周繼福，王 娉，郭 佳，3，陳 穎*

（1 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 北京 100176 2 南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 南京 210023 3 天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 天津 300457）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種革蘭氏陽性、局部厭氧的短桿菌。菌株感染引起的李斯特菌病嚴重危害著人類健康[1]。輕度感染會導(dǎo)致伴有發(fā)燒、嘔吐和腹瀉的腸胃炎，而重度感染則會導(dǎo)致腦膜炎、敗血癥、腦炎和孕婦流產(chǎn)等嚴重的李斯特菌病[2]。對于李斯特菌病的治療，通常推薦β-內(nèi)酰胺類抗生素（氨芐西林和青霉素）與氨基糖苷類抗生素單獨或聯(lián)合使用[3-4]。然而，疾病治療中部分患者對青霉素的過敏反應(yīng)會造成休克或死亡[5]，對于青霉素表現(xiàn)過敏的患者，復(fù)方新諾明（Trimethoprim-sulfamethoxazole，SXT）作為常選的替代藥物被使用。此外，復(fù)方新諾明在臨床上也是治療中樞神經(jīng)退行性疾病和腦膜炎最好的口服替代藥物[6-7]。然而，抗生素的過度使用，已造成多種類食品及臨床標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)復(fù)方新諾明耐藥株。在1 份臨床和食品分離的李斯特菌耐藥性統(tǒng)計中發(fā)現(xiàn)，菌株對復(fù)方新諾明的耐藥率為40.9%，遠超慶大霉素的23.0%和青霉素的11.1%[8]。在魚類及魚加工工廠中分離的單增李斯特菌，對復(fù)方新諾明的耐藥率為47.1%[9]。從我國南京即食肉類食品中分離的33 株單增李斯特菌展現(xiàn)出100%的復(fù)方新諾明耐藥性[10]。鑒于復(fù)方新諾明在臨床上的用藥地位和極高的耐藥率，有必要探究單增李斯特菌復(fù)方新諾明相關(guān)耐藥性的形成原因。

代謝組學(xué)是一種解釋復(fù)雜生物系統(tǒng)的綜合性研究方法，主要研究菌株細胞某一時刻所有代謝產(chǎn)物的集合，獲得細胞代謝輪廓并對細胞生物學(xué)功能進行闡釋[11-12]。代謝組學(xué)技術(shù)已在一些病原菌抗生素耐藥性研究中得到應(yīng)用[13-15]。目前對于單增李斯特菌的耐藥性研究主要集中在植物提取物[16-17]和微生物多肽[18]的抗菌機制方面。Zhao 等[16]利用NMR 研究抗菌多肽和葡萄籽提取物 （Grape seed extract，GSE）對單增李斯特菌的抑菌作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用前、后，菌株的三羧酸循環(huán)（TCA）、能量代謝和氨基酸生物合成被阻斷，從而展現(xiàn)出抗菌效果，然而尚未見在單增李斯特菌抗生素耐藥性研究中應(yīng)用的報道。面對日益嚴峻的抗生素耐藥現(xiàn)狀，了解菌株受抗生素作用產(chǎn)生的細胞代謝反應(yīng)，可為藥物作用靶標(biāo)的尋找、耐藥機制研究及開發(fā)新型抗生素提供研究基礎(chǔ)。

本研究基于非靶標(biāo)代謝組學(xué)方法，利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOFMS）對菌株胞內(nèi)代謝產(chǎn)物進行分離、檢測，分析菌株代謝輪廓存在的顯著性差異，并對菌株耐藥代謝途徑進行富集分析，探究菌株代謝特征和耐藥性之間的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌株為本實驗室分離獲得，食品分離基質(zhì)包括即食食品，生、熟肉，40 株菌株信息見表1。

