桑亞男，郭現(xiàn)輝，董 升，王權(quán)亮，張安東，閆 瑞

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 鄭州 450000；2.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 鄭州 450000；3.阜外華中心血管病醫(yī)院 鄭州 450000）

慢性炎癥疼痛是臨床上最常見的病理性疼痛之一，引起的持續(xù)性疼痛會(huì)對(duì)患者身心造成嚴(yán)重影響。慢性疼痛的經(jīng)歷會(huì)影響個(gè)體的生理狀態(tài)，即使在疼痛感覺已經(jīng)恢復(fù)之后，有慢性疼痛經(jīng)歷的受試者通常對(duì)隨后的較低疼痛表現(xiàn)出增強(qiáng)的反應(yīng)[1]。目前常用的疼痛治療藥物為各類抗炎藥和鎮(zhèn)痛藥，但長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生不同程度的副作用。針灸鎮(zhèn)痛已被廣泛用于緩解多種疼痛，特別是慢性疼痛。雖然已有研究表明針灸可以通過抗氧化途徑，神經(jīng)保護(hù)和抗炎途徑產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[2]，但目前針刺鎮(zhèn)痛的機(jī)制仍不完善。

Wnt-1和β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，已有研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路以及相關(guān)蛋白的表達(dá)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[3-4]。此外，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，Wnt蛋白家族在調(diào)節(jié)軸突再生和神經(jīng)性疼痛的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[5]。Wnt信號(hào)通路的激活可刺激促炎因子TNF-α和IL-1β的分泌，加劇神經(jīng)性疼痛[6-8]。Wnt或β-catenin的活化都可以促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）表達(dá)，然后加重神經(jīng)疼痛[9-11]。然而針灸治療慢性疼痛的機(jī)制是否與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)仍不清楚。

CREB和ERK蛋白都與各種類型的疼痛傳遞有關(guān)[12]，例如神經(jīng)性疼痛、糖尿病神經(jīng)病變疼痛、或者辣椒素誘導(dǎo)的疼痛。CREB和ERK蛋白屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，通過調(diào)節(jié)背根神經(jīng)節(jié)（DRG）、脊髓和大腦皮層的神經(jīng)元可塑性和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致疼痛超敏反應(yīng)[13]。在慢性疼痛的外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都存在MAPKs的過度磷酸化[14-15]，而抑制MAPKs會(huì)減弱神經(jīng)元興奮性并緩解疼痛[16-17]。然而，ERK/MAPK信號(hào)通路在針灸治療慢性疼痛中的作用尚不清楚。

因此，本研究建立慢性炎性疼痛大鼠模型，旨在探究電針（Electroacupuncture，EA）干預(yù)治療對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路和ERK/MAPK信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步明確針刺消炎鎮(zhèn)痛可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康的SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量200-250 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：20190078。所有大鼠均正常飲食飲水。

1.2 試劑與儀器

前列腺素E2（PGE2）ELISA試劑盒（Elabscience，54J6AM7NFP）、白 介 素-6（IL-6）ELISA試 劑 盒（Abcam，ab234570）、IL-1β ELISA試 劑盒（Abcam，ab255730）；兔抗Wnt-1、兔抗β-catenin和兔抗GSK-3β（Abcam，ab15251、ab32572和ab32391）；兔 抗CREB、兔抗p-CREB、兔抗ERK和兔抗p-ERK（Abcam，ab32515，ab32096，ab184699和ab76299）。

ZE5 Bio-Rad全能型成像系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）；MK3酶標(biāo)儀（Thermo，USA）；NC12775 Von-Frey纖維絲測(cè)痛儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司，中國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

建模前1天，將SD大鼠置于特制的有機(jī)玻璃箱內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境30 min后，對(duì)大鼠進(jìn)行機(jī)械痛覺測(cè)試，剔除疼痛閾值異常（疼痛閾值過高或過低）的大鼠后分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選出6只大鼠作為對(duì)照組，再將剩余的大鼠進(jìn)行CFA造模，造模成功后，將大鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，組間大鼠體重沒有顯著性差異，具體分組為：模型組、模型+電針組和模型+假電針組。

