徐獻(xiàn)斌，耿曉月，李慧，孫麗娟，鄭煥，陶建敏

基于轉(zhuǎn)錄組分析ABA促進(jìn)葡萄花青苷積累相關(guān)基因

徐獻(xiàn)斌，耿曉月，李慧，孫麗娟，鄭煥，陶建敏

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095

【】分析參與調(diào)控ABA促進(jìn)葡萄著色的相關(guān)基因，探討ABA促進(jìn)葡萄果實(shí)花青苷積累的分子機(jī)制。以‘紅巴拉多’葡萄為試材,在轉(zhuǎn)色前期（約花后6周）使用300 mg?L-1ABA對(duì)果穗進(jìn)行浸果處理，以清水處理為對(duì)照。觀察表型，并利用超高液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS）測(cè)定花青苷組分及含量，再利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)從分子水平對(duì)ABA促進(jìn)花青苷積累的機(jī)制進(jìn)行生物信息學(xué)分析。外源ABA處理3 d后，葡萄果實(shí)著色明顯加深，花青苷種類和含量增多，其中芍藥素3-O-葡萄糖苷、錦葵色素3-O-葡萄糖苷兩種單體花青苷含量增加最為顯著。分析ABA處理18 h和3 d后葡萄果實(shí)轉(zhuǎn)錄水平的差異，并通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)了11個(gè)ABA信號(hào)通路基因以及52個(gè)與花青苷生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因差異表達(dá)，它們均在外源ABA處理后表達(dá)上調(diào)。通過將差異基因與葡萄轉(zhuǎn)錄因子庫進(jìn)行比對(duì)，共發(fā)現(xiàn)297個(gè)轉(zhuǎn)錄因子差異表達(dá)。進(jìn)一步分析差異轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式，篩選與表達(dá)模式相近的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)15個(gè)MYB、bHLH、bZIP、NAC、Dof、HD-ZIP等家族的轉(zhuǎn)錄因子，其可能參與調(diào)控花青苷生物合成。啟動(dòng)子順式作用元件分析表明，大部分篩選到的差異基因啟動(dòng)子中含有ABRE元件，說明這些差異表達(dá)基因的啟動(dòng)子可能為ABA誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。對(duì)部分候選基因的表達(dá)模式進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）分析,證實(shí)了RNA-seq的準(zhǔn)確性。ABA促進(jìn)葡萄花青苷積累涉及11個(gè)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、52個(gè)花青苷合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因，15個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控了這一生物過程。研究結(jié)果為揭示ABA促進(jìn)葡萄花青苷積累的分子機(jī)制提供了一定基礎(chǔ)。

