李鎮(zhèn)希, 李文婷, 黃家權, 鄭正, 許美容, 鄧曉玲

膜吸附法結合可視化環(huán)介導等溫擴增技術檢測柑橘黃龍病菌

李鎮(zhèn)希, 李文婷, 黃家權, 鄭正, 許美容, 鄧曉玲

華南農業(yè)大學植物保護學院，廣州 510642

柑橘黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是由候選韌皮部桿菌亞洲種（‘Liberibacter asiaticus’，CLas）侵染引起的一種柑橘病害。對于該病害的防治主要采取綜合措施，包括實施檢疫、種植無病苗木、及時挖除病樹和集中大面積聯防聯控柑橘木虱等。前3種方法都需要依靠準確的柑橘黃龍病診斷技術。【】利用環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification, LAMP），結合膜吸附法DNA快速提取和Gelgreen熒光染料可視化，建立黃龍病田間核酸快速檢測方法。以黃龍病菌-操縱子與原噬菌體DNA聚合酶基因為模板設計LAMP特異性引物，包括外引物F3/B3、內引物FIP/BIP、環(huán)引物LoopF/LoopB和莖引物StemF/StemB。通過對環(huán)引物和莖引物設定不同的用量組合，對LAMP引物體系進行優(yōu)化，確定合適的引物濃度。用優(yōu)化后的LAMP引物體系對188份田間柑橘葉片進行檢測，并構建受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析實時熒光LAMP（qLAMP）在CLas檢測上的準確性。對qLAMP預混反應液進行兩步的常溫干燥，分別設定不同的存放條件，評估LAMP常溫干燥試劑的穩(wěn)定性。用本研究建立的CLas可視化LAMP快速檢測方法，對田間71個柑橘葉片樣品和35個柑橘果實樣品進行檢測，與實時熒光定量PCR（qPCR）比較兩者的符合率。在LAMP體系中加入環(huán)引物、莖引物或增加其濃度都能促進反應速率的提升，并且同時加入終濃度均為1.6 μmol·L-1的環(huán)引物和莖引物能進一步提高LAMP反應速率。LAMP預混液通過兩步法干燥在不同溫度存放1—4周均能保持反應活性基本不變，表明制備的兩步法干燥LAMP試劑檢測性能較好，在低溫和常溫環(huán)境下的穩(wěn)定性尚可，僅35℃高溫存放會略微增加LAMP試劑的反應時間。使用孔徑0.1 μm尼龍膜代替纖維素濾紙作為核酸吸附材料能提升CLas快速診斷技術的靈敏度。結合DNA快速提取和可視化LAMP建立的CLas快速核酸診斷方法最低能檢測到濃度為102copies/μL的重組質粒樣品，總體準確率高。經配對卡方檢驗，該方法的診斷結果與qPCR無顯著差異。可視化LAMP快速檢測相較常規(guī)檢測有著更低的成本和耗時，而且可視化LAMP快速檢測無需離心機和PCR儀等昂貴的儀器，僅需一臺65℃恒溫設備即可。建立的CLas快速核酸檢測方法成本低，30 min即可觀察到檢測結果，操作簡便，準確性高，可替代qPCR在田間進行黃龍病的快速鑒定。

