杜金婷，張雁，李雁，王佳佳，廖娜，鐘立煌，駱碧群，林江

超聲耦合雙水相體系提取茶皂素的工藝優(yōu)化與機(jī)制探討

1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510610；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣州 510640；3廣東星匯生物科技有限公司，廣東龍川 517323

【】茶皂素是一種具有廣闊應(yīng)用前景的天然活性物質(zhì)，純度是限制其應(yīng)用和價(jià)值的關(guān)鍵因素。探究超聲耦合雙水相提?。║ltrasound-assisted two-phase aqueous extraction, UAATPE）油茶粕茶皂素的工藝條件及其提取機(jī)制，以開發(fā)純度高且高效的提取技術(shù)，為油茶粕高值化利用提供技術(shù)指導(dǎo)。以油茶粕為原料，在單因素基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選影響得率的關(guān)鍵因素，經(jīng)Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝；通過比較傳統(tǒng)乙醇提取法和水提法的提取物得率和純度，評(píng)價(jià)UAATPE法茶皂素提取效果；結(jié)合掃描電子顯微鏡分析油茶粕微觀結(jié)構(gòu)，初步探討UAATPE法提取機(jī)制。影響茶皂素得率的關(guān)鍵因素為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間，經(jīng)Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)27.50%（w/w），硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)19.60%（w/w），液固比50﹕1，超聲時(shí)間32 min，超聲功率300 W，提取溫度60℃，在此條件下茶皂素得率為（26.21±0.54）%。與傳統(tǒng)乙醇提取法相比，UAATPE法的茶皂素得率雖差異不顯著，但其純度提高了6.57%（＜0.05）。相較于傳統(tǒng)水提法，UAATPE法提取的茶皂素得率和純度分別提升了17.74%和40.23%（＜0.01）。微觀結(jié)構(gòu)顯示UAATPE法處理的油茶粕因超聲波空化效應(yīng)，加劇了油茶粕組織破壞，產(chǎn)生大量空洞和強(qiáng)烈表面收縮，有效促進(jìn)油茶粕茶皂素釋放。UAATPE提取過程，茶皂素在雙水相系統(tǒng)中首先經(jīng)過固液提取進(jìn)入電導(dǎo)率高的底相，然后經(jīng)液液萃取遷移至極性較大的頂相，從而達(dá)到初級(jí)純化，提升茶皂素純度的效果。采用UAATPE法可以顯著提高茶皂素得率和純度，為油茶粕的高效利用提供了新方法。

油茶粕；茶皂素；超聲波；雙水相提取；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；響應(yīng)面設(shè)計(jì)

0 引言

【研究意義】油茶是世界四大油料作物之一，被譽(yù)為“東方油橄欖”，2019年我國油茶種植面積已達(dá)6 800萬hm2，油茶籽產(chǎn)量達(dá)267萬t，經(jīng)榨油后可產(chǎn)生100多萬t油茶粕[1-2]。茶油是具有食療雙重功能的一種食用油，相較于橄欖油，其具有更高的不飽和脂肪酸及能有效改善心腦血管疾病、降低膽固醇并抑制癌細(xì)胞生物活性物質(zhì)的茶多酚和山茶甙[3-4]。油茶粕是一種富含茶皂素且可產(chǎn)生較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的加工副產(chǎn)物，然而其綜合利用程度低，目前主要用于生產(chǎn)燃料和清塘劑，經(jīng)濟(jì)效益不高。茶皂素具有抗菌、胃腸保護(hù)、抗癌、降血脂等[5-8]生物活性和良好的表面活性，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。茶皂素純度是限制其應(yīng)用領(lǐng)域和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的關(guān)鍵因素，目前市場(chǎng)上流通的多為低純度茶皂素，而低純度茶皂素?zé)o法應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域且經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低。因此，尋找簡(jiǎn)單高效、提取純度高且低成本的提取技術(shù)以運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】由于茶皂素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使其提取困難[9]，傳統(tǒng)提取方法有水提法和有機(jī)溶劑法，但都存在提取效率不高、純度較低等問題。李揚(yáng)[10]采用水提法提取茶皂素，提取時(shí)間3.5 h時(shí)茶皂素得率為22.09%，侯如燕[11]采用水提法提取茶皂素，純度僅為45.23%；筆者課題組前期建立了茶皂素連續(xù)多級(jí)逆流水提工藝[12]，相較于傳統(tǒng)的單級(jí)水提取技術(shù)，極大縮短了提取時(shí)間，但在提取物得率和純度方面尚無較大突破；水提法工藝簡(jiǎn)單、成本較低，但提取物純度低，限制了后續(xù)應(yīng)用。孫萬里[13]以乙醇為提取劑提取茶皂素，得率為21.5%，于輝等[14]采用正丙醇提取茶籽粕中茶皂素，提取物純度為62.78%；與水提法相比，有機(jī)溶劑法提取物茶皂素純度有顯著提高，但存在溶劑成本高的問題。近年來，在有效成分提取及利用方面，輔助技術(shù)與雙水相體系結(jié)合的新方法因其效率高、能耗低且不破壞物質(zhì)結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)受到很多關(guān)注。LIN等[15]利用微波輔助雙水相提取香菇多糖，其提取率和純度皆高于熱回流提取法和單一微波提取法。ZHAO等[16]采用微波輔助雙水相提取黑加侖皮多酚，多酚結(jié)構(gòu)無破壞，且對(duì)食源性病原菌的抗菌效果與標(biāo)準(zhǔn)品無顯著差異?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于茶皂素提取方法的研究主要集中在有機(jī)溶劑提取與輔助技術(shù)相結(jié)合等方面，雙水相萃取因其效率高、成本低及活性物質(zhì)損失少等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于蛋白純化和抗生素提取，但關(guān)于天然活性成分雙水相提取工藝的研究報(bào)道較少，而采用輔助技術(shù)與雙水相體系結(jié)合提取茶皂素的研究尚未見報(bào)道。因此，探究雙水相體系與超聲輔助技術(shù)耦合的提取工藝及機(jī)制，可以提升茶皂素純度，降低生產(chǎn)成本，提高油茶粕深加工產(chǎn)品的附加值?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用Plackett-Burman和響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定UAATPE法提取油茶粕茶皂素最佳工藝參數(shù)，以茶皂素得率和純度兩個(gè)考察指標(biāo)評(píng)價(jià)UAATPE法對(duì)油茶粕茶皂素的提取效果；同時(shí)結(jié)合掃描電子顯微鏡分析UAATPE法提取的油茶粕微觀結(jié)構(gòu)，對(duì)其提取機(jī)制進(jìn)行初步分析，以期為油茶加工副產(chǎn)物油茶粕的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年9月至2021年5月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