葡萄；花青苷；ABA；轉(zhuǎn)錄組；啟動(dòng)子

0 引言

【研究意義】葡萄（L）是一種全球廣泛栽培的水果作物，可用于鮮食、釀酒、加工、制汁等，其中鮮食葡萄占有較大比重（約30%）[1]。在我國(guó)南方地區(qū)避雨栽培模式下，一些紅色或黑色品種的葡萄果實(shí)，常常因?yàn)闇囟雀呋蚬庹詹蛔汶y以著色。果實(shí)顏色是衡量鮮食葡萄商業(yè)價(jià)值的重要指標(biāo)，成熟期的果實(shí)著色不佳嚴(yán)重影響葡萄的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在許多鮮食葡萄品種中，外源使用ABA能有效促進(jìn)葡萄果實(shí)著色已得到證實(shí)，但其潛在的分子機(jī)理尚不清楚[2-4]。因此，探究ABA促進(jìn)葡萄果實(shí)著色分子機(jī)制，可為生產(chǎn)上外源使用ABA提供理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人研究表明，ABA是調(diào)控非呼吸躍變型果實(shí)成熟的重要激素，內(nèi)源ABA含量在果實(shí)始熟期開始快速上升，在果實(shí)糖分積累、軟化、著色等過程中起著關(guān)鍵作用[5]。研究表明，外源ABA處理使葡萄提早成熟，顯著促進(jìn)葡萄的著色，且不會(huì)明顯影響可溶性固形物、可滴定酸等果實(shí)品質(zhì)[3-4,6]。也有學(xué)者認(rèn)為，外源ABA不僅可以促進(jìn)葡萄果實(shí)著色，同時(shí)可以提高葡萄的內(nèi)在品質(zhì)[7-8]。ABA對(duì)葡萄果實(shí)品質(zhì)產(chǎn)生不同影響的原因可能是外源ABA的濃度、施用方式以及葡萄品種的不同。但可以證實(shí)的是，ABA能促進(jìn)葡萄果實(shí)著色，提高果實(shí)的外觀品質(zhì)。在生理水平上，研究者們對(duì)外源ABA促進(jìn)葡萄著色的機(jī)理開展了一些研究。外源ABA處理后，果實(shí)內(nèi)源ABA含量提高，內(nèi)源乙烯合成增加，改變了ABA、乙烯、吲哚乙酸、赤霉素、玉米素核苷等之間的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，從而促進(jìn)果實(shí)花青苷合成和果實(shí)著色[9]。在分子水平上，有一些研究從基因角度探究ABA促進(jìn)葡萄著色的機(jī)理。外源ABA通過上調(diào)、、、、、、等類黃酮通路結(jié)構(gòu)基因和、等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，促進(jìn)花青苷的生物合成[10-11]。Gao等[12]證實(shí)了ABA受體基因在‘巨峰’葡萄中瞬時(shí)過表達(dá)可以促進(jìn)花青苷積累。【本研究切入點(diǎn)】盡管前人對(duì)ABA促進(jìn)葡萄果皮花青苷積累方面進(jìn)行了大量研究，但ABA促進(jìn)花青苷生物合成是一個(gè)涉及許多基因的復(fù)雜過程，其相關(guān)的分子機(jī)制仍不明確。通過傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法逐一地對(duì)這一生物合成過程涉及的大量基因進(jìn)行研究，不僅效率低，而且難度大。利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）能夠全面、快速地分析ABA促進(jìn)花青苷合成相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)變化。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以‘紅巴拉多’葡萄為試材,在轉(zhuǎn)色前期使用ABA處理，選取關(guān)鍵時(shí)期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。深入研究與花青苷合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因在ABA處理后的表達(dá)模式，并且篩選可能參與調(diào)控ABA促進(jìn)花青苷積累的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，以全面地了解ABA促進(jìn)葡萄花青苷合成的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和表達(dá)模式，為ABA促進(jìn)花青苷積累的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為生產(chǎn)上外源使用ABA促進(jìn)葡萄著色提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)湯山葡萄基地進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

選用‘紅巴拉多’葡萄為試驗(yàn)材料，選擇樹體長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，樹形為平棚架型，栽培管理等同常規(guī)。

果實(shí)的轉(zhuǎn)色前期（花后第6周），在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上選用300 mg?L-1ABA（上海源葉）對(duì)‘紅巴拉多’葡萄果穗進(jìn)行浸果處理，以清水處理為對(duì)照。處理后24 h內(nèi)每隔6 h取樣一次，處理后3 d（出現(xiàn)明顯表型差異）取樣一次。將所取樣品用手術(shù)刀片剝?nèi)」?，液氮速凍?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 花青苷的提取及定性分析

總花青苷的提取參照J(rèn)ia等[13]的方法并加以改進(jìn)。取待測(cè)定的葡萄果皮樣品，用液氮研磨成粉末，稱取1.0 g樣品粉末，加入10 mL含1%鹽酸的甲醇溶液，4℃黑暗條件下靜置24 h，10 000 r/min高速離心10 min，沉淀反復(fù)浸提兩次，合并上清液，用0.22 μm濾膜過濾后合并上清液待測(cè)。

使用AB SCIEX Triple TOF 5600+液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定花青苷的組分及相對(duì)含量，參照Zhang等[14]的方法并加以改進(jìn)。流動(dòng)相A泵溶液：0.1%甲酸水溶液；B泵溶液：0.1%乙腈。洗脫條件：流動(dòng)相洗脫梯度：0—0.5 min，5% B；0.5—20.5 min，5%—40% B；0.5—22.5 min，40%—95% B。流速：0.2 mL?min-1。進(jìn)樣量：2 μL。

質(zhì)譜條件：使用正離子模式下的電噴霧源和質(zhì)譜采集模式，選擇的質(zhì)量范圍為50—1 200 m/z。使用亮氨酸腦啡肽（m/z 556.2771）重新校準(zhǔn)，啟用鎖定質(zhì)量選項(xiàng)。電離參數(shù)為：毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐電壓40 V，源溫度120℃、脫溶氣體溫度為400℃。

采用外標(biāo)法對(duì)花青苷組分進(jìn)行相對(duì)定量：配制0.02—20 ng·mL-1不同濃度的錦葵色素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.9986，回歸方程為=1E+06-245385。