柑橘黃龍??；候選韌皮部桿菌亞洲種；田間檢測；膜吸附法；DNA快速提?。豢梢暬h(huán)介導等溫擴增技術

0 引言

【研究意義】柑橘黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是由候選韌皮部桿菌亞洲種（‘Liberibacter asiaticus’，CLas）侵染引起的柑橘病害，在田間主要通過帶病苗木和帶菌的柑橘木虱（）進行傳播，是柑橘生產上的一種毀滅性病害。目前尚未有有效的藥劑可以治療柑橘黃龍病，對于該病害的防治主要采取綜合的措施，包括實施檢疫、種植無病苗木、及時挖除病樹和集中大面積聯防聯控柑橘木虱等，前3種方法都需要依靠準確的柑橘黃龍病診斷技術。另外，密切了解果園中柑橘黃龍病的發(fā)病情況是防治的首要條件之一，通常果農會將疑似黃龍病的柑橘枝條交由專業(yè)的研究所或高校檢測，但往往需要較高的檢測成本和較長的檢測時間。因此，建立黃龍病菌的田間快速檢測技術對黃龍病的防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】田間診斷法被最早應用于癥狀鑒別，人們通過觀察田間柑橘植株是否具有典型的黃龍病癥狀，來判斷該植株是否感染黃龍病菌。在發(fā)病初期，柑橘植株通常表現為黃梢，病葉會出現斑駁型黃化或缺鋅狀黃化[1]。但葉片的癥狀受營養(yǎng)條件、氣候環(huán)境和生長時期等多種因素影響，單從葉片癥狀就鑒定柑橘植株是否感染黃龍病菌并不可靠[2]。實時熒光定量PCR（qPCR）利用了DNA指數擴增期間的相對熒光強度變化來實時分析目的基因的拷貝數變化趨勢，具有操作簡便、快速和高靈敏度的特點；其次，在封閉的體系中完成擴增并進行實時測定，大大降低了氣溶膠污染的可能性[3]。2004年，我國首次建立柑橘黃龍病菌qPCR檢測體系[4]。2000年，Notomi等[5]發(fā)明了一種新的DNA擴增方法——環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），根據目標基因的6個特異性序列設計兩對引物，在具有強烈的鏈置換活性的DNA聚合酶參與下，可以使DNA無需熱變性過程就能大量擴增，降低了對設備的要求；2005年，Okuda等[6]首次根據黃龍病菌KJAL-B操縱子序列設計引物，建立了一種檢測黃龍病菌的LAMP方法。之后，利用LAMP技術診斷柑橘黃龍病的研究逐漸增多[7-17]，但是將目前的研究應用到黃龍病田間診斷仍有一定的局限性，例如引物靶標設計在種間差異較大的原噬菌體短串聯重復區(qū)域[7]，引物間形成二級結構造成假陽性[9]，對操作人員的技術要求較高，試劑需要在低溫下運輸儲存和診斷耗時較長等。而Keremane等[12]利用便攜式的實時熒光恒溫儀快速檢測柑橘木虱體內黃龍病菌的-操縱子與原噬菌體DNA聚合酶基因保守序列獲得較好的效果，但對于植物樣本快速檢測的研究仍然較少[9,18]?！颈狙芯壳腥朦c】基礎的兩對引物LAMP反應速率較慢，通常需要反應60 min以上[13-17]，檢測耗時長，本研究通過設計和加入環(huán)引物和莖引物來加快反應速率。實驗室常用的DNA提取試劑盒和LAMP試劑盒難以在田間使用，迫切需要操作和使用簡易的DNA提取技術和LAMP試劑?！緮M解決的關鍵問題】利用LAMP常溫干燥試劑，結合膜吸附法DNA快速提取技術，建立CLas田間核酸快速鑒定技術，為后續(xù)CLas田間檢測試劑盒的開發(fā)提供理論基礎和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 柑橘葉片采集：2018年9月至2020年9月，從廣東省惠州博羅楊村、梅州、肇慶、廣州從化等不同地區(qū)的果園和華南農業(yè)大學長崗山網室采集疑似感染黃龍病和健康的不同柑橘品種葉片，柑橘品種包括砂糖橘（cv. Shatangju）、尤力克檸檬（）、沙田柚（cv. Shatian Yu）、紅心蜜柚（cv. Guangximiyou）、年橘（cv. NianJu）、貢柑（var. Gonggan）、甜橙（）、紅橘（cv. Tangerina）、沃柑（var. Orah）。

柑橘果實采集：2019年7月，從廣東省惠州博羅楊村果園和廣州從化柑橘果園分別采集疑似感染黃龍病和健康枝條上的砂糖橘和沃柑果實。

采集葉片和果實時盡量保證材料不受損傷，把樣品放入保鮮塑料封口袋中，用濕紙巾包好進行保濕保鮮。樣品從田間采回實驗室后，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 E.Z.N.A.? HP Plant DNA Kit（200）試劑盒購自OMEGA BIO-TEK公司；2.0 WarmStart?DNA Polymerase、10×Isothermal Amplification Buffer、100 mmol·L-1MgSO4Solution購自紐英倫生物技術（北京）有限公司；EveGreen（20×水溶液）購自上海翊圣生物有限公司；SuperGreen/GelGreen核酸染料（10 000×水溶液）購自蘭杰柯科技有限公司；TMGreen qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CLas DNA的常規(guī)提取 采用OMEGA BIO- TEK公司的E.Z.N.A.? HP Plant DNA Kit試劑盒，稱取柑橘葉片葉中脈或果實橘絡約0.1 g，參考試劑盒說明書提取樣品不同部位的柑橘總DNA。