表1 食品分離株主要信息Table 1 Main information of L.monocytogenes

腦心浸液肉湯（Brain heart infusion，BHI）、腦心浸液瓊脂（Brain heart infusion agar，BHIA），英國OXOID 公司；甲醇（質(zhì)譜純），乙腈（質(zhì)譜純），美國Thermo Fisher 公司；甲酸，美國Honeywell 公司；Milli-Q 純水，德國默克集團；Kinetex 反相C18液相色譜柱，美國飛諾美（phenomenex）公司；聚四氟乙烯微孔過濾器，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機（D-37520），德國Osterode 公司；小型迷你臺式恒溫搖床（XHZ-03），上?？蚌蝺x器設(shè)備有限公司；超聲波清洗儀（SB5200D），寧波新芝生物科技股份有限公司；真空離心濃縮儀（Concentrator plus），德國Eppendorf 公司；四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Triple TOF 6600）、超高效液相色譜儀（ExionLC AD），美國AB SCIEX 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化和培養(yǎng) 將磁珠保藏菌株接種于BHI 培養(yǎng)基中，37 ℃下恒溫搖床培養(yǎng)16～18 h。取出后用無菌接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液劃線接種于BHIA 平板上進行二次活化培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，進行菌株藥敏試驗。取200 μL 第1 次純培養(yǎng)物，按照體積比1∶100 加到新鮮的BHI 培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，取對數(shù)生長期菌液進行胞內(nèi)代謝物提取。

1.3.2 菌株藥物敏感性試驗 使用微量肉湯稀釋法測定菌株的抗生素敏感性。陽性對照質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）。根據(jù)菌株的最小抑菌濃度 （Minimum inhibitory concentration，MIC） 值對照臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S24-2014 標(biāo)準(zhǔn)對菌株耐藥性進行判讀[19]（表2），當(dāng)質(zhì)控菌株藥敏結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)時，認為藥敏試驗結(jié)果真實可靠。

表2 臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所復(fù)方新諾明M100-S24-2014 標(biāo)準(zhǔn)Table 2 M100-S24-2014 standard of institute of clinical laboratory standardization

1.3.3 菌株淬滅及代謝產(chǎn)物的提取、濃縮 菌株胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的提取參照Singh 等[20]的方法，略作修改。試驗中，加入40%冷甲醇水（4 ℃）淬滅溶液的體積為1.5 mL；室溫下在細胞碎片中加入無菌超純水的體積為1.5 mL，其余步驟參照文獻[20]進行。真空離心濃縮儀用于菌株胞內(nèi)代謝物的離心濃縮，對旋干后的濃縮產(chǎn)物加入100 μL 超純水進行復(fù)溶。渦旋混勻后的胞內(nèi)代謝產(chǎn)物用0.22 μm聚四氟乙烯微孔過濾器過濾。將樣品置于帶有內(nèi)襯管的螺紋口自動進樣瓶中，-80 ℃保存。每個菌株樣品做4 次生物學(xué)平行試驗。每個樣本取同等體積 （10 μL） 代謝提取物混勻，作為質(zhì)量控制（Quality control，QC）樣品，對試驗儀器的穩(wěn)定性和重復(fù)性進行監(jiān)測。

1.3.4 非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析 采用超高效液相色譜系統(tǒng)（ExionLC AD，AB SCIEX）對菌株胞內(nèi)代謝產(chǎn)物進行分離。色譜柱使用C18 反相色譜柱（2.6 μm，100 A，100 mm×2.1 mm）。液相色譜系統(tǒng)參數(shù)設(shè)定：流動相：A 相：含0.1%甲酸的水溶液；B相：含0.1%甲酸的乙腈溶液。流動相使用前進行超聲脫氣。流動相洗脫梯度如表3所示，色譜柱溫度40 ℃，進樣量3 μL。

表3 流動相洗脫梯度Table 3 Mobile phase elution gradient

胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的檢測采用聯(lián)用電噴霧電離（ESI）的四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Triple TOF 6600），分別在正、負離子電離模式下采集數(shù)據(jù)。使用全掃（Full-Scan）和信息依賴掃描模式（Informa-tion dependent acquisition，IDA），動態(tài)背景扣除（DBS），對一級、二級譜圖進行采集。離子源參數(shù)設(shè)定：正離子模式下的噴霧電壓（Ion spray voltage floating，ISVF），5 000 V；負離子模式下的噴霧電壓（ISVF），-4 500 V。一級質(zhì)譜的掃描范圍m/z 100～1 000，保留時間0.250 s；二級質(zhì)譜掃描范圍m/z 50～1 000，保留時間0.05 s，模式選用高分辨模式（High resolution），碰撞電壓（Collision energy，CE）為35 eV，碰撞能量疊加（Collision energy spread，CES）為15 eV。為保證高分辨質(zhì)譜在數(shù)據(jù)采集過程中的高質(zhì)量靈敏度，使用自動校準(zhǔn)裝置系統(tǒng)（Calibration device system，CDS）加注專用CDS 校準(zhǔn)液用于系統(tǒng)校正[21]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 數(shù)據(jù)處理和分析 使用MarkerView 1.3.1軟件（AB SCIEX）實現(xiàn)對所有進樣樣品的峰檢測、峰比對、峰積分和數(shù)據(jù)歸一化等數(shù)據(jù)預(yù)處理。利用SIMCA15.0.2 軟件對預(yù)處理的矩陣數(shù)據(jù)進行化學(xué)計量學(xué)分析，分析中權(quán)重（Weighting）設(shè)為佩爾托標(biāo)度（Pareto scaling，par）、轉(zhuǎn)化（Transformation）為log 轉(zhuǎn)化。試驗建立有監(jiān)督的正交偏最小二乘分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）模型。模型的擬合參數(shù)（R2Y 和Q2）用于直觀評判模型的質(zhì)量，當(dāng)R2Y 和Q2值大于0.9 時，認為建立的模型有非常優(yōu)秀的可靠性和預(yù)測度。參數(shù)R2和Q2的差值最好處于0.2～0.3之間。試驗中使用置換檢驗?zāi)Ｊ綄δＰ瓦M行檢驗，模型參數(shù)直觀表示為R2的截距小于0.3 并接近于0，Q2的截距小于0.05[22]。

