馮杉杉，金毅夫，陳 歡，侯妍妍，丁景瑜，朱 松

口腔粘接劑與牙體組織牢固的結(jié)合,是修復(fù)體發(fā)揮功能,保證粘接耐久性的前提[1]。在酸蝕-沖洗粘接過(guò)程中,牙本質(zhì)粘接劑未能充分滲透脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)層,實(shí)現(xiàn)對(duì)混合層底部脫礦的膠原纖維有效完整的包裹與保護(hù),獲得理想質(zhì)量的混合層[2]。牙本質(zhì)粘接界面處無(wú)法形成長(zhǎng)期有效的邊緣封閉，產(chǎn)生微滲漏,細(xì)菌進(jìn)入后引起繼發(fā)齲,最終導(dǎo)致粘接失敗。

目前通過(guò)采用濕粘接[3]、添加膠原纖維交聯(lián)劑[4]等減少粘接界面降解的方法使牙本質(zhì)即刻粘接強(qiáng)度有了很大的提升,但這些方法仍然無(wú)法消除混合層的固有缺陷。為提高牙本質(zhì)-樹(shù)脂界面的穩(wěn)定性,具備抗齲功能的牙本質(zhì)粘接劑成為研究的熱點(diǎn)。陽(yáng)離子抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)作為廣譜高效抗菌活性多肽,可以干擾致齲菌在生物膜中的粘附和定植，破壞生物膜的完整性，其獨(dú)特的抗菌機(jī)制和潛在的低誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性[5]使其在改性牙本質(zhì)粘接劑中具有良好的應(yīng)用前景。本文將從AMPs的種類(lèi)、抗菌機(jī)制、在牙本質(zhì)粘接劑中的應(yīng)用及防齲效果等方面展開(kāi)介紹。

1 AMPs的抗菌作用機(jī)制

氯己定、季銨鹽、三氯生等可以有效抑制致齲菌并控制菌斑生物膜的形成[6-8],長(zhǎng)期應(yīng)用可能會(huì)使致齲菌耐藥,破壞口腔的穩(wěn)態(tài),引起微生態(tài)失調(diào), 難以提供長(zhǎng)期有效的抗菌性，并對(duì)口腔健康造成不利影響[9]。AMPs，尤其是陽(yáng)離子兩親性α-螺旋肽，能夠有效地抑制浮游細(xì)菌的生長(zhǎng)和菌斑生物膜的形成，在誘導(dǎo)現(xiàn)有的生物膜溶解方面具有較高的生物活性[10]。

AMPs經(jīng)典的非特異性作用機(jī)制可以概括為細(xì)胞膜靶向機(jī)制和非膜靶向機(jī)制[11-12]。前者AMPs通過(guò)初始的靜電作用和(或)疏水作用在細(xì)菌細(xì)胞膜上聚集,達(dá)到一定的閾值濃度后在其表面進(jìn)行自組裝,破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,形成跨膜孔道,導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)泄漏、膜電位的去極化和膜功能障礙,最終使細(xì)胞裂解死亡[10,13-14]。后者AMPs可以穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)作用,通過(guò)抑制DNA、RNA的合成,干擾蛋白質(zhì)的翻譯和阻礙細(xì)胞壁的合成等途徑殺滅細(xì)菌[15]。

2 AMPs在改性牙本質(zhì)粘接劑中的應(yīng)用

AMPs主要通過(guò)物理混合吸附或者化學(xué)共價(jià)結(jié)合的方法與牙本質(zhì)粘接劑結(jié)合,并借非特異性靶向作用機(jī)制殺滅細(xì)菌。根據(jù)AMPs的功能可以將改性的牙本質(zhì)粘接劑分為抗菌牙本質(zhì)粘接劑和兼具抗菌和促礦化效果的雙功能牙本質(zhì)粘接劑。

2.1 抗菌牙本質(zhì)粘接劑

天然的AMPs結(jié)構(gòu)-功能的結(jié)構(gòu)關(guān)系復(fù)雜,AMPs抗菌性能具有不穩(wěn)定性，因此無(wú)毒、高效、穩(wěn)定的AMPs是目前臨床迫切需要的。為進(jìn)一步優(yōu)化其物理化學(xué)性能和抗菌性能,學(xué)者們合成天然AMPs的類(lèi)似物或部分片段,并通過(guò)修飾氨基酸序列以提高AMPs的生物活性,優(yōu)化合成肽的功能[16]。目前有研究顯示單一賴(lài)氨酸、Reuricin-6和Gassericin A的衍生肽LR-10和LN-7、乳酸鏈球菌素(Nisin)和GH12等已開(kāi)始用于改性牙本質(zhì)粘接劑。