油茶粕：由廣東星匯生物科技有限公司提供，油茶籽產(chǎn)自廣東省河源市龍川縣黃石鎮(zhèn)長洲村，于2020年11月采收，脫脂油茶粕基本成分含量（以干基計(jì)）：茶皂素29.75%，糖類28.56%，粗蛋白22.96%；茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：購于北京譜析科技有限公司；硫酸銨、磷酸氫二鉀：購于福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司，均為分析純；色譜級(jí)甲醇：購于北京邁瑞達(dá)科技有限公司；冰乙酸：購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，高效液相色譜儀專用。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA4202S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；QUINTIX224-1CN分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；M308073漩渦混合器，北京中西華大科技有限公司；AIIera X 64R臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特公司；SB25-12DTD超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；SOX416脂肪測(cè)定儀，德國格哈特分析儀器有限公司；LC1260高效液相色譜，安捷倫科技有限公司；S-3400N-II掃描電子顯微鏡，日立高新技術(shù)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雙水相體系（aqueous two-phase system，ATPS）相圖繪制 在25℃室溫下，通過濁點(diǎn)滴定法確定相圖，將一定量的(NH4)2SO4或K2HPO4分別添加到裝有去離子水的試管中，隨后將乙醇滴加到每個(gè)試管中，直到溶液變渾濁為止，將溶液首先變得渾濁的點(diǎn)定義為濁點(diǎn)，記錄乙醇添加量，分別以濁點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)對(duì)應(yīng)的鹽和乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫縱坐標(biāo)繪制相圖。

1.3.2 ATPS的篩選 制備乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的兩種雙水相系統(tǒng)，將(NH4)2SO4或K2HPO4分別溶解在去離子水中，通過渦旋攪拌器將鹽溶液與乙醇混合，當(dāng)混合物在濁點(diǎn)處出現(xiàn)兩相分離，就會(huì)形成雙水相系統(tǒng)。將0.5 g樣品和25 g雙水相系統(tǒng)放入離心管中，然后密封放入超聲波清洗儀，在50℃、300 W的條件下超聲提取30 min，冷卻離心后，清液進(jìn)一步分為兩相，并將頂部和底部分別收集，測(cè)定茶皂素含量。通過茶皂素分配系數(shù)（K）、回收率（R）和相比（α）來評(píng)估提取效果，其計(jì)算如下：

×100% （2）

（3）

式中，CT：頂相茶皂素濃度（mg?mL-1）；CB：底相茶皂素濃度（mg?mL-1）；mT：頂相中茶皂素含量；mB：底相中提取的茶皂素含量；Vtop：頂相體積；Vbottom：底相體積。

1.3.3 超聲耦合雙水相提取流程 將油茶粕置于烘箱內(nèi)，60℃烘干24 h，研磨，過80目篩，再經(jīng)索氏提取器脫脂。準(zhǔn)確稱量0.5 g脫脂油茶粕粉置于裝有一定梯度乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的25 g雙水相系統(tǒng)的50 mL離心管中，密封后置于超聲清洗儀，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)水溫，并用碎冰控制溫度恒定。在一定提取溫度、超聲時(shí)間和超聲功率下進(jìn)行提取，提取結(jié)束后7 000 r/min、20℃離心10 min，收集上清液，用于試驗(yàn)分析。

1.3.4 茶皂素得率測(cè)定

1.3.4.1 液相條件 采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法，略有修改[17]。流動(dòng)相A：甲醇；B：0.4%乙酸溶液；流速：1.0 mL?min-1；檢測(cè)波長：280 nm；色譜柱：inertsil ODS-3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：40℃。

梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫條件

1.3.4.2 專屬性試驗(yàn) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液、提取液，依法測(cè)定，記錄色譜圖（圖1）。提取液色譜中，在與標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜相應(yīng)位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（A）、提取液樣品（B）HPLC色譜

1.3.4.3 茶皂素得率測(cè)定 采用高效液相色譜測(cè)定茶皂素得率，準(zhǔn)確稱取80 mg茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品，用50%乙醇溶劑溶于10 mL容量瓶中，定容配成8 mg?mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL具塞試管，加入5 mL 50%乙醇，配成4 mg?mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次稀釋配置2、1和0.5 mg?mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在高效液相色譜條件下測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，茶皂素濃度（mg?mL-1）為橫坐標(biāo)，得到茶皂素回歸方程為：=119578.90+232.21，2=0.9998，線性相關(guān)性良好。過濾茶皂素提取液后用分液漏斗將上、下兩相分離，取茶皂素提取上清液定容至50 mL后，采用高效液相色譜法測(cè)定茶皂素濃度，進(jìn)一步代入以下公式計(jì)算茶皂素得率。

式中，：提取液中茶皂素濃度（mg?mL-1），M0：油茶粕質(zhì)量（mg）。

1.3.4.4 茶皂素純度測(cè)定 將茶皂素提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，之后放入烘箱中烘干至恒重得茶皂素提取物。將一定質(zhì)量茶皂素提取物定容于10 mL容量瓶，取適量茶皂素溶液，采用高效液相色譜法測(cè)定茶皂素濃度，進(jìn)一步代入以下公式計(jì)算茶皂素純度：

式中，：茶皂素濃度（mg?mL-1），M1：茶皂素提取物質(zhì)量（mg）。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) 固定硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、液固比為40﹕1、超聲功率為300 W、超聲波提取時(shí)間30 min、提取溫度50℃，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)為22%、24%、26%、28%和30%進(jìn)行茶皂素提取，測(cè)定茶皂素得率。

1.3.5.2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù) 固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%、液固比為40﹕1、超聲功率為300 w、超聲波提取時(shí)間30 min、提取溫度50℃條件下，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)為18%、20%、20%、22%和24%進(jìn)行茶皂素提取，測(cè)定茶皂素得率。

1.3.5.3 液固比 固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、超聲功率為300 w、超聲波提取時(shí)間30 min、提取溫度50℃條件下，液固比分別設(shè)為20﹕1、30﹕1、40﹕1、50﹕1和60﹕1進(jìn)行茶皂素提取，測(cè)定茶皂素得率。

1.3.5.4 超聲波功率 固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、液固比為40﹕1、超聲波提取時(shí)間30 min、提取溫度50℃條件下，超聲波功率分別設(shè)為200、250、300、350和400 W進(jìn)行茶皂素提取，測(cè)定茶皂素得率。

1.3.5.5 超聲時(shí)間 固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、液固比為40﹕1、超聲功率300 W、提取溫度50℃條件下，超聲波提取時(shí)間分別為20、30、40、50和60 min進(jìn)行茶皂素提取，測(cè)定茶皂素得率。

1.3.5.6 提取溫度 固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、液固比為40﹕1、超聲功率300 W、超聲波提取時(shí)間30 min條件下，提取溫度分別設(shè)為30℃、40℃、50℃、60℃和70℃進(jìn)行茶皂素提取，測(cè)定茶皂素得率。

1.3.6 Plackett-Burman試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取高、低兩個(gè)水平進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)，分析比較上述各因素效應(yīng)值及其顯著性篩選出顯著影響茶皂素得率的因素。Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素和水平見表2。

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的因素和水平

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用Design Expert 8.0.6軟件，以茶皂素得率為響應(yīng)值，采用中心組合試驗(yàn)Box-Behnken Design（BBD），選定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)，超聲時(shí)間為自變量進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。試驗(yàn)因素及水平如表3所示。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)因素與水平

1.3.8 不同提取方法對(duì)比 為評(píng)價(jià)超聲輔助雙水相提取法的提取效果，與提取時(shí)間60 min、液固比10﹕1和溫度80℃條件下的傳統(tǒng)乙醇提取法和水提法的茶皂素得率和產(chǎn)品純度進(jìn)行對(duì)比[18-19]。

1.3.9 不同提取方法的油茶粕微觀結(jié)構(gòu) 用掃描電子顯微鏡觀察不同提取方式對(duì)油茶粕表面微觀結(jié)構(gòu)的影響，初步探討UAATPE法對(duì)油茶粕茶皂素的提取機(jī)制。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Design Expert 8.0.6響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)分析；采用SPSS 19軟件對(duì)HPLC試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析（＜0.05，差異顯著；＜0.01，差異極顯著）；采用Excel 2019、Origin2021對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及制圖。