1.2.2 CLas DNA的膜吸附法提取 具體提取步驟如下：（1）吸附核酸的膜材料圓盤制備：使用打孔器制備直徑為3 mm的纖維素濾紙或尼龍膜（孔徑0.1 μm）小圓盤若干，用于核酸的吸附。（2）柑橘組織裂解液的配制：裂解液包含20 mmol·L-1Tris（pH 8.0）、25 mmol·L-1NaCl、2.5 mmol·L-1Na2EDTA、0.05% SDS、3% PVP和2% DTT。（3）膜材料漂洗液的配制：漂洗液包括75%乙醇溶液和吐溫緩沖液。吐溫緩沖液包含10 mmol·L-1Tris（pH 8.0）和0.1%吐溫-20；（4）DNA的提取：在處理不同的樣品和部位前，均用工業(yè)酒精對剪刀、刀片和鑷子進行消毒。用剪刀剪取葉片中脈組織。將果實的果皮撥剝開，用鑷子從囊壁和果皮上小心撕出橘絡。每個樣品的不同部位各稱取約0.01 g植物組織，置于1.5 mL的離心管中，并加入50 μL柑橘組織裂解液，用一次性研磨棒研磨30 s。將核酸吸附材料圓盤浸入柑橘組織裂解液中至少3 s，然后轉移到200 μL的75%乙醇溶液和吐溫緩沖液中先后洗滌至少3 s。最后將圓盤轉移至配制好的反應體系中進行DNA擴增或浸泡在TE緩沖液中洗脫獲得DNA粗提取物。

1.2.3 CLas的實時熒光PCR檢測 參考Zheng等[19]使用RNRf/RNRr引物檢測CLas的方法，采用PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix試劑盒進行實時熒光PCR檢測，具體操作步驟參考試劑盒說明書。

1.2.4 實時熒光/可視化LAMP的引物設計和CLas檢測 從Genbank數據庫上獲取CLas菌株A4（CP010804）的全基因組序列，根據LAMP引物設計要求，以基因簇B-E-G-KAJL-B與原噬菌體DNA聚合酶基因作為靶基因擬定各LAMP引物序列，通過引物設計軟件Oligo 7分析各引物之間的二聚體發(fā)生情況，確定本研究的LAMP引物，引物序列見表1。

表1 柑橘黃龍病菌LAMP檢測引物序列

實時熒光LAMP（qLAMP）反應體系包含F3/B3引物各0.4 μmol·L-1，FIP/BIP引物各1.6 μmol·L-1，LoopF/LoopB和StemF/StemB各0.4—1.6 μmol·L-1，1×Isothermal Amplification Buffer，MgSO46 μmol·L-1，dNTPs 1.4 μmol·L-1，2.0 DNA Polymerase 0.32 U·μL-1，1×Evegreen，DNA模板1 μL，其余補充ddH2O至10 μL。將以上混合體系置于CFX ConnectTMqPCR檢測系統(tǒng)上進行擴增，反應溫度為65℃，反應時間為30 min，每分鐘采集一次熒光強度信號。

1.2.5 實時熒光/可視化LAMP常溫干燥試劑的制備和田間應用 LAMP反應干燥試劑的制備方法參考Diego等[20]的方法稍作改良。具體操作如下：將1.36 μL引物和0.224 μL海藻糖（2 mol·L-1）混勻置入0.2 mL離心管底部，于真空濃縮儀以V-AQ模式常溫干燥30 min。然后，將1.4 μL dNTPs、0.4 μL聚合酶和0.6 μL海藻糖（2 mol·L-1）混勻加至沉淀底部，可視化LAMP需要將1 μL 800×Gelgreen核酸熒光染料加到離心管管蓋上，以相同模式室溫干燥15 min。在進行LAMP反應前，往LAMP干燥試劑加入1 μL 10×LAMP Buffer、0.6 μL MgSO4（100 mmol·L-1）和1 μL DNA模板，qLAMP則需要加入0.5 μL Evegreen，最后補充去離子水使最終體積為10 μL，并且加入10 μL液體石蠟防止LAMP反應液蒸發(fā)。