2.1.1 Reuricin-6和Gassericin A的衍生肽 Reuricin-6和Gassericin A是由口腔中乳桿菌分泌的環(huán)狀細(xì)菌素,能有效抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)及其生物膜的形成[17]。因其具有較長(zhǎng)的環(huán)狀結(jié)構(gòu),合成復(fù)雜且成本較高，有研究從Reuricin 6或Gassericin A的陽(yáng)離子α-螺旋區(qū)域截?cái)嗟腖R-1(ATGTARKLLDAMA-NH2),構(gòu)建了10種新的具備陽(yáng)離子性和疏水性的短線(xiàn)增強(qiáng)AMPs[18-19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LR-10(LRWWLWKLLRRMR-NH2)在抑制生物膜的生長(zhǎng)和對(duì)變異鏈球菌殺菌效果方面呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性、對(duì)口腔生理?xiàng)l件的耐受性強(qiáng)、生物安全性高[19]。

此外,有學(xué)者指出,AMPs螺旋成分的百分比>80%,對(duì)其抗菌性能有影響[20]。對(duì)此,有研究者對(duì)LR-1進(jìn)行氨基酸替換和結(jié)構(gòu)修飾合成LN-7(LRRWLRWLLRWMR-NH2),通過(guò)圓二色譜分析測(cè)定,LN-7中α-螺旋結(jié)構(gòu)的比例為99.6%,并結(jié)合抗菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證具有高螺旋組成LN-7具備良好的抗菌活性[19]。將STAMP中靶向變異鏈球菌的功能結(jié)構(gòu)域與LN-7、LR-10整合[21],并將整合后的AMPs物理混合到牙本質(zhì)粘接劑中[10]，以提高其對(duì)致齲菌細(xì)胞膜的靶向選擇性。

2.1.2 抗菌肽GH12 GH12(GLLWHLLHHLLH-NH2) 是一種兩親性陽(yáng)離子AMPs，具有高比例的α-螺旋結(jié)構(gòu)和平衡的參數(shù)結(jié)構(gòu)[22]。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究都表明GH12在唾液中保持穩(wěn)定，具有快速和強(qiáng)大的抗菌活性，此外，GH12具有濃度依賴(lài)性，64 mg/L的GH12處理后的生物膜呈現(xiàn)松散、平坦和多孔樣形態(tài)，可顯著破壞生物膜的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性[22]。研究發(fā)現(xiàn)GH12具有智能酸活化防齲的能力，酸性pH不影響GH12的二級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)GH12在陰離子細(xì)菌膜上的累積，增強(qiáng)與細(xì)菌膜的相互作用，誘導(dǎo)生物膜基質(zhì)降解，提升對(duì)細(xì)菌的殺傷力[23-24]。當(dāng)口腔中致齲病原菌生長(zhǎng)積累,pH下降時(shí),被組氨酸修飾的GH12可以增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性和胞膜的溶解活性[24-25],有選擇地殺死預(yù)先定植在牙菌斑中的致齲菌,抑制各種毒力因子作用,調(diào)節(jié)致齲條件下牙菌斑中的不良微生物生態(tài)環(huán)境[22,26-27],降低齲齒的發(fā)生率。

GH12及其衍生物可與牙本質(zhì)粘接劑Single Bond 2共聚結(jié)合[28]。但AMPs存在有限的最佳活性構(gòu)象, AMPs與聚合物之間的非特異性相互作用會(huì)限制肽的生物活性, 降低AMPs的抗菌性能[29]。粘接劑中的AMPs固化后會(huì)失去部分活性，學(xué)者在AMPs上設(shè)計(jì)間隔域,提供靈活性構(gòu)象, 使抗菌肽在與粘接劑共聚結(jié)合后仍可發(fā)揮最佳抗菌生物活性[30-31]，保證粘接劑的遠(yuǎn)期抑菌效果。添加單一賴(lài)氨酸還可以調(diào)節(jié)粘接劑的酸堿度,克服粘接界面處酸性微環(huán)境的不利影響,提高粘接的耐久性[32]。有研究者嘗試將ε-聚賴(lài)氨酸添加到牙本質(zhì)粘接系統(tǒng)中與共聚單體偶聯(lián),并依據(jù)ε-聚賴(lài)氨酸中α-NH2可以與共聚物中的—COOH反應(yīng)形成多肽單體的原理,設(shè)計(jì)出GH12,GH12-M1(K_GGGSG_GLLWHLLHHLLH)和GH12-M2(GLLWHLLHHLLH_GSGGG_K)3種多肽單體進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究,其中GH12-M1包括一個(gè)間隔域,在N端有一個(gè)單一的賴(lài)氨酸殘基,用于偶聯(lián)到聚合物上,GH12-M2具有與GH12-M1相同間隔區(qū)序列,但是將單一的賴(lài)氨酸殘基放置在肽的C—末端,最終實(shí)驗(yàn)證實(shí)GH12-M2具有更優(yōu)異的抗菌功效和靈活性,可以直接地偶聯(lián)到粘接劑配方中[29]。目前尚未開(kāi)發(fā)出與牙本質(zhì)粘接劑結(jié)合的理想的共聚單體——不降低AMPs的生物活性和保持牙本質(zhì)粘接劑所需的性能[33],但利用AMPs對(duì)復(fù)雜牙菌斑生物膜的有效作用機(jī)制,探索如何維持AMPs的抗菌調(diào)控機(jī)制的長(zhǎng)期敏感性是十分有必要的。