1.3.2 CFA動(dòng)物模型

根據(jù)文獻(xiàn)方法建立CFA動(dòng)物模型[18]：腹膜內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，給實(shí)驗(yàn)組大鼠左后足皮下注射100 μL完全弗氏佐劑誘發(fā)足底內(nèi)炎癥，對(duì)照組注射100 μL生理鹽水。造模7天后，與未造模組比較，造模組大鼠左后足出現(xiàn)明顯的紅腫，并且活動(dòng)行為明顯減少，則造模成功。

1.3.3 電針（EA）治療

在CFA大鼠模型建立后第8天，對(duì)EA治療組大鼠左后肢足三里（ST36）和陽陵泉（GB34）進(jìn)行電針治療，ST36位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處，GB34位于距ST36上外側(cè)5 mm處，穴位定位標(biāo)準(zhǔn)參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[19]），針灸針置于大鼠肌肉層（2-3 mm），刺激參數(shù)選用疏密波，頻率2/100 HZ，強(qiáng)度0.5-1.5 mA（每10 min增加0.5 mA），每次治療30 min，連續(xù)電針治療7天，每天在同一時(shí)間（上午9∶00-11∶00）進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中4組大鼠均在沒有麻醉的情況下被固定在固定裝置內(nèi)，除電針治療處理外，其余操作完全相同。不同處理為對(duì)照組和模型組不進(jìn)行電針治療，模型組+假電針組針灸針置于大鼠肌肉層（1 mm），但不進(jìn)行通電治療。

1.3.4 大鼠一般情況觀察

觀察大鼠一般情況，包括大鼠的精神狀態(tài)、飲食飲水、步態(tài)和足底紅腫程度。

1.3.5 Up-down法檢測(cè)機(jī)械痛

在實(shí)驗(yàn)前3天取實(shí)驗(yàn)大鼠提前適應(yīng)Up-down法環(huán)境，每次20 min。用VonFrey針刺觸覺測(cè)量套件刺激大鼠左后足，Up-down法檢測(cè)和計(jì)算大鼠機(jī)械痛閾，詳細(xì)步驟為：將大鼠置于鏤空的行為檢測(cè)鋼絲網(wǎng)上適應(yīng)后，然后序貫采用1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0 g的Von Frey細(xì)絲垂直檢測(cè)各組大鼠足底疼痛閾值，若出現(xiàn)縮足、舔足、抬足等行為，則表明該Von Frey細(xì)絲對(duì)應(yīng)規(guī)格為此時(shí)大鼠足底疼痛閾值。檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)在EA治療的前1天（T0）、第1天（T1）、第3天（T3）、第5天（T5）和第7天（T7）記錄大鼠機(jī)械痛變化。

1.3.6 化學(xué)刺激法檢測(cè)冷刺激痛覺超敏反應(yīng)

在檢測(cè)機(jī)械痛30 min后，以0.2 mL丙酮快噴射大鼠左后足，觀察大鼠的應(yīng)激反應(yīng)情況，根據(jù)其對(duì)冷刺激的反應(yīng)進(jìn)行冷刺激評(píng)分，沒有任何反應(yīng)者為0分；輕抬受刺激的后足為1分；反復(fù)劇烈抬、搖晃后足為2分；持續(xù)或反復(fù)撤足并舔爪、搖爪或大叫者為3分[20]。于EA治療的前1天（T0）、第1天（T1）、第3天（T3）、第5天（T5）和第7天（T7）記錄大鼠冷刺激評(píng)分。

1.3.7 ELISA檢測(cè)血清和左后足組織中PGE2、IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)最后1天，在行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后1 h，大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，4℃，5000 r/min離心10 min后取血清；取致炎足足底組織，冰浴研磨，制備組織勻漿，3000 r/min離心15 min，取上清。ELISA法檢測(cè)上清和血清中PGE2、IL-6、TNF-α、IL-1β和BDNF的含量，具體操作參考試劑盒說明書。

