盧瑞雪，韓延超，陳杭君，房祥軍，吳偉杰，劉瑞玲，穆宏磊，郜海燕

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點實驗室浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點實驗室 中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點實驗室 杭州 310021）

小青菜屬于白菜的一個亞種，又稱小白菜、小油菜等，是易腐性綠葉蔬菜的代表，采后2 d 開始變黃，常溫貯藏時間極短。目前大多采用低溫、氣調(diào)等方法貯藏，然而設(shè)備費用高[1]。近些年，綠色蔬菜的攝入量與食品安全性越來越受到重視，而褪黑素是所有植物都具有的一種內(nèi)源吲哚胺，其安全性毋庸置疑。關(guān)于小青菜的保鮮，有低溫、氣調(diào)冷庫、涂膜保鮮等。徐靜等[2]研究表明，將小青菜于0.1%植酸、20 mg/L 細胞分裂素中浸泡，可延長其貯藏時間。袁海娜等[3]發(fā)現(xiàn)熱水處理小青菜可延長貯藏時間。沈連清等[4]研究表明，氣調(diào)包裝可延長小青菜的貯藏期。

褪黑素（Melatonin，MT）是生物體可自身合成的一種化合物，在體內(nèi)可代謝，因此不會在體內(nèi)蓄積，褪黑素存在于許多常見的水果和蔬菜中，如番茄、蘋果、草莓等[5-6]。植物的生長[7]和衰老[8]等離不開褪黑素，植物的生長調(diào)節(jié)、自由基清除[9]等也離不開褪黑素。Tan 等[10]發(fā)現(xiàn)MT 通過抑制ABFs 介導(dǎo)的脫落酸生物合成和葉綠素降解，延緩菜心葉片衰老。1 mmol/L 褪黑素可延緩大麥葉片葉綠素降解[11]。吳燕等[12]發(fā)現(xiàn)外源MT 能增強栝樓雌花抗氧化酶活性等。王蓉等[13]研究發(fā)現(xiàn)MT 可延緩梔子葉片衰老。Gao 等[14]研究表明，MT 可減慢桃果實采后衰老。高帆等[15]研究表明，施加MT 能有效提高獼猴桃幼苗抗氧化能力。有研究表明從食物中攝入植物中的褪黑素在一定程度上可以預(yù)防阿爾茨海默病[16]，由此可見其安全性是毋庸置疑的。將褪黑素用于小青菜保鮮，尚未見報道。因此，本試驗擬通過研究不同MT 處理對小青菜的色澤、失重率、黃化率以及葉綠素、維生素C、糖酸、抗氧化酶活含量的影響，篩選出保鮮效果較合適的MT 處理濃度，為延長小青菜采后貯藏期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本文選用‘上海青’品種小青菜為試驗材料，2019年4月購買自江蘇省南通市通州灣蔬菜基地。小青菜按照新鮮、大小均一、無機械損傷、無病蟲害[17]等要求挑選。

試劑：丙酮、三氯乙酸、抗壞血酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、3.5-二硝基水楊酸、結(jié)晶酚、冰醋酸、無水醋酸鈉、亞硫酸鈉、葡萄糖、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮、TritonX-100、愈創(chuàng)木酚、無水乙醇、過氧化氫、磷酸、鄰苯二酚、褪黑素，上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R-400 手持色差儀，日本SEMSING；5430 R臺式高速離心機，德國Eppendorf 生命科學公司；Spark 多功能酶標儀，瑞士Tecan 公司；877 Metrohm 自動電位滴定儀，瑞士萬通公司；LB20T糖度計，廣州市速為電子科技有限公司。

1.3 試驗方法

小青菜在處理前在自來水中漂洗，去除雜質(zhì)等。將小青菜分別用0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L 褪黑素浸泡3 min，對照組采用同體積清水浸泡，室溫晾干。為模擬小青菜采后貯藏條件，選擇60 顆小青菜，用PE 袋（0.06 mm）進行包裝，每袋4 顆小青菜，20 ℃恒溫箱貯藏，間隔2 d 取樣，測定小青菜品質(zhì)指標。