將干燥LAMP試劑分別保存在常溫環(huán)境（25℃）、低溫環(huán)境（4℃）和高溫環(huán)境（35℃）中，分別于干燥第1周、第2周和第4周復溶后進行qLAMP擴增檢測，并設置未干燥的新鮮配制qLAMP試劑為對照組。通過可視化LAMP快速檢測技術檢測106個柑橘田間樣品，與常規(guī)檢測方法比較，使用Microsoft Excel軟件對不同干燥方法和存放條件的Tt值進行線性擬合比較不同處理對qLAMP的影響。以常規(guī)提取檢測方法作為金標準，統(tǒng)計不同樣本通過膜吸附法結合可視化LAMP快速檢測的準確率。使用MedCalc 19軟件進行ROC曲線分析膜吸附法結合可視化LAMP快速檢測的敏感性和特異性。使用IBM SPSS 26軟件對快速檢測和常規(guī)檢測的結果進行配對表格的McNemar檢驗和Kappa檢驗。

2 結果

2.1 CLas LAMP檢測引物的設計和評價

CLas LAMP檢測引物A3的引物設計如圖1所示，其中CLas-F1c和CLas-StemF之間，CLas-B1c、CLas-LoopB和CLas-StemB之間有部分序列重疊。靶序列長度為189 bp，引物經過在線BLAST軟件比對到NCBI基因組數據庫中的CLas全基因組上，未發(fā)現存在SNP。各引物之間通過引物設計軟件Oligo 7分析，未預測到影響較大的引物二聚體。

圖1 LAMP引物與黃龍病菌菌株A4基因組比對示意圖

進行qLAMP后，熔解曲線呈單峰，擴增曲線呈典型的S型動力學曲線，指數期和平臺期明顯，為理想的熔解曲線和擴增曲線，如圖2所示。

2.2 CLas LAMP檢測引物體系的優(yōu)化

通過在LAMP反應體系中加入不同濃度的環(huán)引物和莖引物，比較qLAMP在不同反應條件下的Tt值，繪制Tt值隨目的片段重組質粒濃度對數值變化的標準曲線，篩選環(huán)引物和莖引物的最佳濃度，結果如圖3所示。單獨加入0.4 μmol·L-1莖引物的LAMP反應擴增效率最低，反應所需時間較長。其余反應條件均有接近的擴增效率，隨著環(huán)引物濃度增加，反應所需時間縮短，但濃度高于1.6 μmol·L-1時提升不明顯。當環(huán)引物和莖引物的總濃度在1.6 μmol·L-1以上時，環(huán)引物和莖引物等濃度加入反應體系中對反應速率的提升要高于單獨添加環(huán)引物。

以RNRf/RNRr-qPCR結果作為金標準，當Ct值小于32時判定為陽性，評價A3-qLAMP診斷CLas的準確性。通過ROC曲線分析，ROC曲線下面積為0.995（圖4），qLAMP的最佳診斷Tt值為8.03，敏感性為100%，特異性為96.24%，說明qLAMP檢測CLas的效果良好。

圖2 polA3-qLAMP的擴增曲線和熔解曲線

圖3 不同環(huán)引物和莖引物濃度下qLAMP的標準曲線

圖4 qLAMP診斷黃龍病菌的ROC曲線

兩種檢測方法診斷黃龍病結果的配對四格表如表2所示，qLAMP在最佳診斷Tt值下和qPCR的診斷結果一致性優(yōu)良（Kappa=0.937，＜0.001）；qLAMP的真陽性率為91.67%，真陰性率為100%，總體準確率為97.34%。經McNemar檢驗，兩種檢測方法診斷結果無顯著差異（＞0.05），表明在田間檢測中可用qLAMP代替qPCR鑒定柑橘黃龍病。