1.3.8 Western blot檢測(cè)左后足組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

取大鼠左后足組織，PBS清洗，加裂解液，冰浴研磨，離心后收集上清，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。取25 μg蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，然后進(jìn)行TBST清洗、一抗孵育（Wnt-1，1∶1000；β-catenin，1∶5000；GSK-3β，1∶5000；CREB，1∶1000；p-CREB，1∶5000；ERK，1∶10000；p-ERK，1∶10000）、TBST清洗、二抗孵育（抗兔HRP標(biāo)記的二抗，1∶5000，Santa Cruz Biotechnology）、TBST清洗等常規(guī)Western blot操作步驟，最后加入超敏發(fā)光底物曝光，使用Image J分析蛋白相對(duì)表達(dá)水平，β-actin為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。本實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，對(duì)照組和模型組采用T檢驗(yàn)，模型組、電針組和假電針組三組間采用單因素分析，方差齊性，事后檢驗(yàn)采用Tukey做事后分析，方差不齊，事后檢驗(yàn)采用Dunnett's做事后分析。P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針治療對(duì)慢性炎性疼痛大鼠大體情況的影響

四組大鼠精神狀態(tài)都表現(xiàn)良好，飲食飲水正常。正常組大鼠未發(fā)現(xiàn)明顯異常狀況，其余三組小鼠造模后，均出現(xiàn)患足紅腫、活動(dòng)行為明顯減少，并且活動(dòng)時(shí)有不同程度的拖足表現(xiàn)。

2.2 電針治療對(duì)慢性炎性疼痛大鼠機(jī)械痛閾值與冷痛覺反應(yīng)的影響

結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照組相比，第0天、第1天、第3天、第5天和第7天的模型組小鼠機(jī)械痛閾值均顯著降低（均P〈0.001），冷刺激評(píng)分均顯著升高（均P〈0.001）。EA治療第1天和第3天，與模型組相比，EA治療組大鼠機(jī)械痛閾值有升高趨勢(shì)（均P〉0.05），冷刺激評(píng)分有下降趨勢(shì)（均P〉0.05），但差異不顯著；在EA治療后第5天及第7天，EA治療組大鼠的機(jī)械痛閾值顯著增高（P〈0.01，P〈0.001），冷刺激評(píng)分顯著降低（均P〈0.05）。此外，與模型組相比，假EA治療組大鼠的機(jī)械痛閾值和冷刺激評(píng)分均無顯著改變。

圖1 機(jī)械痛域及冷刺激評(píng)分檢測(cè)結(jié)果（g）（n=6）

2.3 電針治療對(duì)慢性炎性疼痛大鼠血清、左后足組織中炎癥介質(zhì)的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清和左后足組織中的炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6、PGE2、TNF-α和BDNF的表達(dá)水平顯著升高（均P〈0.001）。與模型組相比，EA治療顯著降低了CFA大鼠血清IL-1β（P〈0.05）、IL-6（P〈0.05）、PGE2（P〈0.05）、TNF-α（P〈0.05）和BDNF（P〈0.01）的表達(dá)水平，并下調(diào)了左后足組織中IL-1β（P〈0.01）、IL-6（P〈0.05）、PGE2（P〈0.01）、TNF-α（P〈0.01）和BDNF（P〈0.05）的表達(dá)水平。此外，假EA治療對(duì)CFA大鼠血清和左后足組織中PGE2、IL-6、TNF-α、IL-1β和BDNF的表達(dá)無顯著影響（均P〉0.05）。見表1，表2。

表1 血清中PGE2、IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)（n=6）

表2 左后足組織中PGE2、IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)（n=6）

2.4 電針治療對(duì)對(duì)慢性炎性疼痛大鼠左后足組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠左后足組織中Wnt-1、β-catenin、GSK-3β的蛋白表達(dá)水平均顯著上升（P〈0.001）。與模型組相比，EA治療組大鼠左后足組織中Wnt-1和β-catenin的蛋白表達(dá)水平顯著下降（P〈0.001），GSK-3β蛋白的表達(dá)水平顯著上升（P〈0.001）。此外，假EA治療組與模型組相比，大鼠左后足組織中Wnt-1和β-catenin蛋白顯著下降（P〈0.05，P〈0.01），GSK-3β蛋白顯著上升（P〈0.001）。

圖2 各組大鼠左后足組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路分子的表達(dá)（±s，n=6）