1.3 ABA含量測(cè)定

ABA的提取和測(cè)定參照Hu等[15]的方法并加以改進(jìn)。取待測(cè)定的葡萄果皮樣品，用液氮研磨成粉末，稱取1.0 g樣品粉末，加入10 mL含80%的甲醇溶液，4℃黑暗條件下靜置12 h，10 000 r/min高速離心10 min，沉淀反復(fù)浸提兩次，合并上清液，加入0.2 g PVPP，在4℃恒溫?fù)u床中120 r/min振蕩1 h,離心后取上清液過C18小柱，使用冷凍干燥器凍干48 h，再加入1 mL 80%的甲醇溶解，用0.45 μm濾膜過濾后合并上清液待測(cè)。

HPLC條件：所用儀器為3200 Qtrap高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB SCIEX），色譜柱：phenomenex Kinetex? XB-C18（100 mm×3 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相：A泵溶液：0.1%甲酸水溶液，B泵溶液：甲醇。洗脫條件：0—1 min，5% B；1—4 min，5% B—95% B；4—8 min，95% B；8—8.1 min，95% B—5% B。流速：0.3 mL· min-1；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：在MRM模式下，用電噴霧電離ESI負(fù)離子模式，離子源：Turbo Spray，氣簾氣CUR：25，離子源噴霧電壓IS：-4 500 kV，溫度TEM：500℃，噴霧氣GS1：45，輔助加熱氣GS2：30，碰撞氣CAD：Medium，入口電壓EP：-10 V，碰撞單元出口電位CEP：-18.37，出口電壓CXP：-2.2 V。

精確配制5—1 000 ng·mL-1不同濃度的ABA標(biāo)準(zhǔn)品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.99913，回歸方程為=127.22+145.81。

1.4 總RNA提取、cDNA文庫建立及測(cè)序

總RNA的提取采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，China），所有操作按照說明書進(jìn)行。取2 μL RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA樣品的質(zhì)量。用Nanodrop ND-1000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。

使用NEBNext? UltraTMRNA文庫制備試劑盒（NEB，USA）建立測(cè)序文庫。使用Qubit 2.0熒光儀和Agilent 2100生物分析儀檢查cDNA文庫質(zhì)量。檢測(cè)合格的cDNA文庫在Illumina Hiseq平臺(tái)上測(cè)序。每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除接頭污染、未知堿基N含量過高和低質(zhì)量序列后，獲得高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)（clean reads）。

1.5 葡萄參考基因組比對(duì)及基因功能注釋

利用HISAT2將clean reads與葡萄參考基因組（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/003/745/GCF_000003745.3_12X/GCF_000201 003745.3_12X_genomic.fna.gz）進(jìn)行比對(duì)。計(jì)算每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments（FPKM值），用RSEM工具檢測(cè)基因和轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，用DEseq2檢測(cè)差異表達(dá)基因（DEGs）。篩選差異基因的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）閾值設(shè)為≤0.05。差異基因基于NCBI非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫（Nr，http://ftpprivate.ncbi.nlm.nih.gov）、Gene Ontology數(shù)據(jù)庫（GO，http://www.geneology. org/）、KEGG Ortholog數(shù)據(jù)庫（KEGG，http://www. genome.jp/kegg/）進(jìn)行基因功能注釋。

1.6 差異表達(dá)基因富集分析

根據(jù)Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）的注釋結(jié)果和官方分類，分別對(duì)差異基因的功能和生物學(xué)途徑進(jìn)行分類。用Blast2Go進(jìn)行GO富集分析，-value（adj）≤0.05。采用兩種統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)（hypergeometric Fisher’s exact test，＜0.01）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以確定KEGG途徑在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著富集。

1.7 轉(zhuǎn)錄因子(TF)分析及啟動(dòng)子順式作用元件分析

將差異基因與葡萄轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http://planttfdb. cbi.pku.edu.cn/index.php?sp=Vvi）進(jìn)行比對(duì)，獲取差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子以進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

利用TBtools（http://www.tbtools.com/）軟件和葡萄全基因組序列提取候選差異基因上游2 kb啟動(dòng)子序列，上傳到plantcare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件分析。

1.8 qRT-PCR分析

qRT-PCR引物使用Beacon Designer 7.0軟件（Premier Biosoft Internaition，USA）設(shè)計(jì)，引物見表1。所有引物均用PCR擴(kuò)增、電泳和溶解曲線進(jìn)行測(cè)試以保證引物特異性。使用ABI-7300系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系按SYBR Green PCR Master Mix（Takara）試劑盒說明書進(jìn)行。以為內(nèi)參，用2-ΔΔCT公式計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[16]。