1.4.2 差異代謝物的定性 差異化合物的篩選遵循單維變量統(tǒng)計分析和多維變量統(tǒng)計分析相結(jié)合的方式。使用SIMCA 軟件建立OPLS-DA 模型，根據(jù)模型輸出變量重要性投影值 （Variable importance in projection，VIP），結(jié)合顯著性統(tǒng)計值進行潛在差異化合物的篩選。試驗中設(shè)定的差異化合物定性標(biāo)準(zhǔn)為“VIP≥1.5 & P ＜0.05”。潛在差異化合物的初步篩選使用PeakView 2.2 軟件（AB SCIEX）中的Formular Finder 插件，選擇質(zhì)量誤差在±5×10-6u 以內(nèi)的化學(xué)式進行數(shù)據(jù)庫檢索和物質(zhì)鑒定。差異化合物的對比確證使用人類代謝組數(shù)據(jù)庫（Human metabolome database，HMDB）（http：//www.hmdb.ca）、MassBank（https：//massbank.eu/MassBank） 和在線軟件MS-DIAL（http：//prime.psc.riken.jp/compms/msdial/ main.html）[23-24]。

1.4.3 差異代謝物可視化分析和代謝通路分析GraphPad Prism 8.0.2.（263）軟件用于差異化合物火山圖繪制。MetaboAnalyst 5.0 在線數(shù)據(jù)處理軟件 （https：//www.metaboanalyst.ca） 中的Statistical Analysis 模塊用于差異化合物層次聚類分析，軟件的Pathway Analysis 模塊結(jié)合京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）（https：//www.kegg.jp）用于代謝通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株藥物敏感性試驗

基于CLSI 判別標(biāo)準(zhǔn)，對40 株單增李斯特菌進行9 種常見抗生素藥物敏感性測定。測定結(jié)果（表4）表明：所有菌株對慶大霉素、氨芐西林、青霉素、萬古霉素、紅霉素、利福平、四環(huán)素等7 種抗生素均表現(xiàn)為敏感。菌株對復(fù)方新諾明和環(huán)丙沙星有耐藥現(xiàn)象，耐藥率分別為30%（12/40）和100%（40/40）。單增李斯特菌對環(huán)丙沙星的耐藥分析研究將在其它試驗中開展。

表4 單增李斯特菌常見抗生素藥敏性結(jié)果Table 4 Results of drug sensitivity to common antibiotics of L.monocytogenes

（續(xù)表4）

2.2 化學(xué)計量學(xué)分析

基于UPLC-QTOF-MS，在正、負離子模式下對單增李斯特菌胞內(nèi)代謝產(chǎn)物進行分離、檢測。在MarkerView 軟件輸出的數(shù)據(jù)矩陣中，選擇單同位素峰用于后續(xù)化學(xué)計量化學(xué)分析。根據(jù)總離子流圖結(jié)果（圖1），正、負離子模式下Markerview 軟件峰提取時間分別設(shè)置為0.6～5.0 min 和0.6～6.0 min。在正、負離子模式下，分別獲得3 795 個和4 174 個峰，化學(xué)計量學(xué)中用這些峰來說明SXT耐藥株和敏感株的差異代謝特征[25]。