2.5 電針治療對(duì)對(duì)慢性炎性疼痛大鼠左后足組織中ERK/MAPK信號(hào)通路的影響

如圖3所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠左后足組織中CREB和ERK蛋白磷酸化水平均顯著上升（P〈0.001）。與模型組相比，EA治療組大鼠左后足組織中CREB和ERK蛋白磷酸化水平顯著下降（P〈0.001）。此外，假EA治療組與模型組相比，大鼠左后足組織中CREB蛋白磷酸化水平顯著下降（P〈0.05），但ERK蛋白磷酸化水平無明顯差異（P〉0.05）。

圖3 各組大鼠左后足組織中ERK/MAPK信號(hào)通路分子的表達(dá)（±s，n=6）

3 討論

慢性炎癥疼痛是世界上患病率很高的疾病[21]，通常與精神疾病和神經(jīng)發(fā)育疾?。òㄖ囟纫钟舭Y）并存[22]，同時(shí)慢性疼痛常伴發(fā)患者睡眠障礙[23]，嚴(yán)重影響患者身心健康。針刺是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)之一，能治療各種急慢性疼痛[24-26]。左后足皮下注射完全弗氏佐劑是常用的慢性炎性疼痛動(dòng)物模型建模方法[18]。祖國(guó)中醫(yī)學(xué)說認(rèn)為疼痛的病機(jī)是“不通則痛”和“不榮則痛”，因此中醫(yī)以化瘀通絡(luò)止痛及益氣養(yǎng)血止痛兩種為主[27]。中醫(yī)針灸理論認(rèn)為，針刺特定的腧穴、經(jīng)脈，能夠疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和氣血，因而改善氣滯血瘀、經(jīng)脈痹阻所導(dǎo)致的疼痛[27]。陽陵泉（GB34）穴為足少陽之脈所入為合的合上學(xué)，為八會(huì)穴之筋會(huì)，針刺陽陵泉穴可疏肝利膽、舒筋利節(jié)[28]。足三里（ST36）穴屬足陽明胃經(jīng)，為胃經(jīng)合穴，針刺可生化氣血，榮養(yǎng)四肢百骸，梳理上、中、下三焦之氣血[29]。足三里（ST36）和陽陵泉（GB34）是中醫(yī)針刺治療常用的組合穴位，化瘀通絡(luò)，益氣養(yǎng)血。EA基于傳統(tǒng)針灸衍生而來，相比于傳統(tǒng)針灸，EA具有操作簡(jiǎn)便、更加安全的優(yōu)點(diǎn)[30]。沈偉等[31]研究表明電針足三里（ST36）和陽陵泉（GB34）可以緩解CFA模型大鼠的疼痛。本研究表明也表明足三里（ST36）和陽陵泉（GB34）對(duì)CFA模型大鼠有陣痛效果，與沈偉等[31]研究結(jié)果一致，而假EA對(duì)CFA大鼠疼痛無明顯改善。

細(xì)胞因子介導(dǎo)促炎或抗炎反應(yīng)，IL-1β、IL-6、TNF-α是促炎因子的標(biāo)志物[32-33]。PGE2是一種經(jīng)典的炎癥介質(zhì)，在炎癥反應(yīng)中介導(dǎo)疼痛和發(fā)熱[34]。因此炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和炎癥介質(zhì)PGE2的表達(dá)水平一定程度上代表了炎癥反應(yīng)程度。而BDNF通過中樞敏化調(diào)節(jié)慢性疼痛的發(fā)展[35]。本研究表明，EA治療結(jié)束后血清和左后足組織中炎癥因子PGE2、IL-6、TNF-α、IL-1β和BDNF表達(dá)也顯著下降，這些表明電針治療能顯著改善CFA大鼠炎癥反應(yīng)和疼痛反應(yīng)。此外，假EA對(duì)CFA大鼠炎癥反應(yīng)無顯著改變。