表1 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)序列

2 結(jié)果

2.1 ABA處理后‘紅巴拉多’葡萄果皮花青苷含量和組分分析

如圖1所示，外源ABA處理3 d后，‘紅巴拉多’葡萄外觀出現(xiàn)了明顯的變化，果皮呈現(xiàn)紅色。UPLC-MS結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ABA處理組葡萄果皮的總花青苷含量約為對(duì)照的9倍，表明ABA處理顯著提高了葡萄的總花青苷含量。對(duì)照組葡萄果皮中只有飛燕草素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷）、芍藥素3-O-葡萄糖苷、錦葵色素3-O-葡萄糖苷3種花青苷，且含量很低。與對(duì)照組相比，ABA處理組增加了3種花青苷，分別是矮牽牛素3-O-葡萄糖苷、天竺葵素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷）、芍藥素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷），但含量并不高。但ABA處理顯著增加了芍藥素3-O-葡萄糖苷、錦葵色素3-O-葡萄糖苷的含量，ABA處理組的含量分別約為對(duì)照組的12倍和9倍（表2）。

圖1 外源ABA處理3 d后‘紅巴拉多’葡萄表型

2.2 VvNCED1表達(dá)模式分析及內(nèi)源ABA含量測(cè)定

qRT-PCR結(jié)果顯示，ABA處理后24 h內(nèi)的表達(dá)隨著處理時(shí)間表現(xiàn)出先升后降的變化趨勢(shì)；其在處理后18 h達(dá)到峰值，隨后逐漸下降（圖2）。此外，ABA處理后相對(duì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照，說明葡萄果皮中受到ABA的誘導(dǎo)迅速上調(diào)表達(dá)（圖2）。

表2 外源ABA處理對(duì)‘紅巴拉多’葡萄果皮花青苷含量和組分的影響

**表示差異極顯著（＜0.01）

** indicate extremely significant difference (＜0.01)

對(duì)葡萄果皮ABA含量進(jìn)行HPLC-MS分析，結(jié)果表明ABA處理顯著提高了果皮中ABA含量。在處理后18 h，ABA處理組果皮ABA含量約為對(duì)照組的1.7倍，而在處理后3 d則為對(duì)照的6.2倍（圖3）。

*和**分別表示同期處理與對(duì)照在0.05和0.01水平存在顯著性差異。下同

圖3 葡萄果皮ABA含量

2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

利用Illumina HiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)已構(gòu)建好的12個(gè)cDNA文庫進(jìn)行測(cè)序,得到4 135.2—4 852.8萬條不同數(shù)目的原始序列。數(shù)據(jù)過濾后得到4 005.4— 4 733.7萬條有效序列，有效比例96.19%—97.87%。與葡萄參考基因組比對(duì)后得到3 578.7萬—4 225.3萬條匹配的序列，比對(duì)率為94.3%—95.33%。通常質(zhì)量控制參數(shù)Q30＞80%表示轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量可靠,本試驗(yàn)中Q30＞94.3%表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量很高,可用于ABA處理后葡萄果皮差異表達(dá)基因的挖掘及對(duì)ABA促進(jìn)葡萄果實(shí)著色機(jī)制的探討（表3）。

表3 轉(zhuǎn)錄測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

將處理后18 h和處理后3 d兩個(gè)時(shí)期的ABA處理組和對(duì)照組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，分別獲得5 439和2 717個(gè)差異表達(dá)基因。在處理后18 h，共計(jì)2 897個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2 542個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；在處理后3 d，共計(jì)1 336個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1 381個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖4）。

2.4 KEGG富集分析

為了進(jìn)一步分析預(yù)測(cè)差異基因的生物功能，對(duì)ABA 18 h vs CK 18 h和ABA 3 d vs CK 3 d兩組差異基因進(jìn)行了KEGG富集分析，分別有2 529個(gè)差異基因富集到118個(gè)通路、1 335個(gè)差異基因富集到113個(gè)通路上。如圖5所示，黃酮和黃酮醇生物合成、類黃酮生物合成以及植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在兩組差異基因的KEGG分析中顯著富集。

圖4 不同時(shí)期的差異表達(dá)基因

2.5 ABA信號(hào)通路差異表達(dá)基因分析

差異表達(dá)基因在KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫中注釋分析，獲得植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（KEGGID：vvi04075）中ABA信號(hào)通路的差異基因。11個(gè)差異表達(dá)基因中有1個(gè)基因被注釋為ABA受體（PYL/PYR），5個(gè)被注釋為2C型蛋白磷酸酶（PP2C）、3個(gè)基因被注釋為SnRK2激酶、2個(gè)基因被注釋為ABRE元件結(jié)合因子（AREB/ABFs）。通過繪制熱圖對(duì)差異表達(dá)基因在兩個(gè)時(shí)期的表達(dá)水平進(jìn)一步分析（圖6），結(jié)果顯示，ABA受體基因表達(dá)水平在ABA處理后18 h上調(diào)，在ABA處理后3 d下調(diào)。除外的其他10個(gè)ABA信號(hào)通路基因表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式，與對(duì)照相比，差異基因的表達(dá)水平在ABA處理后18 h和3 d均上調(diào)。與ABA處理3 d后相比，ABA處理18 h后，表達(dá)水平較高，表達(dá)水平較低。