1.4 品質(zhì)指標測定

色澤的測定：采用CR-400 手持色差儀。

失重率的測定：采用稱重法。

失重率（%）=（小青菜的初始質(zhì)量-小青菜貯藏一段時間后的質(zhì)量）/小青菜的初始質(zhì)量×100

黃化率的測定：參考徐靜等[2]方法，根據(jù)小青菜葉片黃化面積劃分為5 級。

0 級，無黃化；1 級，S黃化＜10%；2 級，10%＜S黃化＜25%；3 級，25%＜S黃化＜40%；4 級，S黃化＞40%，公式如下：

黃化指數(shù)=∑（黃化級別×該級別葉片數(shù)）/調(diào)查總?cè)~片數(shù)

維生素C 含量的測定：采用韓延超等[18]測定方法。

葉綠素含量的測定：采用曹建康等[19]測定方法。

可溶性固形物的測定：采用便攜式阿貝折光儀測量。

還原糖含量：采用3，5-二硝基水楊酸法[19]。

過氧化物酶（POD）活性測定：采用愈創(chuàng)木酚法測定[19]。

多酚氧化酶（PPO）活性測定：采用比色法測定[19]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

GraphPad Prism 5 進行數(shù)據(jù)處理和繪圖，SPSS 22.0 中的鄧肯多重比較進行顯著性差異分析，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對小青菜色澤的影響

L*值代表小青菜亮度，L*值越大表明顏色越亮。小青菜葉綠素降解導(dǎo)致黃化，因此小青菜葉片L*值呈不斷上升的趨勢。由圖1a 可知，第6 天開始，0.2，0.4，0.6 mmol/L MT 處理組延緩了L*值上升，并且與對照組之間具有顯著差異（P<0.05）。其中，0.6 mmol/L MT 處理組L*值比對照組和0.2，0.4，0.8 mmol/L 處理組低，L*值最低。

圖1 不同濃度褪黑素對小青菜色澤的影響Fig.1 Effects of different concentrations of melatonin on color of Brassica chinensis L.

a*值表示小青菜紅綠水平，負值小表示葉片呈綠色強。由圖1b 可知，小青菜a*值持續(xù)上升，說明小青菜葉片綠色在減弱。對照組的a*值一直高于褪黑素處理組，且對照組與0.2，0.4，0.6 mmol/L MT 處理組差異顯著（P < 0.05），其中0.6 mmol/L MT 處理組a*值上升最為緩慢。說明0.6 mmol/L MT 能有效延緩a*值上升。

b*值代表小青菜的藍黃水平，數(shù)值大表示小青菜葉片黃化嚴重。由圖1c 可知，b*值總體呈上升趨勢。貯藏第4 天后，0.4，0.6 mmol/L MT 處理組與對照組差異顯著（P<0.05），延緩了b*值上升，而0.6 mmol/L MT 處理組的b*值總體偏低，說明濃度為0.6 mmol/L 的褪黑素處理組效果較好，可延緩b*值上升。

2.2 褪黑素對小青菜失重率的影響

葉類蔬菜貯藏品質(zhì)可體現(xiàn)在失重率的高低。由圖2可知，失重率總體呈上升狀態(tài)。其中，0.6 mmol/L MT 處理組的失重率顯著低于對照組和0.2，0.4，0.8 mmol/L MT 處理組，貯藏期間0.6 mmol/L MT 處理組的失重率上升最平緩，失重率最低。第8 天時，0.2 mmol/L 和0.4 mmol/L MT 處理組之間差異不顯著，而0.2 mmol/L 和0.4 mmol/L MT 處理組與對照組和0.6，0.8 mmol/L 處理組差異顯著（P<0.05）。說明0.6 mmol/L MT 處理能有效控制新鮮小青菜在采后貯藏過程中水分的喪失。

圖2 不同濃度褪黑素對小青菜的失重率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of melatonin on weight loss rate of Brassica chinensis L.