2.1.3 乳酸鏈球菌素(Nisin) Nisin是一種由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的具有高效的抗菌活性小分子多肽，其抗菌活性不受唾液中的酶、蛋白質(zhì)或其他無(wú)機(jī)成分的影響[34]。在低pH環(huán)境中，Nisin的穩(wěn)定性更高，在粘接界面溶解吸附能力增強(qiáng)，其對(duì)致齲菌的抑制作用更明顯[35]。

體外實(shí)驗(yàn)研究顯示在光固化的牙本質(zhì)粘接劑中Nisin能長(zhǎng)期存在于粘接界面，抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)，且隨著Nisin濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)[36]。在自酸蝕和酸蝕-沖洗模式下，1%～3%Nisin都不會(huì)對(duì)Single Bond Universal粘接強(qiáng)度產(chǎn)生不利影響，其中含有3%Nisin粘接劑對(duì)變異鏈球菌單種生物膜和唾液衍生多物種生物膜的生長(zhǎng)的抑菌效果最好[36-37]。

盡管粘接劑中Nisin可以抑制多種細(xì)菌的共聚，但是還需要對(duì)繼發(fā)齲動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)研究及體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究粘接劑固化后影響Nisin活性的因素，以提升Nisin抗菌敏感性和穩(wěn)定性。

2.2 雙功能牙本質(zhì)粘接劑

齲損是牙體硬組織脫礦和再礦化之間動(dòng)態(tài)失衡造成的，具備再礦化功能的AMPs可以充當(dāng)異質(zhì)成核位點(diǎn),或通過(guò)與晶體表面相互作用在粘接界面處作為模板,形成晶體的成核和成長(zhǎng)過(guò)程[38]。粘接劑中的AMPs可以促進(jìn)存在缺陷的混合層再礦化,提高粘接界面的封閉性和完整性，優(yōu)化粘接界面處的即刻和遠(yuǎn)期修復(fù)效果。

據(jù)報(bào)道,磷蛋白和磷酸肽能促進(jìn)礦化,磷酸絲氨酸(phosphoserine,Sp)是其中的關(guān)鍵部分,它與羥基磷灰石(HA)結(jié)合,并吸引游離鈣離子(Ca2+)作為核心啟動(dòng)礦化[39-40]。Zhou等[41]在能夠殺死包括變異鏈球菌在內(nèi)的多種細(xì)菌和真菌的唾液抗菌肽Histatin 5(H5)的N-端枝接了Sp,構(gòu)建了具有生物活性的Sp-H5分子,使其成為一種兼?zhèn)淇咕驮俚V化性能的生物活性抗菌肽,可安全用于齲齒的預(yù)防和有效促進(jìn)齲損原位自愈。

有研究顯示，不同序列和空間構(gòu)象、兩親性、陽(yáng)離子性、極性角等會(huì)賦予AMPs不同的抗菌效果[44]。因此AMPs的抗菌性能不僅取決于較強(qiáng)的α-螺旋構(gòu)象，還取決于適當(dāng)?shù)氖杷院完?yáng)離子平衡和最佳的兩親性結(jié)構(gòu)。

3 總結(jié)與展望

盡管近年來(lái)AMPs改性的牙本質(zhì)粘接劑已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，粘接界面處的邊緣封閉性增強(qiáng)抗菌效果顯著提升，適當(dāng)添加AMPs對(duì)于粘接劑的遠(yuǎn)期粘接效果和機(jī)械性能影響較小。但是AMPs在牙本質(zhì)粘接劑中的應(yīng)用仍然存在一些問(wèn)題,如需進(jìn)一步評(píng)估AMPs的生物分子特征和功能特性的關(guān)系，調(diào)整AMPs的結(jié)構(gòu)和功能，降低其細(xì)胞毒性，抑制致齲生物群的生長(zhǎng)，優(yōu)化抗菌性能；明確AMPs與牙本質(zhì)粘接劑構(gòu)建過(guò)程的復(fù)雜機(jī)制及需添加AMPs的安全有效濃度；研究證明二者結(jié)合的穩(wěn)定性以及一些添加抗菌肽的粘接劑對(duì)宿主細(xì)胞是否可能引起不必要的促炎反應(yīng)等。

陽(yáng)離子抗菌肽的化學(xué)和物理穩(wěn)定性很可能會(huì)受到外界因素的影響，如溫度和pH，從而縮短抗菌活性的時(shí)間。如何調(diào)整AMPs的濃度，協(xié)調(diào)固化后的粘接劑穩(wěn)定持久的抗菌活性、粘接的耐久性和粘接強(qiáng)度之間的平衡狀態(tài),保證材料的機(jī)械性能，切實(shí)提升粘接修復(fù)的遠(yuǎn)期效果，也是未來(lái)我們需要不斷努力和探索的方向。