圖5 差異基因KEGG富集分析氣泡圖

顏色代表相應(yīng)的FPKM數(shù)值，數(shù)值越大，顏色越紅；從左到右樣本依次為CK-18 h、ABA-18 h、ABA-3 d、CK-3 d、ABA-3 d。下同

2.6 花青苷合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)

差異表達(dá)基因在KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫中注釋分析，獲得類黃酮生物合成途徑（KEGGID：vvi00941）的差異基因。5個(gè)基因被注釋為苯丙氨酸氨基裂解酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL），2個(gè)基因被注釋為肉桂酸4-羥化酶（cinnamate-4- hydroxylase，C4H），2個(gè)基因被注釋為4-香豆酰CoA連接酶（4-coumaroyl-CoA synthase，4CL），8個(gè)基因被注釋為查爾酮合酶（chalcone synthase，CHS），2個(gè)基因被注釋為查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI），1個(gè)基因被注釋為類黃酮3′-羥化酶（flavonoid- 3′-hydroxylase，F(xiàn)3′H），5個(gè)基因被注釋為F3′5′H，2個(gè)基因被注釋為黃烷酮3-羥化酶（flavanone-3- hydroxylase，F(xiàn)3H），1個(gè)基因被注釋為黃烷酮醇4-還原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR），1個(gè)基因被注釋為無色花色素雙加氧酶，6個(gè)基因被注釋為UDP葡萄糖-類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（flavonoid glucosyltransferase，UFGT）。

根據(jù)基因功能注釋，在差異基因列表中查找與花青苷修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的差異表達(dá)基因。差異基因中有6個(gè)基因與花青苷修飾有關(guān)，5個(gè)被注釋為O-甲基轉(zhuǎn)移酶（O-methyltransferase，OMT）和1個(gè)花青苷酰基轉(zhuǎn)移酶（anthocyanin acyltransferases，AAT）。此外，有11個(gè)差異基因與花青苷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，其中有6個(gè)被注釋為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）、1個(gè)被注釋為ATP結(jié)合盒亞族C（ATP binding cassette C family，ABCC）、4個(gè)被注釋為多藥和有毒化合物排出家族（multidrug and toxic compound extrusion，MATE）。

對(duì)花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因、修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析（圖7），52個(gè)差異基因均在ABA處理后表達(dá)水平上調(diào)。與ABA處理18 h后相比，18個(gè)差異基因在ABA處理3 d后表達(dá)水平較低，34個(gè)差異基因表達(dá)水平較高。值得注意的是，2個(gè)均在ABA處理18 h后表達(dá)水平最高，5個(gè)中有4個(gè)也在ABA處理18 h后表達(dá)水平最高。

圖7 花青苷積累相關(guān)基因表達(dá)模式分析

2.7 花青苷生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，參考北京大學(xué)植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB（http:// planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）公布的葡萄轉(zhuǎn)錄因子家族序列信息，共獲得296個(gè)差異轉(zhuǎn)錄因子。如圖8所示，對(duì)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行劃分，共分為40個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。含有轉(zhuǎn)錄因子最多的3個(gè)家族是MYB家族、ERF家族、NAC家族，分別含有28、23、23個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。其他含有轉(zhuǎn)錄因子較多的是WRKY、bHLH、bZIP家族，分別有21、20、17個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。

對(duì)所有差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行表達(dá)模式分析（圖8），并篩選與表達(dá)模式相似的轉(zhuǎn)錄因子。共得到14個(gè)可能與花青苷生物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，主要有MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子。也有少量的bZIP、bHLH、NAC、Dof、HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子涉及花青苷生物合成、ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆脅迫、果實(shí)成熟等多個(gè)生物代謝途徑。

2.8 差異基因啟動(dòng)子序列ABRE元件統(tǒng)計(jì)