2.3 褪黑素對小青菜黃化率和葉綠素的影響

黃化率可以衡量綠色蔬菜品質(zhì)。由圖3a 可知，貯藏期間，黃化率呈上升趨勢，不同濃度褪黑素處理后黃化率變化不同。在這些處理組中，0.6 mmol/L MT 處理組黃化率上升最為緩慢，且黃化率最低，顯著低于其它處理組。這說明0.6 mmol/L MT 處理可有效延緩其黃化速率，延長食用期。

由圖3b 可知，小青菜葉綠素含量不斷下降。隨著貯藏時間的延長，0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L MT處理組的小青菜葉綠素含量都顯著高于對照組（P<0.05），貯藏第8 天，0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L 處理組葉綠素含量分別為0.24953，0.3989，0.56884，0.31264 mg/g，分別下降至初始值的16.64%，26.59%，37.92%，20.84%，說明不同濃度褪黑素處理組均能不同程度抑制葉綠素的降解。其中0.6 mmol/L MT 處理組的小青菜葉綠素含量相對較高。

圖3 不同濃度褪黑素對小青菜的黃化率和葉綠素的影響Fig.3 Effects of different concentrations of melatonin on yellowing rate and chlorophyll content of Brassica chinensis L.

2.4 褪黑素對小青菜維生素C 的影響

由圖4可知，貯藏期間，小青菜VC 含量不斷下降。0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L MT 處理組的小青菜葉綠素含量都顯著高于對照組（P ＜0.05）。0.4 mmol/L MT 處理組貯藏第8 天下降至初始值的72.41%，0.8 mmol/L MT 處理組貯藏第8 天下降至初始值的58.62%。相比之下，0.6 mmol/L MT 條件下VC 含量下降的最緩慢，貯藏第8 天下降至初始值的83.45%?？梢?，褪黑素處理VC 含量高于對照組，其中褪黑素濃度為0.6 mmol/L 的處理組效果較明顯。

圖4 不同濃度褪黑素對小青菜的維生素C 的影響Fig.4 Effects of different concentrations of melatonin on vitamin C content of Brassica chinensis L.

2.5 褪黑素對小青菜可溶性固形物和還原糖的影響

可溶性固形物（Total soluble solid，TSS）主要是糖、礦物鹽類、色素等可溶于水的物質(zhì)，可反映蔬菜采后品質(zhì)的變化。由圖5a 可知，TSS 連續(xù)下降。2～4 d 可溶性固形物下降較明顯，第6 天開始下降相對較緩慢，對照組和0.8 mmol/L MT 可溶性固形物下降最為迅速，然而褪黑素濃度為0.6 mmol/L 的處理組變化最遲緩。

由圖5b 可知，貯藏第2 天還原糖含量均開始降低，這是由于小青菜貯藏期間進行呼吸代謝，消耗糖類物質(zhì)。對照組還原糖含量由貯藏前的0.69%降至貯藏結(jié)束時的0.20%，而0.6 mmol/L MT 處理組則由0.69%降至貯藏結(jié)束時的0.28%。在整個貯藏過程中，0.6 mmol/L MT 處理組還原糖含量顯著高于0.2，0.4，0.8 mmol/L MT 處理組與對照組（P ＜0.05），表明0.6 mmol/L MT 處理減緩還原糖的降解效果較好。

圖5 不同濃度褪黑素對小青菜可溶性固形物和還原糖的影響Fig.5 Effects of different concentrations of melatonin on TSS and reducing sugar of Brassica chinensis L.

2.6 褪黑素對小青菜抗氧化酶活性的影響

過氧化物酶（POD）可以反映小青菜組織老化的程度，可減少小青菜中自由基的蓄積[20]。由圖6a可知，POD 在貯藏0～4 d 時上升緩慢，4～8 d 上升明顯。0.2，0.4，0.6 mmol/L 褪黑素處理組POD 活性均高于對照組。其中，0.6 mmol/L MT 處理組與對照組之間始終具有顯著性差異（P ＜0.05）。貯藏末期，0.6 mmol/L MT 處理組POD 活性是初期的1.34 倍，貯藏末期對照組POD 活性是初期的1.59倍。表明在小青菜貯藏過程中的衰老與POD 存在一定關(guān)系，0.6 mmol/L MT 處理在一定程度上延緩了小青菜的衰老。

多酚氧化酶（PPO）是一種關(guān)鍵的氧化酶[21]，小青菜的黃化與PPO 有關(guān)[22]。由圖6b 可知，PPO 活性不斷上升。MT 處理后PPO 活性不低于對照組。對照組的PPO 活性在第8 天時是貯藏初期的4.10 倍；0.6 mmol/L MT 處理組在第8 天達到活性高峰，貯藏結(jié)束時PPO 活性是貯藏初期的3.30倍；貯藏8 d 時，0.6 mmol/L MT 處理組PPO 活性是對照組的1.24 倍。0.6 mmol/L MT 處理PPO 活性最高并且與對照組差異顯著（P ＜0.05）。小青菜貯藏過程中的衰老與PPO 存在一定關(guān)系，通過激活PPO 活性，能夠在一定水平上延遲小青菜的衰老進程，其中0.6 mmol/L MT 效果較好。

圖6 褪黑素對小青菜POD 和PPO 的影響Fig.6 Effects of melatonin on POD and PPO activity of Brassica chinensis L.