2 結(jié)果

2.1 雙水相系統(tǒng)研究

2.1.1 雙水相系統(tǒng)相圖 乙醇/(NH4)2SO4和乙醇/K2HPO4兩個(gè)典型的低分子有機(jī)溶劑/鹽雙水相系統(tǒng)具有相分離快、系統(tǒng)穩(wěn)定透明的特點(diǎn)[20]，相圖曲線描繪了兩相區(qū)域，在曲線上方為系統(tǒng)兩相區(qū)，該區(qū)域頂相是富含乙醇的醇相，底層是富含鹽的水相，而在曲線下方則呈現(xiàn)渾濁溶液。由圖2可知，乙醇/(NH4)2SO4系統(tǒng)的鹽濃度上限約為35%（w/w），醇濃度上限約為60%（w/w），而乙醇/K2HPO4具有相似的鹽濃度上限，然而其醇濃度上限約為45%（w/w），略低于乙醇/(NH4)2SO4系統(tǒng)。

2.1.2 雙水相系統(tǒng)篩選 如圖3所示，乙醇/K2HPO4系統(tǒng)對(duì)茶皂素提取的分配系數(shù)（K）和回收率（R）均略高于乙醇/(NH4)2SO4系統(tǒng)，但無顯著性差異（＞0.05），但乙醇/K2HPO4系統(tǒng)相比為3.14，是乙醇/(NH4)2SO4相比（0.93）的3.38倍。相較于分配系數(shù)和回收率，合適的相比（α）是一個(gè)更為重要的參數(shù)[21]，且相比在0.7—1.2范圍內(nèi)具有較優(yōu)的提取效果[20]，綜合考慮分配系數(shù)、回收率、相比和提取物的富集及操作簡(jiǎn)便性，選用乙醇/(NH4)2SO4作為提取試驗(yàn)的雙水相系統(tǒng)。

2.1.3 雙水相系統(tǒng)兩相形成區(qū)研究 兩相形成區(qū)的研究可為進(jìn)一步優(yōu)化UAATPE的系統(tǒng)組成提供有效指導(dǎo)，圖4顯示，乙醇濃度從9.79%—37.63%（w/w），鹽濃度從8.14%—30.07%（w/w）可適用于提取。綜合考慮相比的適宜范圍及圖4中相比的研究結(jié)果，選用硫酸銨濃度為16%—24%（w/w），乙醇濃度為22%—30%（w/w）作為單因素優(yōu)化范圍。

圖2 乙醇/(NH4)2SO4和乙醇/K2HPO4系統(tǒng)相圖

圖3 茶皂素在乙醇/(NH4)2SO4和乙醇/K2HPO4系統(tǒng)提取中的分配系數(shù)（K）、回收率（R）和相比（α）

圖4 乙醇/(NH4)2SO4雙水相體系相比

2.2 茶皂素提取單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) 當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)在22%— 30%，茶皂素得率隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)（＜0.05），而當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%時(shí)，茶皂素得率最大（圖5）。在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，頂相中有機(jī)溶劑的含量會(huì)增大，這有助于提升頂相提取能力[22]；而當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，頂相會(huì)溶解醇溶性雜質(zhì)、色素等，從而降低茶皂素在頂相中的溶解度，導(dǎo)致得率降低[23]。因此，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇26%、28%、30%三個(gè)水平進(jìn)行組合試驗(yàn)。

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

2.2.2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù) 當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)在16%—20%，茶皂素得率呈輕微上升趨勢(shì)（圖6），可能是由于硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加使有機(jī)相中水分降低極性增強(qiáng)，進(jìn)而增加茶皂素溶解度和擴(kuò)散系數(shù)，促使茶皂素由內(nèi)向外擴(kuò)散[24]，提升茶皂素得率。然而上升趨勢(shì)不顯著可能是由于硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)在16%—18%時(shí)，雙水相體系較不穩(wěn)定，成相能力較低。而當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過20%時(shí)，茶皂素得率隨硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)（＜0.05）。這可能是由于硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，上相趨于飽和狀態(tài)，隨后繼續(xù)增加硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)使頂相中的茶皂素向底相遷移。此外，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高會(huì)使雙水相體系中硫酸銨沉淀析出，影響茶皂素浸出[25]，導(dǎo)致分配系數(shù)下降，從而降低茶皂素得率。因此，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇18%、20%、22%三個(gè)水平進(jìn)行組合試驗(yàn)。

2.2.3 液固比 茶皂素得率隨著液固比增加呈現(xiàn)先增加后顯著降低的趨勢(shì)（＜0.05），當(dāng)液固比達(dá)到50﹕1時(shí)，茶皂素得率取得最大值（圖7）。其原因可能是隨著液固比的增加，溶劑滲透并擴(kuò)散到油茶粕細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞內(nèi)外濃度梯度增大，而濃度梯度作為傳質(zhì)動(dòng)力促進(jìn)油茶粕中茶皂素釋放[26]；另外，溶劑在油茶粕細(xì)胞內(nèi)可破壞疏水鍵，增加油茶粕中茶皂素由內(nèi)向外的擴(kuò)散速率，使其得率提高[27]。但當(dāng)液固比超過50﹕1時(shí)，茶皂素得率顯著降低（＜0.05），其原因可能是由于液固界面存在傳質(zhì)極限，細(xì)胞內(nèi)外濃度梯度差趨于零，體系已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，過量溶劑不但稀釋茶皂素，而且也會(huì)使后續(xù)茶皂素的分離更難[28]。綜上所述，液固比選擇40﹕1、50﹕1、60﹕1三個(gè)水平進(jìn)行組合試驗(yàn)。