表2 RNRf/RNRr-qPCR與qLAMP診斷黃龍病結果

2.3 LAMP檢測試劑的常溫干燥

通過兩步法干燥的qLAMP試劑與液態(tài)未干燥qLAMP試劑（對照試劑）的檢測效果，評價常溫干燥試劑的生物活性。Gelgreen核酸熒光染料常溫干燥后攤平黏附在管蓋內，呈橙紅色蠟質固體；LAMP預混液常溫干燥后聚集于管底，呈半透明膠狀固體。用于干燥LAMP試劑復溶的溶液中含有與對照試劑相同濃度的模板。與液態(tài)未干燥qLAMP試劑相比，經過干燥程序的常溫干燥試劑生物活性有所下降，但常溫干燥試劑在3個存放溫度條件之間，擴增效率均沒有發(fā)生明顯變化，只有存放在高溫環(huán)境中的干燥試劑隨存放時間增加，相同濃度模板下的Tt值有所上升，擴增標準曲線見圖5。

A：在4℃存放 Stored at 4℃；B：在25℃存放 Stored at 25℃；C：在35℃存放 Stored at 35℃

用兩步法干燥LAMP試劑和相同模板進行Gelgreen可視化LAMP檢測，比較干燥LAMP試劑在不同溫度存放條件下的靈敏度。如圖6所示，常溫和高溫環(huán)境下存放1周的靈敏度為102copies/μL，隨存放時間增加，常溫環(huán)境下的靈敏度沒有變化，而高溫環(huán)境下的靈敏度從第2周開始下降為103copies/μL，低溫環(huán)境下存放1周的靈敏度為101copies/μL，在第4周下降為102copies/μL。

利用Gelgreen-可視化LAMP比較纖維素濾紙和尼龍膜（孔徑0.1 μm）快速提取DNA的效果，結果如圖7所示。以纖維素濾紙作為核酸吸附材料時，Gelgreen-可視化LAMP的靈敏度為103copies/μL，而且陰性管中的纖維素濾紙在紫外燈下也發(fā)出微弱的熒光；以尼龍膜（孔徑0.1 μm）作為核酸吸附材料時，Gelgreen-可視化LAMP的靈敏度為102copies/μL。

2.4 膜吸附法結合可視化LAMP快速檢測田間樣品

采用膜吸附法結合可視化LAMP快速檢測田間71個柑橘葉片樣品和35個柑橘果實樣品，驗證黃龍病可視化LAMP檢測（快速檢測）的可行性，以DNA試劑盒法提取和RNRf/RNRr-qPCR（常規(guī)檢測）作為對照，當Ct值小于32時判斷為陽性。部分葉片檢測結果如圖8所示，快速檢測能有效檢出不同柑橘品種和癥狀葉片中的CLas，其中斑駁型黃化葉片的檢測結果均為陽性，“綠島”、缺素型黃化葉片的檢測結果既有陽性也有陰性，對少數無明顯癥狀的葉片也能檢測出陽性結果。

同一存放條件的8個管依次加入了不同拷貝數的黃龍病菌LAMP陽性質粒（分別為107、106、105、104、103、102、101、100 copies/μL）

A：纖維素濾紙 Cellulose filter paper；B：尼龍膜 Nylon membrane。從左往右依次從含有濃度為105、104、103、102、101、100、0 copies/μL CLas β-操縱子重組質粒的植物組織液中快速提取核酸 Nucleic acids were rapidly extracted from plant tissue extract containing CLas β-operon recombinant plasmids with concentrations of 105, 104, 103, 102, 101, 100, 0 copies/μL, respectively

快速檢測方法和實驗室常規(guī)檢測方法診斷黃龍病結果的配對四格表如表3所示，快速檢測和常規(guī)檢測診斷結果一致性較好（Kappa=0.867，＜0.001）；快速核酸檢測方法的真陽性率為98.18%，真陰性率為88.24%，總體準確率為93.40%。經McNemar檢驗，兩種檢測方法診斷結果無顯著差異（＞0.05）。