圖1 SXT 耐藥株和敏感株的UPLC-QTOF-MS 總離子流圖Fig.1 UPLC-QTOF-MS total ion chromatogram of SXT-resistant strains and sensitive strains

使用SIMCA 軟件進行化學(xué)計量學(xué)分析。根據(jù)菌株復(fù)方新諾明藥敏試驗結(jié)果，將試驗菌株分為SXT 耐藥株和敏感株，根據(jù)分組建立OPLS-DA 模型。如OPLS-DA 得分圖所示（圖2a，3a），SXT 耐藥株和敏感株的樣本點距離較遠，并有明顯的聚集趨勢，說明耐藥株和敏感株在代謝輪廓上存在差異。為直觀表示模型擬合程度，OPLS-DA 在正、負離子模式下的擬合參數(shù)分別為：正離子模式下，R2Y=0.991；Q2=0.981，負離子模式下，R2Y=0.992；Q2=0.988，2 種電離模式下的模型參數(shù)指標(biāo)均接近于1，說明模型OPLS-DA 具備很強的解釋和預(yù)測能力，能有效區(qū)分SXT 耐藥株和敏感株。

圖2 正離子模式下SXT 耐藥株和敏感株OPLS-DA 得分圖（a）及置換檢驗圖（b）Fig.2 OPLS-DA score plot （a） and permutation test （b） of SXT-resistant strains and sensitive strains in positive ion mode

圖3 負離子模式下SXT 耐藥株和敏感株OPLS-DA 得分圖（a）及置換檢驗圖（b）Fig.3 OPLS-DA score plot （a） and permutation test （b） of SXT-resistant strains and sensitive strains in negative ion mode

為驗證建立的OPLS-DA 模型的預(yù)測能力和解釋能力，選擇置換檢驗進行驗證。200 次迭代循環(huán)的置換檢驗結(jié)果如圖2b 和3b 所示，正、負離子模式下的原始模型Q2檢驗結(jié)果分別為-0.385 和-0.397，數(shù)值均小于0.05。這說明建立的OPLS-DA模型能夠用于單增李斯特菌復(fù)方新諾明耐藥株和敏感株的鑒別，試驗數(shù)據(jù)可用于菌株代謝特征分析。

2.3 差異化合物分析

根據(jù)差異化合物篩選標(biāo)準(zhǔn)實現(xiàn)潛在差異化合物的篩選。通過查閱相關(guān)文獻和HMDB 對化合物的描述，最終確定耐藥SXT 菌株和敏感株的胞內(nèi)差異化合物有21 種（表5）。耐藥前、后的化合物變化顯著，主要以氨基酸、核苷和核苷酸為主。比較耐藥株和敏感株的差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）值發(fā)現(xiàn)，相比于敏感株，耐藥株中包括4-氨基丁酸、亮氨酸和色氨酸在內(nèi)的14 種化合物表現(xiàn)為上調(diào)【log2（FC）＞0】，而腺苷二磷酸核糖和4-羥基肉桂酸等7 種物質(zhì)表現(xiàn)為下調(diào)【log2（FC）＜0】。根據(jù)VIP 值分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸類物質(zhì)的VIP 值更大，說明菌株受到SXT 作用產(chǎn)生耐藥性后，氨基酸類物質(zhì)的變化更為明顯，更能表現(xiàn)SXT 耐藥株和敏感株間的差異（圖4）。

圖4 復(fù)方新諾明耐藥株和敏感株差異代謝物火山圖Fig.4 Volcano map of the differential metabolites between SXT-resistant and sensitive strains

表5 復(fù)方新諾明耐藥株和敏感株差異化合物信息表Table 5 Overview of differential compounds in L.monocytogenes SXT-resistant and sensitive strains

為表示差異化合物豐度水平在SXT 耐藥株和敏感株之間的聚類程度，采用聚類熱圖進行可視化分析。如圖5所示，R SXT 和S SXT 分別代表SXT 耐藥株和SXT 敏感株。聚類結(jié)果表明40株單增李斯特菌被明顯地區(qū)分為2 簇，說明代謝組學(xué)數(shù)據(jù)可將SXT 耐藥株和敏感株區(qū)分開。熱圖中色標(biāo)（2 至-2）表示SXT 作用菌株后細胞內(nèi)差異化合物代謝水平由高到低的變化趨勢。根據(jù)色標(biāo)值的變化，包括亮氨酸、異亮氨酸、4-氨基丁酸、鳥苷、尿苷二磷酸葡萄糖和尿苷二磷酸半乳糖等15種化合物在SXT 耐藥株中有較高的代謝水平，相反，這些物質(zhì)在敏感株中的代謝水平較低。明顯的代謝物豐度差異表明差異化合物可用于后續(xù)耐藥株和敏感株的代謝通路富集分析[26]。