候選差異基因啟動(dòng)子中ABA響應(yīng)元件（ABRE）數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（表4），60個(gè)差異基因的啟動(dòng)子序列中含有ABRE元件，有50個(gè)啟動(dòng)子中含有多個(gè)ABRE元件。類黃酮生物合成途徑中的32個(gè)差異基因啟動(dòng)子序列中含有ABRE元件，只有（LOC100232999）、（LOC100232843、LOC100241164）、（LOC100264341）4個(gè)基因的啟動(dòng)子序列中不含有ABRE元件。與花青苷修飾相關(guān)的7個(gè)差異基因中，只有（LOC100251744）的啟動(dòng)子序列不含ABRE元件。與花青苷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的11個(gè)差異基因中，只有3個(gè)（LOC100242506、LOC100232976、LOC100233043）的啟動(dòng)子序列中不含ABRE元件。15個(gè)可能參與調(diào)控花青苷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子序列中均含有ABRE元件。值得注意的是，與花青苷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的啟動(dòng)子中含有11個(gè)ABRE元件，調(diào)控花青苷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子中含有13個(gè)ABRE元件。

圖8 差異基因轉(zhuǎn)錄因子分析

表4 差異基因2000 bp啟動(dòng)子序列中ABRE作用元件數(shù)量統(tǒng)計(jì)

續(xù)表4 Continued table 4

2.9 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

選取6個(gè)花青苷生物合成相關(guān)基因、2個(gè)花青苷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因和4個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行qRT-PCR分析。如圖9所示，12個(gè)差異表達(dá)基因均在ABA處理后表達(dá)上調(diào)，其中、、、-處理后18 h相對(duì)表達(dá)水平最高，、、、、、、、均在處理后3 d相對(duì)表達(dá)水平最高。以上qRT-PCR結(jié)果均與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相符，說明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

圖9 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

3 討論

3.1 外源ABA處理對(duì)葡萄果皮花青苷合成的影響

前人研究表明，花青苷的含量和組分決定了葡萄著色的類型[17]。外源ABA能促進(jìn)葡萄果皮中總花青苷和花青苷單體的含量[10,18]。本研究中，外源ABA處理3 d后‘紅巴拉多’葡萄果實(shí)明顯呈現(xiàn)紅色，而清水處理的葡萄仍為綠色（圖1）。外源ABA處理增加了葡萄果皮花青苷的種類和含量，但增加的矮牽牛素3-O-葡萄糖苷、天竺葵素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷）、芍藥素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷）含量很低，因此，花青苷種類的增加可能不是葡萄迅速著色的原因。外源ABA處理后，葡萄果皮中芍藥素3-O-葡萄糖苷、錦葵色素3-O-葡萄糖苷兩種單體花青苷含量的顯著提高可能促進(jìn)了葡萄著色。

3.2 外源ABA處理對(duì)葡萄果實(shí)內(nèi)源ABA合成的影響

ABA是調(diào)控葡萄成熟的關(guān)鍵內(nèi)源激素，其含量的變化與果實(shí)成熟進(jìn)程高度相關(guān)[19]。9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）是植物體內(nèi)ABA生物合成的關(guān)鍵限速酶[20]。在葡萄果實(shí)始熟期啟動(dòng)ABA的合成，在果實(shí)成熟過程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用[21]。研究表明，外源ABA處理葡萄果實(shí)后表達(dá)迅速上調(diào)，同時(shí)內(nèi)源ABA含量增加。本試驗(yàn)qRT-PCR結(jié)果也顯示，外源ABA處理顯著上調(diào)了的表達(dá)，且在處理后18 h達(dá)到峰值。HPLC-MS分析發(fā)現(xiàn)，ABA處理后18 h和處理后3 d，內(nèi)源ABA含量均顯著增加。外源ABA可能通過激活的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)了葡萄果實(shí)中內(nèi)源ABA的合成，從而促進(jìn)了葡萄果實(shí)的花青苷積累和著色。

3.3 ABA信號(hào)通路中的差異表達(dá)基因

ABA信號(hào)通路由ABA受體（PYL/RCAR）、2C型蛋白磷酸酶（PP2C）、SnRK2激酶、ABRE元件結(jié)合因子（AREB/ABFs）組成[22]。葡萄基因組中鑒定和分離出了7個(gè)ABA受體基因，這些基因受不同非生物脅迫因子的調(diào)控[23]。研究表明參與調(diào)控葡萄果實(shí)花青苷的生物合成[12]。本研究中在ABA處理后18 h表達(dá)上調(diào)，說明可能在ABA誘導(dǎo)的花青苷積累中發(fā)揮調(diào)控作用，這與前人研究報(bào)道一致。葡萄中有兩個(gè)AREB/ABFs類基因，被命名為和[24]。其在荔枝中的同源基因s也被證明參與調(diào)控荔枝果皮花青苷生物合成過程[15]。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，和在ABA處理后兩個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)，可能其在調(diào)控花青苷生物合成方面與作用相似。共有11個(gè)ABA信號(hào)通路基因在ABA處理后表達(dá)上調(diào)，說明葡萄果實(shí)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在花青苷合成中可能具有重要作用。