表3 可視化LAMP快速檢測與常規(guī)檢測診斷黃龍病結果

N/A：未產生Ct值/未確定No Ct value or undetermined

葉片樣品共計71個，其中快速檢測結果與常規(guī)檢測結果一致的樣品有65個，符合率為91.55%；有一個樣品的快速檢測結果為陽性而常規(guī)檢測結果為陰性，假陽性率為1.41%；有5個樣品的快速檢測結果為陰性而常規(guī)檢測為陽性，假陰性率為7.04%。其中顯癥葉片35個，無明顯癥狀葉片36個，快速檢測結果與常規(guī)檢測結果一致的樣品分別有33和32個，符合率分別為94.29%和88.89%，假陽性率分別為0%（0/35）和2.78%（1/36），假陰性率分別為5.71%（2/35）和8.33%（3/36）。果實樣品共計35個，其中快速檢測結果與常規(guī)檢測結果一致的樣品有34個，符合率為97.14%；果實樣品的快速檢測沒有假陽性，但有一個樣品出現假陰性，占所有樣品的2.86%。

膜吸附法結合可視化LAMP快速檢測每個樣品的耗材成本和耗時相比于DNA試劑盒法提取和qPCR檢測（常規(guī)檢測）都大幅度降低，其中，快速檢測的成本降低了85%，而耗時縮短了69%，具體信息如表4所示。

表4 柑橘黃龍病常規(guī)檢測與可視化LAMP快速檢測的耗材成本（元/樣本）與步驟耗時（分鐘/樣本）比較

*各試劑耗材成本的價格參考銳競科研采購平臺（https://www.rjmart.cn/）在2021年3月的數據所得

*The prices of the consumables are based on data from the Reagent Procurement Platform (https://www.rjmart.cn/) in March 2021

3 討論

3.1 環(huán)引物與莖引物/群引物聯用顯著提升LAMP擴增效率

常規(guī)的四引物LAMP由于反應時間較長，目前研究者更青睞于設計環(huán)引物、莖引物或者是群引物加快反應速率[21-23]。通常情況下，F2和B2在目的片段上的距離應在120—160 bp，但在該條件下會造成F1和B1的距離過短，難以在F1和B1之間設計莖引物[24]。因此，本研究通過將StemF和F1c共用部分序列，LoopB、B1c和StemB共用部分序列，這些共用部分序列的引物有著相同的延伸方向，理論上不會發(fā)生交叉反應，繞開了環(huán)引物和莖引物設計在空間不足上的限制。從圖1可以看出，在靶序列F1和B1區(qū)域之間僅有9 bp的距離下設計了共33 bp的莖引物，根據莖引物（結合在F1和B1之間的“莖”上）和群引物（結合在F1、B1上或者附近）的定義[22-23]，本研究的莖引物在定義上更接近為群引物，兩者的關系有待進一步研究。Khorosheva等[25]通過數字單分子LAMP進行引物設計優(yōu)化，發(fā)現加入環(huán)引物能提高LAMP的靈敏度，而LAMP的反應速率與靈敏度之間沒有顯著的相關性。本研究發(fā)現，加入環(huán)引物、莖引物以及增加其濃度均能促進反應速率的提升，但反應速率的提升并不能帶來較大的靈敏度提升。另一方面，環(huán)引物對反應速率的提升會隨著自身濃度的升高而縮小，而莖引物對反應速率的提升不如環(huán)引物，但在自身濃度較高的情況下繼續(xù)增加濃度依然能提高一定的反應速率，與Martineau等[23]的結論比較吻合，說明在低引物濃度下，環(huán)引物濃度的影響更大；而高引物濃度下，莖引物濃度的影響更大。雖然Qian等[9]在進行可視化LAMP檢測時由于高濃度高長度引物形成二級結構，在常溫下出現強烈的背景信號，但在本研究中，即使加入了高濃度的環(huán)引物和莖引物，紫外燈下的陰性管也未見有熒光信號，說明高濃度高長度的引物不是導致有二級結構的原因，應該在引物設計時就避免引物二聚體或“發(fā)卡”結構的出現。