3 討論與結(jié)論

綠葉蔬菜色澤變化與黃化率和葉綠素含量密切相關(guān)。有報道外源MT 可減慢葉片[23]、青花菜[24]、小麥葉片[25]葉綠素的降解。本研究選用褪黑素浸泡采后小青菜，在室溫條件下貯藏。與對照組相比，0.6 mmol/L 的MT 處理能夠保持相對較好的色澤，延緩了黃化的發(fā)生以及葉綠素含量的減少，維持小青菜較好的外觀品質(zhì)，顯著延緩小青菜的衰老。Tan 等[26]使用100 μmol/L 的MT 浸泡菜心延緩了葉綠素的降解。賈志偉等[27]采用100 mg/L 的MT處理菜心，第9 天時處理組葉綠素含量是對照組的2.08 倍。范海霞等[28]用200 μmol/L 的MT 處理牡丹幼苗葉片發(fā)現(xiàn)可提高光合色素含量。Ahmad 等[29]用100 μmol/L 的MT 噴施玉米苗，葉綠素含量提高80.4%。本研究褪黑素濃度處理稍高于一部分研究，分析可能是因為有些試驗材料為水培，葉片較為脆嫩，耐受性較低，所以褪黑素處理濃度低，而本研究的小青菜為土培，耐受性較水培大，所以褪黑素處理濃度稍高一些，然而也有與本研究濃度相似的，蒲玉瑾等[30]發(fā)現(xiàn)600 μmol/L 外源MT 處理降香黃檀幼苗總?cè)~綠素含量最高，促進生長效果最佳。綜合分析，蔬菜保鮮的褪黑素溶液濃度大致范圍為100～600 μmol/L。

小青菜含有70%～90%的水分，鮮嫩可口，含多種營養(yǎng)素，如維生素C、礦物質(zhì)、糖、有機酸、粗纖維等，其中蔬菜供應(yīng)人體攝入維生素C 的90%。Zahed 等[31]每周噴施褪黑素對草莓果實的可溶性固形物、總酸度、維生素C 和糖類都有較好的影響；Miao 等[32]采用褪黑素處理西蘭花，維持了較高的維生素C 含量。新鮮切好的西蘭花用褪黑素溶液浸泡也顯著提高了抗壞血酸含量[33]。本研究也得到了相似的結(jié)果，褪黑素處理使其保持了較高水平的TSS、還原糖和VC 含量，使小青菜營養(yǎng)品質(zhì)較好。

除此之外，MT 激活了POD 和PPO，這與Li等[34]采用MT 處理茶樹葉片時，發(fā)現(xiàn)MT 處理也顯著提高超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶的活性來提高其抗氧化能力的研究結(jié)果相類似。張俊康等[35]噴施外源MT 可顯著提高軟棗獼猴桃的抗氧化酶活性與本研究得到了相似結(jié)果。Liang 等[36]采用褪黑素處理獼猴桃，發(fā)現(xiàn)MT 在保護獼猴桃的抗氧化系統(tǒng)方面效果顯著。Shang 等[37]發(fā)現(xiàn)褪黑素處理還可顯著促進藍莓中抗氧化酶的活性。賈樂等[38]發(fā)現(xiàn)褪黑素處理可保持香菇較好的貯藏品質(zhì)，降低活性氧代謝產(chǎn)物生成速率，提高機體的抗氧化能力。對于常溫貯藏小青菜葉綠素降解途徑中的一些酶及其代謝產(chǎn)物還未探索，有待深入研究。本研究結(jié)果為今后在小青菜采后貯藏保鮮過程中褪黑素濃度的選擇與設(shè)計提供了參考。