3.4 花青苷生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)差異表達(dá)基因

葡萄果皮中花青苷的生物合成主要通過類黃酮通路進(jìn)行，這個(gè)過程由結(jié)構(gòu)基因所控制，調(diào)節(jié)下游各個(gè)結(jié)構(gòu)酶形成多酶復(fù)合物，進(jìn)而催化花青苷生物合成[25]。本研究有35個(gè)差異基因富集到類黃酮通路中，包括、、、、、、、、、、等11個(gè)結(jié)構(gòu)基因。ABA處理后這些結(jié)構(gòu)基因表達(dá)上調(diào)，類黃酮通路合成增加，催化了花青苷的合成。O-甲基轉(zhuǎn)移酶（OMT）和花青苷酰基轉(zhuǎn)移酶（AAT）可將花青素進(jìn)行修飾，使其更穩(wěn)定和多樣化[26-27]。差異基因中的5個(gè)和1個(gè)也在ABA處理后表達(dá)水平增加，表明ABA處理后花青苷修飾過程活躍。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、ATP 結(jié)合盒亞族C（ABCC）、多藥和有毒化合物排出家族（MATE）基因是將花青苷從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到液泡中的關(guān)鍵基因[28-30]。11個(gè)花青苷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因上調(diào)，說明ABA處理后花青苷轉(zhuǎn)運(yùn)過程增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，ABA對(duì)葡萄花青苷的影響是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及合成、修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)等多個(gè)過程。

3.5 可能調(diào)控花青苷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子

花青苷生物合成涉及許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，是調(diào)控葡萄花青苷生物合成重要的轉(zhuǎn)錄因子在自身啟動(dòng)子的作用下遺傳轉(zhuǎn)化白皮品種‘霞多麗’葡萄植株，轉(zhuǎn)基因葡萄果皮變紅，在35S啟動(dòng)子的作用下過表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株的果皮果肉均積累花青苷呈現(xiàn)黑紫色；而在黑皮品種‘西拉’葡萄中沉默后，轉(zhuǎn)基因植株果皮花青苷積累很少或不積累，呈現(xiàn)紅皮或者白皮的表型[31]。有研究表明通過激活、的啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)其表達(dá)，從而調(diào)控花色苷的合成積累[32]。功能相似或參與同一生物合成過程的轉(zhuǎn)錄因子往往表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式，因此與表達(dá)模式相近的轉(zhuǎn)錄因子可能與花青苷生物合成有關(guān)。本研究篩選得到的15個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中，6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子已被證明參與調(diào)控花青苷生物合成。、和在葡萄2號(hào)染色體上形成基因簇，和決定了葡萄是否著色以及著色類型[33]。有研究表明MYB家族成員可能正調(diào)控類黃酮的合成[34]。屬于bHLH類轉(zhuǎn)錄因子，研究證實(shí)、、、和相互作用參與調(diào)控類黃酮途徑[35]。轉(zhuǎn)錄抑制因子和負(fù)調(diào)控花青苷生物合成過程。轉(zhuǎn)錄抑制因子通過與bHLH結(jié)合或抑制和的表達(dá)負(fù)調(diào)控花青苷的合成[36]。R2R3轉(zhuǎn)錄抑制因子在煙草中過表達(dá)引起花的色素積累減少，在擬南芥中過表達(dá)下調(diào)了花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因、、的表達(dá)水平[37]。負(fù)調(diào)控花青苷生物合成的和表達(dá)水平上調(diào)，這可能是一種花青苷合成的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。研究表明，在花青苷積累過程中，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄激活子可能會(huì)上調(diào)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄抑制子的表達(dá)，從而提供反饋抑制使花青苷處于適當(dāng)?shù)乃絒38-40]。此外，還有8個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控花青苷生物合成，其中包括2個(gè)MYB（，LOC10050942；，LOC100260647）、1個(gè)NAC（，LOC104879728）、3個(gè)bZIP（，LOC100243434；，LOC100232889；，LOC100258873）、1個(gè)Dof（，LOC100265549）、1個(gè)HD-ZIP（，LOC100245524）。這些轉(zhuǎn)錄因子均在ABA處理后表達(dá)上調(diào)，在花青苷生物合成過程中的調(diào)控作用尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.6 差異表達(dá)基因啟動(dòng)子的ABRE元件分析