3.2 DNA提取是制約可視化LAMP準確性的關鍵步驟

總體來看，膜吸附法的DNA得率較低和DNA聚合酶抑制劑殘留是造成黃龍病快速診斷出現假陰性的主要原因。由于黃龍病菌寄生在韌皮部組織中[26]，要獲取黃龍病菌的DNA需要將植物和細菌的細胞壁、細胞膜都徹底裂解，而膜吸附法中省略了65℃恒溫孵育的步驟，對細胞壁和細胞膜的裂解不夠徹底，使得DNA的提取效率較低。本研究后續(xù)可以進一步探討尼龍膜的不同孔徑對PCR或LAMP反應的影響，開發(fā)DNA吸附或提取效果更好的膜材料；嘗試提高PCR或LAMP反應體系的體積，從而相對減少核酸吸附膜材料本身和提取試劑殘留對DNA聚合酶活性的影響。Gelgreen可視化LAMP結合膜吸附法的靈敏度稍低于結合常規(guī)提取，為102copies/μL，但基本滿足田間檢測的需要。后續(xù)可以通過設計引物變體來進行檢出限測定，進一步提高引物A3的靈敏度，或者基于黃龍病菌基因組的、和等高拷貝數基因設計引物[19,27]。

3.3 兩步法干燥有效提升LAMP試劑穩(wěn)定性

Hayashida等[28]使用兩步法干燥和羥基溴酚藍（HNB）、Evagreen雙指示劑法，先將指示劑、引物和海藻糖混合放置在管蓋干燥，再將dNTPs、聚合酶和海藻糖混合放置在管底干燥，做成LAMP干燥試劑用于人類非洲錐蟲病的快速檢測；Diego等[20]使用一步法干燥LAMP反應試劑，發(fā)現一步法干燥試劑在室溫存放1個月后完全喪失了反應活性。本研究結果表明，兩步法干燥的LAMP試劑在不同溫度存放1—4周均能保持反應活性基本不變，說明干燥LAMP試劑檢測性能較好，在低溫和常溫環(huán)境下的穩(wěn)定性尚可，僅35℃高溫存放會略微增加LAMP試劑的反應時間。本研究通過真空濃縮儀獲得的干燥試劑外觀為黏附在管底的透明膠狀沉淀，而張建中[29]通過冷凍干燥器制備的PCR凍干試劑呈白色光滑小球，擴增效率與未干燥的PCR反應體系相比基本一致，說明凍干試劑沒有受到干燥過程的影響，但是冷凍干燥的制備復雜，儀器成本高，較難推廣應用于田間檢測。

3.4 LAMP快速檢測橘絡組織有更高的準確率

受限于膜吸附法提取技術存在DNA損失和DNA聚合酶抑制劑殘留的問題，可視化LAMP快速檢測柑橘葉片診斷黃龍病會有較大的假陰性率（7.04%），但對于柑橘果實則有較高的準確率（97.14%），這是因為本試驗所用到的柑橘果實主要從表現黃龍病相關癥狀的枝條上采摘，在同一感染黃龍病的帶果枝條上，果實橘絡中的黃龍病菌濃度往往高于其他部位，其濃度可達葉中脈的26倍，果實橘絡也被認為具有富集黃龍病菌的作用[30-31]。另外，果實橘絡的木質化程度低于葉中脈，組織纖細柔軟，便于研磨，使植物細胞裂解更加充分。因此，筆者建議采用果實橘絡作為可視化LAMP快速檢測的DNA提取部位，避免發(fā)生葉中脈中的黃龍病菌濃度或DNA得率較低而出現假陰性的情況。

3.5 膜吸附法結合可視化LAMP有較大的田間應用潛力

由表4可知，可視化LAMP快速檢測相較常規(guī)檢測有著更低的成本和更短的耗時；其次，可視化LAMP快速檢測的DNA提取和DNA擴增步驟無需離心機和PCR儀等昂貴的儀器，DNA擴增步驟僅需一臺65℃恒溫設備即可進行；最后，LAMP預混液的干燥延長了試劑在常溫下的穩(wěn)定性，在減少運輸和儲存成本的同時，也減少了實驗操作步驟及其帶來的交叉污染問題。因此，可視化LAMP快速檢測技術非常適合在基礎設施較落后的地區(qū)進行黃龍病田間檢測。