圖6 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)茶皂素得率的影響

2.2.4 超聲波功率 隨著超聲波功率的增大，茶皂素得率逐漸增加，但在300 W后出現(xiàn)顯著下降（＜0.05）（圖8），這是因?yàn)槌暡栈饔糜欣诓柙硭貜募?xì)胞壁中釋放，但當(dāng)超聲波功率過大時(shí)，可能會(huì)破壞茶皂素的結(jié)構(gòu)[29]。研究表明，皂苷類物質(zhì)在功率過高的超聲波作用下會(huì)造成糖苷分離，導(dǎo)致皂苷降解，進(jìn)而使茶皂素得率降低[30-31]。因此，從降低能耗和得到高品質(zhì)茶皂素的角度考慮，超聲波功率選擇250、300和350 w三個(gè)水平進(jìn)行組合試驗(yàn)。

圖7 液固比對(duì)茶皂素得率的影響

圖8 超聲波功率對(duì)茶皂素得率的影響

2.2.5 超聲時(shí)間 茶皂素得率隨著超聲時(shí)間延長，呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)（＜0.05），后又呈顯著下降（＜0.05），在40—60 min時(shí)，提取率沒有顯著性變化（＜0.05）（圖9）?？赡苁且?yàn)樵谔崛〕跗?，茶皂素在較大的濃度梯度下，容易從細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散到周圍溶劑中，使茶皂素得率顯著增加[32]。后期隨著時(shí)間的延長，乙醇揮發(fā)量增加，會(huì)引起提取效果下降，此外長時(shí)間提取可能會(huì)增加茶皂素的水解程度，破壞茶皂素分子結(jié)構(gòu)，從而致使提取率隨之降低。因此，超聲時(shí)間選擇20、30和40 min三個(gè)水平進(jìn)行組合試驗(yàn)。

圖9 超聲時(shí)間對(duì)茶皂素得率的影響

2.2.6 提取溫度 茶皂素得率隨著提取溫度的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，提取溫度為60℃時(shí)得率最高（圖10），這可能是由于乙醇受熱易揮發(fā)，過高的提取溫度會(huì)使雙水相體系中乙醇揮發(fā)，降低其提取能力，從而影響茶皂素得率。因此，提取溫度選擇50℃、60℃、70℃三個(gè)水平進(jìn)行組合試驗(yàn)。

2.3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)

以茶皂素得率為考察指標(biāo)，用Design expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，試驗(yàn)結(jié)果如表4，各因素的顯著性分析如表5，由于模型的＜0.05，可知該模型具有顯著性影響，6個(gè)因子影響大小排序?yàn)槌晻r(shí)間＞乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞超聲功率＞提取溫度＞液固比，其中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間對(duì)茶皂素提取具有顯著性影響（＜0.05），因此，選用以上3種因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

圖10 提取溫度對(duì)茶皂素得率的影響

2.4 提取油茶粕茶皂素響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定提取溫度為60℃，液固比為50﹕1，超聲功率為300 W，以乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間為自變量，以茶皂素得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共包括17組試驗(yàn)方案，試驗(yàn)結(jié)果見表6。

2.4.2 模型建立與方差分析 采用Design expert軟件，選擇Box-Behnken Design模型，對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中各組的茶皂素提取量進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程如下：

=26.58-0.461-0.382+0.253+1.3812-0.5113+0.1223-1.6212-1.9322-0.7932（6）

式中，：油茶粕茶皂素得率（%）；1：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）；2：硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）；3：超聲時(shí)間（min）。

分析發(fā)現(xiàn)，該模型值為61.17（＜0.0001），說明所選模型差異極顯著。失擬項(xiàng)值為0.7464（＞0.05），失擬項(xiàng)不顯著，表明試驗(yàn)結(jié)果和該模型擬合度高，該模型能較好地預(yù)測(cè)茶皂素的提取效果（表7）。由自變量值大小可知，各因素對(duì)油茶粕茶皂素得率的影響依次為：1（乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)）＞2（硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)）＞3（超聲時(shí)間）。由自變量的值可知，因素1、2、12、13、12、22、32差異極顯著（＜0.01），3差異顯著（＜0.05），其他項(xiàng)差異不顯著。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析

*表示差異顯著（＜0.05） * indicate significant difference (＜0.05)

回歸模型的決定系數(shù)2=0.9874，調(diào)整決定系數(shù)2adj=0.9713，說明該模型的擬合程度較好，可以利用該模型對(duì)超聲輔助雙水相提取油茶粕茶皂素進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)。變異系數(shù)為1.16%，表明試驗(yàn)的重復(fù)性好，試驗(yàn)結(jié)果可靠。綜上所述，可以采用該模型的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定超聲輔助雙水相提取油茶粕茶皂素的最優(yōu)參數(shù)條件。

2.4.3 兩因子間交互作用分析 圖11各圖是由響應(yīng)值和各試驗(yàn)因子構(gòu)成的立體曲面圖，顯示乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間中任意兩個(gè)變量取零水平時(shí)，變量對(duì)油茶粕茶皂素得率的影響。