慢性炎癥痛的發(fā)生機(jī)制尚不明確，目前較為認(rèn)可的是炎癥機(jī)制[18,36]。張媛媛等[37]發(fā)現(xiàn)EA可能通過抑制大鼠關(guān)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路下調(diào)MMP-13的表達(dá)，降低促炎因子IL-1β的釋放，改善膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變。有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)EA通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與脊髓損傷的組織修復(fù)過程[38-39]。因此，Wnt/β-catenin信號(hào)通路被認(rèn)為是EA治療作用的炎性通路之一。研究表明GSK-3β與Axin、APC、CK1形成的復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)使β-catenin磷酸化而降解，而Wnt蛋白能與Fzd、LRP5/6結(jié)合，募集Dvl，阻止GSK-3β與Axin、APC、CK1復(fù)合物的形成，從而阻止β-catenin磷酸化，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中累積造成炎癥反應(yīng)[40]，因此提高GSK-3β的表達(dá)有利于抑制β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中累積造成的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，EA抑制了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化，提高了GSK-3β的表達(dá)，提示EA作用機(jī)制與GSK-3β促進(jìn)β-catenin磷酸化有關(guān)。令人意外的是，在CFA模型組大鼠中GSK-3β的表達(dá)水平顯著上升。研究表明，動(dòng)物機(jī)體組織都具有自我修復(fù)的功能[41-42]，而肌肉是一種具有強(qiáng)大的自我修復(fù)功能的組織，當(dāng)受到輕微損傷時(shí)肌肉組織可以自我修復(fù)[43]，因此我們推測(cè)這是CFA大鼠機(jī)體自我修復(fù)的結(jié)果，而EA促進(jìn)了CFA大鼠機(jī)體的自我修復(fù)，但EA促進(jìn)CFA自我修復(fù)的作用機(jī)制仍進(jìn)一步研究。

CREB和ERK蛋白都與各種類型的疼痛傳遞有關(guān)。外周神經(jīng)損傷會(huì)引起神經(jīng)性疼痛和背根神經(jīng)節(jié)（DRG）和背角中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員的磷酸化。神經(jīng)損傷后，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）（MAPK家族的重要成員）的磷酸化在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和背角星形膠質(zhì)細(xì)胞中依次增加[44]。神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的ERK磷酸化（p-ERK）發(fā)生較早且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，并且發(fā)生在多種神經(jīng)性疼痛動(dòng)物模型中，例如，當(dāng)受到傷害性疼痛刺激時(shí)，背根神經(jīng)節(jié)和脊髓中的CREB和ERK蛋白表達(dá)升高[12]。此外，CREB和ERK蛋白在神經(jīng)性疼痛模型、糖尿病神經(jīng)病變模型或辣椒素誘導(dǎo)疼痛模型中，表達(dá)也會(huì)升高[12]。研究表明，抑制ERK激活的MEK抑制劑可在不同時(shí)間點(diǎn)有效緩解疼痛[13,45-46]。然而，在CFA動(dòng)物模型中，CREB和ERK蛋白在慢性疼痛中的可能作用尚不清楚。本研究表明，CREB和ERK蛋白磷酸化水平在CFA疼痛組織中升高，EA電針抑制了CREB和ERK蛋白的磷酸化，表明EA治療CFA與其抑制ERK/MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

此外，我們發(fā)現(xiàn)假電針抑制了Wnt和β-catenin的蛋白表達(dá)，并且降低了CREB蛋白磷酸化水平，但ERK蛋白磷酸化水平無明顯差異。有趣的是，假電針治療7天后對(duì)大鼠疼痛和炎癥反應(yīng)并無明顯改善，這有可能是因?yàn)榧匐娽樛瑯哟碳ち俗闳铮⊿T36）和陽陵泉（GB34）兩個(gè)穴位，改善了Wnt/β-catenin信號(hào)通路和ERK/MAPK信號(hào)通路，對(duì)CFA有治療作用，但是其對(duì)CFA的治療效果較慢，在治療7天后無法達(dá)到明顯改善CFA疼痛的效果。同時(shí)，這也說明電針介入的時(shí)間點(diǎn)很可能對(duì)慢性炎性疼痛療效有影響，然而，其具體影響機(jī)制還需進(jìn)一步證明。

總而言之，本研究表明，EA顯著改善了大鼠慢性炎性疼痛，其機(jī)制可能與EA抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路以及ERK/MAPK信號(hào)通路有關(guān)。