4 結論

應用膜吸附法結合可視化LAMP建立的柑橘黃龍病快速鑒定技術具有操作簡單快捷、靈敏度高等優(yōu)點，在柑橘黃龍病的田間快速診斷中發(fā)揮作用，可為柑橘黃龍病菌檢測試劑盒的開發(fā)提供技術支持。

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Detection of ‘Liberibacter asiaticus’ by membrane adsorption method combined with visual loop-mediated isothermal amplification

LI ZhenXi, LI WenTing, HUANG JiaQuan, ZHENG Zheng, XU MeiRong, DENG XiaoLing

College of Plant Protection, South China Agricultural University, Guangzhou 510642

【】Citrus Huanglongbing (HLB) is a citrus disease caused by ‘Liberibacter asiaticus’ (CLas). The main approaches to control HLB include plant quarantine, establishing disease-free nurseries, removing disease trees, and concentrating on large area joint control of citrus psyllids (). The first three methods all rely on accurate HLB diagnosis techniques.【】The objective of this study is to establishment of a rapid and handy field/laboratory nucleic acid detection method of CLas using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) combined with membrane adsorption rapid DNA extraction and Gelgreen fluorescence dye visualization.【】The LAMP primers were designed using the-operon and the prophage DNA polymerase gene of CLas as templates, including outer primer F3/B3, inner primer FIP/BIP, loop primer LoopF/LoopB and stem primer StemF/StemB. The LAMP primer set was optimized by setting different dosage combinations for loop primers and stem primers to determine the appropriate primer concentration. A total of 188 field citrus leaves were detected using the optimized LAMP primer set, and the receiver operating characteristic (ROC) curves were constructed to analyze the accuracy of real-time fluorescent LAMP (qLAMP) for CLas detection. The qLAMP premixed reaction solution was dried in two steps at room temperature, storage temperature (4, 25 and 35℃) and storage time (1, 2 and 4 weeks) were also set to assess the enzyme activity stability of the dry LAMP reagent. Using dry LAMP reagent, combined with membrane adsorption rapid DNA extraction technique in this study, 71 citrus leaf samples and 35 citrus fruit samples collected in the field were detected, while the detection results of real-time fluorescent quantitative (qPCR) were used as controls to compare the coincidence rates of the two detection methods.【】The addition of loop primer, stem primer or increasing their concentrations in LAMP reaction could promote the increase of reaction rate, and the addition of both loop primer and stem primer at a final concentration of 1.6 μmol·L-1could further improve the reaction rate. The reaction activity of LAMP premix could be maintained unchanged by two-step drying at different temperatures for 1-4 weeks, indicating that the two-step drying LAMP reagent prepared in this experiment had good detection performance and fair stability at low and room temperatures, and only at 35℃ storage would slightly increase the reaction time of LAMP reagent. Using 0.1 μm pore size nylon membrane instead of cellulose filter paper as nucleic acid adsorption material could improve the sensitivity of rapid diagnostic techniques. The overall accuracy of rapid DNA diagnosis for HLB established by combining rapid DNA extraction and visual LAMP was high, and the lowest detectable plasmid concentration was 102copies/μL. The diagnostic results of this method were not significantly different from those of qPCR by paired Chi-square test. Thevisual LAMP rapid detection was less cost and time-consuming than routine detection, and visual LAMP rapid detection required no expensive instruments such as centrifuges and PCR instruments, requiring only a 65℃ thermostatic device.【】The rapid DNA detection method for CLas established in this study has low cost and can observe detection results in 30 min, easy to operate and high accuracy, which can replace qPCR for rapid identification of HLB in the field.

citrus Huanglongbing; ‘Liberibacter asiaticus’ (CLas); field detection; membrane adsorption; rapid DNA extraction; visual LAMP

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.01.007

2021-06-03；

2021-07-06

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD0201500）、廣西創(chuàng)新驅動發(fā)展專項（桂科AA18118046）、廣東省重點領域研發(fā)計劃（2019B020217003）

李鎮(zhèn)希，E-mail：554706824@qq.com。通信作者鄧曉玲，E-mail：xldeng@scau.edu.cn

（責任編輯 岳梅）