圖11-a顯示茶皂素得率隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增大，到達(dá)中心點(diǎn)后開始下降。圖11-b表明茶皂素得率是隨超聲時(shí)間和乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增大，達(dá)到最大值后開始逐步下降。圖11-c表明隨著超聲時(shí)間的增加，茶皂素得率先增加后減小，而硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)茶皂素得率的影響也表現(xiàn)為此趨勢(shì)。從圖中等高線密度可以看出，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的等高線密度最大，而硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間的等高線密度差異不大，表明乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)茶皂素得率的影響最大，其次為硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間。

表6 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表7 回歸模型方差分析

*表示差異顯著（＜0.05）；**表示差異極顯著（＜0.01）

* indicate significant difference (＜0.05); ** indicate extremely significant difference (＜0.01)

圖11 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（x1）、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（x2）和超聲時(shí)間（x3）對(duì)茶皂素得率影響的響應(yīng)曲面圖

2.4.4 最優(yōu)提取條件的確定與驗(yàn)證 利用Design Expert軟件優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出超聲耦合雙水相提取茶皂素的最佳工藝參數(shù)為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)27.485%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)19.636%，超聲時(shí)間32.323 min，超聲功率300 w，提取溫度60℃，液固比50﹕1，在此條件下茶皂素的預(yù)計(jì)得率為26.704%。為了檢驗(yàn)上述優(yōu)化結(jié)果，本試驗(yàn)利用優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證?？紤]到實(shí)際的可行性和便利性，修正提取工藝為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27.50%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.60%，超聲時(shí)間為32 min，超聲功率300 W，提取溫度60℃，液固比50﹕1，在此條件下做3次平行試驗(yàn)的茶皂素得率為（26.21±0.54）%，與理論值相比，相對(duì)誤差為2.47%，說明該模型可以較好地預(yù)測(cè)UAATPE提取茶皂素的得率，驗(yàn)證了優(yōu)化提取條件的可靠性。

2.5 不同提取方法的比較

在本試驗(yàn)UAATPE優(yōu)化條件下進(jìn)行提取，由表8可知，在提取時(shí)間縮短28 min，提取溫度降低20℃的情況下，與傳統(tǒng)乙醇提取法相比，茶皂素得率無顯著性差異（＞0.05），但提取物純度顯著增加（＜0.05），提高了6.57%，此時(shí)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為27.50%；相較于傳統(tǒng)水提法，茶皂素得率極顯著增加（＜0.01），提升了17.74%，同時(shí)茶皂素純度極顯著增加（＜0.01），提升了40.23%。

2.6 不同提取方法處理油茶粕微觀結(jié)構(gòu)

物質(zhì)提取效果與植物組織細(xì)胞壁的物理變化存在一定關(guān)系，且不同提取方法處理下，油茶粕組織結(jié)構(gòu)的物理變化有顯著差異。油茶粕組織樣品經(jīng)過粉碎處理后（圖12-a），其組織結(jié)構(gòu)表面較為光滑，粉碎處理對(duì)樣品的破壞程度較小。相較于未經(jīng)提取處理的油茶粕組織樣品，乙醇提取法、UAATPE和水提法處理后（圖12-b—d）的油茶粕樣品組織結(jié)構(gòu)皆受到不同程度的破壞。水提法處理后的油茶粕粉末表面呈現(xiàn)一定的褶皺，但多為光滑平面，而乙醇提取法處理后的組織樣品出現(xiàn)一定松散和空洞，兩種處理方式對(duì)樣品的破壞程度皆較小。然而經(jīng)UAATPE法處理后，油茶粕組織樣品破損程度較為嚴(yán)重，出現(xiàn)了大量孔洞的同時(shí)還出現(xiàn)較為嚴(yán)重的表面收縮，這可能是由于超聲波的細(xì)胞空化效應(yīng)，加劇了油茶粕組織的破壞[20]，因而促進(jìn)了油茶粕植物細(xì)胞中茶皂素的釋放。

表8 不同提取方法比較

不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05） Different lowercase letters indicate significant difference (＜0.05)

a：油茶粕粉碎樣品；b：傳統(tǒng)乙醇提取法處理后油茶粕樣品；c：超聲耦合雙水相提取法處理后油茶粕樣品；d：水提取法處理后油茶粕樣品

3 討論

3.1 雙水相體系選擇與茶皂素提取效果的相關(guān)性

雙水相系統(tǒng)是指一種或幾種物質(zhì)以適當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶解在水相中，在一定條件下形成互不相溶的水溶液體系，如聚合物/聚合物/水、聚合物/無機(jī)鹽/水、聚合物/有機(jī)鹽/水、表面活性劑/表面活性劑/水、小分子有機(jī)溶劑/無機(jī)鹽/水等體系[33]。研究表明，ATPS體系對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有良好的提取純化效果，這很大程度上取決于兩相體系的選擇，而其中以低分子有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽組成的雙水相體系最為典型。LI等[34]采用雙水相提取海棠多糖，評(píng)價(jià)了5種鹽（(NH4)2SO4、KH2PO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na2CO3）與乙醇組成的ATPS體系對(duì)海棠多糖的提取效果，5種ATPS體系對(duì)多糖提取效果有顯著性差異，其中以硫酸銨/乙醇/水體系最優(yōu)。SHAKER等[35]發(fā)現(xiàn)聚合物/鹽/水ATPS體系更適合姜黃素的純化，其中以PEG6000/Na2SO4/水為最佳提取體系。由此可見，雙水相體系可就不同天然活性物質(zhì)的物理性質(zhì)進(jìn)行專一性設(shè)計(jì)。