圖5 SXT 耐藥株和敏感株差異代謝產(chǎn)物熱圖Fig.5 Heatmap of differential metabolites between SXT-resistant strains and sensitive strains

2.4 差異代謝通路研究

為確定菌株受到復(fù)方新諾明作用產(chǎn)生耐藥性前、后的相關(guān)代謝通路，基于KEGG 數(shù)據(jù)庫結(jié)合Metaboanalyst 軟件對定性的差異化合物進行代謝通路富集分析。分析發(fā)現(xiàn)，SXT 耐藥株和敏感株的代謝途徑一共有19 條（表6）。其中含2 個或2 個以上差異化合物的代謝途徑有6 條，通過歸類分析發(fā)現(xiàn)，6 條代謝途徑分為氨基酸代謝（2 條）、碳水化合物代謝（2 條）、核苷酸代謝（1 條）和遺傳信息的處理、翻譯（1 條）。與差異化合物相關(guān)的主要代謝途徑如圖6a 所示。

表6 SXT 耐藥株和敏感株代謝通路富集結(jié)果Table 6 Enrichment results of metabolic pathways of SXT-resistant strains and sensitive strains

為分析SXT 引起菌株耐藥性和敏感性的顯著性差異代謝途徑和重要代謝途徑，根據(jù)P＜0.05篩選耐藥株和敏感株的顯著性差異代謝途徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別屬于核苷酸代謝和遺傳信息處理、翻譯的嘌呤代謝（a）和氨酰基tRNA 生物合成（b）代謝途徑。根據(jù)響應(yīng)值（Impact）≥0.10 篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受到SXT 作用嚴重影響的4 條代謝途徑，分別為核黃素代謝（c），氨基糖和核苷酸糖代謝（d），甘油磷脂代謝（e），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（f），歸類表明代謝途徑分別屬于氨基酸代謝、碳水化合物代謝和脂質(zhì)代謝。根據(jù)代謝途徑在代謝通路中的相關(guān)關(guān)系設(shè)定圖6b 的代謝網(wǎng)絡(luò)。

圖6 SXT 耐藥株和敏感株代謝通路富集分析Fig.6 Enrichment analysis of metabolic pathways of SXT-resistant strains and sensitive strains

3 結(jié)論與討論

本文基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用的非靶標(biāo)代謝組學(xué)技術(shù)，研究單增李斯特菌復(fù)方新諾明耐藥株和敏感株之間的代謝物差異。據(jù)文獻報道，復(fù)方新諾明作用時細菌的二氫蝶呤合成酶和四氫葉酸的生物合成受阻，進而抑制核酸、蛋白質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致細菌生長繁殖障礙[27]。試驗中，差異化合物在代謝途徑中的調(diào)控變化表明：在氨?；鵷RNA 的生物合成途徑中，亮氨酸和色氨酸在SXT 耐藥株中表達上調(diào)，而亮氨酸用于維持細胞滲透穩(wěn)定，這說明菌株細胞難以抵抗SXT 的作用而生存菌株的抗性因亮氨酸的上調(diào)而降低[28-29]。色氨酸能夠提高細胞氧化活性，菌株可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激來增強抗性。腺苷用于酸化激活氨基酸，產(chǎn)生的氨?；偎徂D(zhuǎn)移至核糖核酸，從而生成氨?；鵷RNA[30]。試驗中鑒定的核苷酸類化合物（如腺苷）在SXT 耐藥株中表現(xiàn)為下調(diào)，這說明菌株受SXT 作用后，菌株的能量供應(yīng)和氨基酸生物合成受到影響。甘油磷脂作為微生物細胞的膜脂類物質(zhì)，控制著細胞的調(diào)控轉(zhuǎn)運、蛋白功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[31]。試驗中菌株在SXT 作用下，菌株細胞的甘油磷酸膽堿表達下調(diào)，說明SXT對細胞的作用使得細胞調(diào)控轉(zhuǎn)運、蛋白功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生變化，從而影響菌株對抗生素的耐藥性[32]。此外，試驗分離的單增李斯特菌株對環(huán)丙沙星的耐藥性非常高，值得關(guān)注，將在后續(xù)研究中分析。