啟動(dòng)子是控制基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，分析啟動(dòng)子序列中的順式作用元件是了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵[41-42]。ABRE元件是一種含有G-box的保守順式作用元件，一般存在于ABA所調(diào)控基因的啟動(dòng)子中，ABA通過啟動(dòng)子區(qū)域的ABRE元件激活下游基因的表達(dá)[43]。為了研究ABA對(duì)差異表達(dá)基因的調(diào)控作用，對(duì)差異基因啟動(dòng)子進(jìn)行提取和順式作用元件分析。60個(gè)候選差異基因的啟動(dòng)子中含有ABRE元件，這些啟動(dòng)子可能是ABA誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，可在ABA信號(hào)的刺激下快速調(diào)整轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平。在先前的多個(gè)研究中，受到ABA的誘導(dǎo)而顯著上調(diào)表達(dá)[44-45]。本研究發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子序列中含有13個(gè)ABRE元件，說明可能是ABA直接調(diào)控的基因，這與前人研究相符。大多數(shù)與花青苷合成、修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)子序列中含有ABRE元件，說明它們可能是ABA誘導(dǎo)型基因。由此推測(cè)，與葡萄花青苷積累相關(guān)基因在ABA處理后轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，可能與啟動(dòng)子中ABRE元件的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)有關(guān)。外源ABA處理后，葡萄果實(shí)內(nèi)源ABA水平提高，ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活躍，激活了下游一系列與花青苷積累相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而使花青苷合成和轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)，在果皮中積累而使葡萄著色。ABA信號(hào)通路中兩個(gè)ABF轉(zhuǎn)錄因子對(duì)花青苷合成的調(diào)控作用，有待通過基因過表達(dá)技術(shù)和基因沉默技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)，其是否能夠作用于含有ABRE元件的花青苷生物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子序列，尚需酵母單雜交、雙熒光素酶報(bào)告基因等相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

ABA處理促進(jìn)葡萄果實(shí)著色明顯加深和花青苷積累，涉及11個(gè)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、52個(gè)花青苷合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因，15個(gè)MYB、bHLH、bZIP、NAC、Dof、HD-ZIP等家族的轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控花青苷的生物合成。大部分篩選到的差異基因啟動(dòng)子中含有ABRE元件，這些差異表達(dá)基因的啟動(dòng)子可能為ABA誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

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Transcriptome Analysis of Genes Involved in ABA-Induced Anthocyanin Accumulation in Grape

XU XianBin, GENG XiaoYue, LI Hui, SUN LiJuan, ZHENG Huan, TAO JianMin

College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

【】The aim of this study was to analyze the genes involved in the regulation of ABA induced grape coloring, and to explore the molecular mechanism of ABA induced anthocyanin accumulation in grape. 【】In present study, Benibalado was used as the experimental material. In the early stage of veraison, the grape clusters were treated with 300 mg·L-1ABA, water treated as control. The grape phenotypes were observed and anthocyanins were determined by UPLC-MS. The mechanism of ABA promoting anthocyanin accumulation was analyzed by transcriptome sequencing. 【】After 3 days of exogenous ABA treatment, the grape berries were obviously colored, and the variety and content of anthocyanins were also increased. Among them, Peonidin 3-O-glucoside and Malvidin 3-O-glucoside increased most significantly. By KEGG enrichment analysis, 11 DEGs related to ABA signaling and 52 DEGs that related to anthocyanin biosynthesis, and transportation were identified, all of which were up-regulated. After exogenous ABA treatment, the DEGs from RNA-seq were searched by using BLAST against the grape TF database, and 297 transcription factors were identified. Through the further analyzing of the expression patterns of identified TFs, 15 members of MYB, bHLH, bZIP, NAC, Dof, and HD-ZIP families were observed to regulate anthocyanin biosynthesis. The analyzing of cis-acting elements in promoters showed that ABREs were identified in most of the promoters. The accuracy of RNA-seq was validated by qRT-PCR analysis of some candidate genes. 【】Overall, ABA promoting anthocyanin accumulation in grape was a complex process, including 11 DEGs related to ABA signal transduction, 52 DEGs that related to anthocyanin biosynthesis, modification and transportation, 15 transcription factors. This study provided a basis for revealing the molecular mechanism of ABA promoting anthocyanin accumulation in grape fruits.

grape; anthocyanin; ABA; RNA-seq; promoter

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.01.012

2021-03-15；

2021-06-08

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-29）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31901975，31972384）、江蘇農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（JATS［2021］450）、江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項(xiàng)目（PZCZ201723）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2020YFD1000204）

徐獻(xiàn)斌，E-mail：619262966@qq.com。通信作者陶建敏，E-mail：taojianmin@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）