在采用小分子有機(jī)溶劑/無機(jī)鹽/水ATPS體系提取茶皂素過程中，低分子有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽的種類對(duì)茶皂素分配系數(shù)有重要影響，Ng等[36]研究表明低分子有機(jī)溶劑的烷基鏈短，疏水性較低，有助于物質(zhì)遷移到富含醇的頂相，提高其分配系數(shù)和回收率，進(jìn)而使提取物得率和純度提高。而JIANG等[37]研究發(fā)現(xiàn)無機(jī)鹽種類也可影響提取效果，磷酸鹽與硫酸鹽和檸檬酸鹽相比，具有較低的鹽析效應(yīng)，這可促進(jìn)提取物遷移到富含有機(jī)溶劑的頂相?；诖?，本研究選定乙醇作為提取體系的低分子有機(jī)溶劑，此外根據(jù)茶皂素是三萜類皂苷，結(jié)構(gòu)側(cè)鏈上多為羧基，顯酸性的特性[38]，針對(duì)性選擇強(qiáng)酸弱堿鹽(NH4)2SO4及呈現(xiàn)弱堿性的K2HPO4作為分相鹽進(jìn)行體系篩選。根據(jù)Hofmeister規(guī)律可知，(NH4)2SO4與K2HPO4具有相近的鹽析能力[39]，同時(shí)本研究關(guān)于體系篩選的分析結(jié)果也表明，乙醇/(NH4)2SO4及乙醇/K2HPO4對(duì)茶皂素的提取效果相近，兩者分配系數(shù)和回收率都無顯著性差異。然而，相較于分配系數(shù)和回收率，相比是評(píng)價(jià)提取體系是否適當(dāng)?shù)年P(guān)鍵指標(biāo)[37]。結(jié)合本研究關(guān)于雙水相相圖和體系篩選研究結(jié)果與辜鵬[40]對(duì)分相時(shí)間的研究可知，乙醇/(NH4)2SO4體系分相范圍更廣，分相能力更強(qiáng)且相比適中，更加適用于茶皂素提取。綜上，本研究在縮短提取時(shí)間和降低有機(jī)溶劑使用量的情況下，UAATPE法顯示出良好的提取效果，其顯著提升了提取物茶皂素得率和純度。

3.2 UAATPE法對(duì)油茶粕茶皂素提取過程的影響

超聲波是一種在傳播過程中形成交替正壓和負(fù)壓的高頻彈性波，油茶粕植物細(xì)胞中的空化氣泡在超聲波頻率帶動(dòng)下達(dá)到共振，產(chǎn)生空化氣泡的膨脹破裂，當(dāng)?shù)竭_(dá)極限爆裂時(shí)，氣泡內(nèi)將產(chǎn)生極高溫度和壓強(qiáng)，造成油茶粕細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)瞬間破壞，加速細(xì)胞內(nèi)容物向溶劑的擴(kuò)散速度[41]。如提取示意圖（圖13）顯示，UAATPE法提取茶皂素是一個(gè)動(dòng)態(tài)的復(fù)雜過程，相較于傳統(tǒng)提取法，油茶粕樣品位于富含鹽的底相和富含醇的頂相之間，UAATPE法提取茶皂素經(jīng)歷了兩個(gè)階段，第一階段：在超聲波引起的強(qiáng)烈空穴效應(yīng)和熱效應(yīng)下，油茶粕細(xì)胞組織瞬間破壞，植物細(xì)胞內(nèi)容物快速擴(kuò)散至具有高電導(dǎo)率的含鹽底相，加速茶皂素等成分與油茶粕基質(zhì)分離。本研究中UAATPE法提取后的油茶粕掃描電子顯微鏡圖也顯示，超聲波可使油茶粕產(chǎn)生大量空洞，同時(shí)對(duì)比傳統(tǒng)乙醇提取法可知超聲波作用顯著提升了茶皂素提取效率。UAATPE法提取前期主要以固液提取為主，茶皂素不斷富集到底相，同時(shí)在機(jī)械與空化效應(yīng)提供的攪拌作用下，雙水相頂相與底相充分接觸，促進(jìn)了茶皂素在底相與頂相之間的液液萃取。第二階段：體系主要進(jìn)行的是茶皂素在富含鹽的底相和富含有機(jī)溶劑的頂相之間的選擇性分配，分配規(guī)律服從能斯特分配定律，該過程以液液萃取為主。本研究中體系篩選時(shí)茶皂素回收率高達(dá)80%以上，這表明ATPS體系實(shí)現(xiàn)了對(duì)茶皂素與雜質(zhì)的兩相選擇性分配，使茶皂素在上相富集，而進(jìn)一步與傳統(tǒng)水提法的比較則證明正是這種選擇性分配使茶皂素純度顯著上升。雙水相體系對(duì)茶皂素的選擇性分配是因?yàn)椴柙硭厥且活愇瀛h(huán)三萜類皂苷，水溶液呈弱酸性，茶皂素分子結(jié)構(gòu)中含有羧基、羥基、羰基等，從酸堿平衡的角度可以把茶皂素看做二元弱酸，同時(shí)根據(jù)雙水相萃取的相似相溶原理，在此過程中茶皂素將優(yōu)先分配到極性較小的富含有機(jī)溶劑的頂相。此外，這種選擇性分配還受到多種作用力（分子間作用力、靜電力、分子空間阻礙力等）的影響，茶皂素在雙水相體系中分配系數(shù)如下式所示：=a+b+c，式中：a為氫鍵作用力，b為靜電力，c為其他作用力[33]。

