs7924316 G/T 基因型與上皮性EOC臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表2 H19 rs4244809 A/G、rs7924316 G/T 基因型與上皮性EOC臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 H19基因型與上皮性EOC 鉑類化療敏感性的關(guān)系 H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型與上皮性EOC 鉑類化療敏感性有關(guān)(P<0.05),且上皮性EOC 鉑類化療敏感性越高,H19 rs3741206 CC 基因型、rs3842761 GG 基因型比例越高(P<0.05)。H19 rs4244809 A/G、rs7924316 G/T 基因型與上皮性EOC鉑類化療敏感性無關(guān)(P>0.05)。見表3。

表3 H19 基因型與上皮性EOC鉑類化療敏感性的關(guān)系分析[n(%)]

2.4 H19基因多態(tài)性與上皮性EOC 患者鉑類化療敏感性的多因素Logistic回歸分析 以上皮性EOC患者鉑類化療敏感性為因變量(敏感=0,不敏感=1),以H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G、rs4244809 A/G、rs7924316 G/T基因型為自變量進(jìn)行多因素Logistic逐步回歸分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型為上皮性EOC 患者鉑類化療敏感性的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響H19基因多態(tài)性對(duì)上皮性EOC患者鉑類化療敏感性的多因素Logistic回歸分析

3 討論

目前臨床主要采用外科手術(shù)和化療結(jié)合的方式對(duì)EOC 進(jìn)行治療,卡鉑已廣泛用于EOC 治療,但患者可能會(huì)對(duì)卡鉑治療產(chǎn)生耐藥性并最終導(dǎo)致化療失敗?？ㄣK通過形成DNA/鉑復(fù)合物來抑制EOC 細(xì)胞中的DNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,從而導(dǎo)致DNA 斷裂,編碼錯(cuò)誤,并最終通過凋亡導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡[8]。

H19負(fù)責(zé)消除DNA的長鏈損傷并恢復(fù)功能性雙鏈DNA(dsDNA),這種多功能的DNA 修復(fù)系統(tǒng)可識(shí)別基于鉑類治療引起的DNA 損傷并恢復(fù)原始DNA分子[9]。據(jù)報(bào)道,在卡鉑耐藥性EOC 細(xì)胞系或新鮮組織中,H19蛋白mRNA的水平升高,提示H19 蛋白復(fù)合物在卡鉑治療結(jié)果中具有至關(guān)重要的作用。H19基因在第19條染色體的長臂上,位置為13.32,已有研究報(bào)道了H19基因中具有多個(gè)SNP[10]。有學(xué)者報(bào)道了8 個(gè)常見SNP(rs11615:C>T,位置45、420、395;rs3212986:C>A,位 置45、409、478;rs735482:A>C,位置45、408、744;rs2336219:A>G,位置45、409、148;rs3212980:A>C,位置45、413、183;rs3212964:G>A,位置45、417、538;rs3212961:C>A,位置45、419、065;rs2298881:C>A,位置45、423、658),這些H19多態(tài)性在不同的DNA 修復(fù)相關(guān)疾病中起重要作用[11]。

H19基因區(qū)域包括2 個(gè)基因:H19,反義H19(H19AS)。本研究包括了 H19的4 種基因型(rs3741206 T/C、rs3842761 C/G、rs4244809 A/G、rs7924316 G/T)。目前,有關(guān)SNP與人類疾病關(guān)系研究罕見。既往研究曾觀察到散發(fā)性Beckwith-Wiedemann綜合征患者H19的rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 單倍型(CT/TT 基因型、CC/CG 基因 型)頻率增加,這與孕婦KvDMR1等位基因特異性甲基化的喪失有關(guān)[12-13]。已有研究表明,H19的rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 與孕婦妊娠晚期的葡萄糖水平升高和出生時(shí)胎盤中H19的水平有關(guān)[14]。還有研究表明,H19在耐藥細(xì)胞株如肝癌和對(duì)阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞及對(duì)卡鉑耐藥的EOC細(xì)胞株中過表達(dá)[15-16]。據(jù)報(bào)道,H19過表達(dá)是通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝實(shí)現(xiàn)的,是癌癥患者對(duì)卡鉑耐藥的潛在機(jī)制[17-18]。此外,H19 7924316 T 等位基因攜帶者由于較高的H19 RNA 表達(dá)而對(duì)鉑類化學(xué)療法反應(yīng)的可能性較小,肺癌患者中H19 rs4244809與鉑類化學(xué)療法相關(guān)[19-20]。然而,本研究未觀察到這2種H19基因型與EOC患者鉑類化學(xué)療法的敏感性有關(guān)。

為了進(jìn)一步確定H19 基因型與EOC 患者的年齡、分期、組織學(xué)、腫瘤等級(jí)、復(fù)發(fā)情況之間的關(guān)聯(lián),本研究分析了H19的SNP等位基因的頻率和基因型差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型與腫瘤最大徑、FIGO 分期、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān),且腫瘤最大徑≥5 cm、FIGO分期越高、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā),rs3741206 CT/TT 基因型、rs3842761 CC/CG 基因型比例較高(P<0.05)。這提示H19與EOC患者臨床病理、預(yù)后有關(guān)。而EOC 是一類源自各種組織學(xué)亞型的異質(zhì)性腫瘤,組織學(xué)和腫瘤分級(jí)都是EOC預(yù)后的獨(dú)立影響因素。此外,不同的組織學(xué)類型和腫瘤等級(jí)具有多種遺傳和表觀遺傳異常,這也可能導(dǎo)致不同的結(jié)果。有學(xué)者在透明細(xì)胞癌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了抑癌基因ARID1A和TGFⅡ的高頻率突變,而在子宮內(nèi)膜樣癌中發(fā)現(xiàn)了H19s3741206突變及BAF250a(ARID1A)丟失[17],這些機(jī)制探討將在后續(xù)研究中進(jìn)行。

本研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn),H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型與上皮性EOC 鉑類化療敏感性有關(guān),且H19 rs3741206 CC、rs3842761 GG 基因型比例越高,上皮性EOC 鉑類化療敏感性越高(P<0.05);可能這兩種基因型發(fā)揮協(xié)同功能,這將導(dǎo)致DNA 修復(fù)活性增強(qiáng),最終對(duì)卡鉑介導(dǎo)的治療反應(yīng)的敏感性增加。此外,本研究顯示H19 rs4244809 A/G、rs7924316 G/T基因型與上皮性EOC鉑類化療敏感性無關(guān)(P>0.05),而H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G基因型為上皮性EOC患者鉑類化療敏感的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。這表明H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G基因型可作為預(yù)測EOC卡鉑化療敏感性的潛在生物標(biāo)志物。

綜上所述,H19 rs3741206T/C、rs3842761 C/G基因型與上皮性EOC 患者臨床病理特征與預(yù)后、化療應(yīng)答有關(guān);H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型有望作為預(yù)測EOC卡鉑化療治療敏感性的生物標(biāo)志物。