本研究結(jié)果顯示，在超聲波作用下，油茶粕微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)大量空洞和嚴(yán)重表面收縮，促進(jìn)油茶粕植物細(xì)胞內(nèi)茶皂素釋放，提高其得率，同時(shí)雙水相體系可使茶皂素與雜質(zhì)在兩相內(nèi)進(jìn)行選擇性分配，進(jìn)而提升茶皂素純度；此外，UAATPE法提取時(shí)，茶皂素先是經(jīng)過固液提取從油茶粕中進(jìn)入底相，然后經(jīng)液液萃取遷移至頂相，使茶皂素在含有機(jī)溶劑的頂相富集，而低聚糖、小分子多糖及有機(jī)酸等水溶性雜質(zhì)則在水相富集，進(jìn)而提升頂相茶皂素純度，達(dá)到初級(jí)純化的效果。

圖13 UAATPE法茶皂素動(dòng)態(tài)提取過程示意圖

4 結(jié)論

采用Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到超聲耦合乙醇/硫酸銨雙水相體系提取油茶粕茶皂素的最佳提取工藝條件為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27.50%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.60%，超聲時(shí)間為32 min，超聲功率300 W，提取溫度60℃，液固比50﹕1，提取物茶皂素的得率為（26.21±0.54）%，純度為（66.09±0.04）%。超聲波耦合雙水相提取作為一種低成本且高效率的新型技術(shù)，可為農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物中生物活性成分的提取提供新思路。

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Optimization and Mechanism of Ultrasonic-Assisted Two-Phase Extraction of Tea Saponin

1Sericultural & Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Guangzhou 510610;2College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510640;3Guangdong Xinghui Biological Technology Co., Ltd., Longchuan 517323, Guangdong

【】Tea saponin is a naturally active substance with wide application prospective, and its purity is the key factor limiting its application and value. In this study, the optimal conditions for ultrasonic-assisted two-phase extraction (UAATPE) of tea saponin from camellia meal were explored, and the possible extraction mechanism was discussed in order to develop an efficient, high-purity extraction technology, so as to provide a technical guidance for high-value utilization of camellia meal. 【】On the basis of the single factor experimental results, the key factors affecting the yield of tea saponin were screened by Plackett Burman design, and the extraction process was optimized by Box-Behnken design. The extraction efficiency of tea saponin using the UAATPE method was evaluated by comparing the extraction yield and purity to the traditional ethanol extraction method and water extraction method. Scanning electron microscopy (SEM) was employed to analyze the microstructure of camellia meal, and the possible mechanism of extraction by the UAATPE method was discussed. 【】The key factors affecting the yield of tea saponin were mass fraction of ethanol, mass fraction of ammonium sulfate, and ultrasonic time. The process parameters optimized by Box-Behnken design were as follows: an ethanol content of 27.50% (W/W), an ammonium sulfate content of 19.60% (W/W), a liquid-solid ratio of 50﹕1, an ultrasonic time of 32 min, an ultrasonic power of 300 W and an extraction temperature of 60℃, and the yield of tea saponin at (26.21±0.54)% was achieved under the optimized conditions. Compared with the traditional method of ethanol extraction, the purity of tea saponin extracted by the UAATPE method increased by 6.57% (＜0.05), although the difference of the yield of tea saponin extracted by these two methods was not significant. Compared with the traditional method of water extraction, the yield and purity of tea saponin extracted using the UAATPE method were increased by 17.74% and 40.23%, respectively (＜0.01). The microstructure showed that owing to the effect of the camellia meal treated by the UAATPE method, the ultrasonic cavitation accelerated the tissue damage of the camellia meal, producing a large number of voids and strong surface shrinkage, which effectively promoted the release of tea saponin in the camellia meal. In the process of the UAATPE extraction, the tea saponin first entered the bottom phase with high electrical conductivity through solid-liquid extraction in the two-phase water system, and then moved to the top phase with high polarity through liquid-liquid extraction, achieving primary purification and improving the purity of tea saponin. 【】The UAATPE method could significantly improve the yield and purity of tea saponin, thus providing a new novel method for the efficient utilization of camellia meal.

camellia meal; tea saponin; ultrasound; aqueous two-phase extraction; Plackett-Burman; response surface design

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.01.014

2021-05-26；

2021-09-13

廣東省本土創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2019BT02N112）、廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)資金（2020KJ117）、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（202108TD）

杜金婷，E-mail：3046023329@qq.com。通信作者張雁，E-mail：zhang__yan_@126.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）