王洲 付燕 王莉

(1西南民族大學(xué)，四川 成都 610041；2四川省人民醫(yī)院)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是軟骨細(xì)胞和基質(zhì)退行性改變的一種骨關(guān)節(jié)疾病，主要以關(guān)節(jié)疼痛、積液滲出、活動(dòng)受限為主要的臨床特點(diǎn)〔1～3〕。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期大強(qiáng)度訓(xùn)練會(huì)增加OA風(fēng)險(xiǎn)，運(yùn)動(dòng)員在大強(qiáng)度訓(xùn)練時(shí)引起的骨關(guān)節(jié)炎，不僅影響競(jìng)技狀態(tài)及比賽成績(jī)，甚至?xí)霈F(xiàn)關(guān)節(jié)畸形或致殘〔4〕。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)內(nèi)合成分泌的重要細(xì)胞，能夠調(diào)控關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，當(dāng)關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境紊亂時(shí)，軟骨細(xì)胞識(shí)別異常作出應(yīng)答，調(diào)整細(xì)胞外基質(zhì)的合成，保持關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定〔5〕。Wnt/β-catenin是機(jī)體內(nèi)重要的信號(hào)通路，廣泛參與多種細(xì)胞的生命活動(dòng)，如組織分化、損傷再生、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境維持、抗應(yīng)激損傷等〔6〕。研究表明Wnt/β-catenin通路的激活影響軟骨細(xì)胞的增殖、分化、移行，在維持骨關(guān)節(jié)的正常結(jié)構(gòu)、修復(fù)損傷過(guò)程中Wnt/β-catenin通路起重要的作用〔7〕。阿魏酸(FA)是從植物細(xì)胞壁提取的低毒、多酚類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗血栓、抗炎癥、抗血脂等作用，具有強(qiáng)大的抗炎、修復(fù)、治療作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域和食品領(lǐng)域〔8〕。本研究從Wnt/β-catenin信號(hào)通路入手探討FA對(duì)OA軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料及主要試劑 FA、Ⅱ型膠原酶購(gòu)自Sigma公司；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原抗體購(gòu)自武漢博士生物工程有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自廣東銳博生物科技技術(shù)股份有限公司；兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)13、兔抗大鼠wnt2、兔抗大鼠磷酸化GSK-3p(p-GSK-3p)、Ser9抗體、兔抗β-catenin、兔抗GAPDH及山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠，大鼠體重(210±20)g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2003-1-003。大鼠進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。室溫20～23℃，相對(duì)濕度45%～50%，光照時(shí)間為12 h/d。參照隨機(jī)數(shù)字表分為空白組、模型組、低劑量組、高劑量組。

空白組給予1 ml生理鹽水腹腔注射后安靜休息；模型組腹腔注射1 ml生理鹽水，1 h后將大鼠放在(32±1)℃水溫的桶內(nèi)，進(jìn)行一次尾部負(fù)重3%體重重物的游泳力竭運(yùn)動(dòng)；低劑量組腹腔注射FA溶液(5 μmol/ml)，1 h后進(jìn)行1次力竭運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)方式同模型組；高劑量組腹腔注射FA溶液(20 μmol/ml)，1 h后進(jìn)行1次力竭運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)方式同模型組。參考Thomas等〔9〕力竭標(biāo)準(zhǔn)：大鼠連續(xù)沉入水中超過(guò)10 s不能浮出或大鼠無(wú)法協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)且伴隨無(wú)方向性亂竄，以存活大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。本研究中動(dòng)物處置方法均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定 從各組大鼠膝蓋中取軟骨細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，37℃消化30 min，棄去胰蛋白酶，加入DMEM培養(yǎng)基過(guò)夜，1 200 r/min離心10 min，棄上清，加入DMEM培養(yǎng)基混勻，置于37℃恒溫箱中，37℃，5%CO2培養(yǎng)傳代。鑒定：細(xì)胞制成爬片，二甲苯和梯度乙醇脫蠟后置于檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行修復(fù)，以充分暴露抗原決定簇。3%的過(guò)氧化氫室溫下浸泡10 min，封閉，分別加稀釋好的一抗4℃過(guò)夜孵育，次日沖洗干凈，加入適量生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，清洗。加適量二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)作用2～5 min后用去離子水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染1.5～2 min，清洗后于梯度乙醇中脫水，二甲苯浸泡并干燥后用中性樹(shù)膠封片，鏡檢觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4透射電鏡觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化 取膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨組織(大小1 mm×1 mm×1 mm)，使用2.5%戊二醛，于4℃下固定6 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗30 min，1%鋨酸固定1 h。參考文獻(xiàn)方法〔10〕進(jìn)行乙醇梯度脫水、純環(huán)氧樹(shù)脂包埋及烘干固化。采用LKB-NOVA型切片機(jī)進(jìn)行超薄切片(片厚70 nm)，蒸餾水沖洗后，分別放入醋酸鈾飽和水溶液和枸櫞酸鉛染液中染色30 min，蒸餾水反復(fù)清洗后，干燥，最后用日產(chǎn)JEM-1230型透射電鏡觀察攝片。

1.5CCK-8法檢測(cè)軟骨細(xì)胞的增殖率 取對(duì)數(shù)期的軟骨細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，取100 μl加入96孔板中，加入DMEM培養(yǎng)基放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，將FA分別稀釋到80、40、20、10、5 μg/ml、每孔加入10 mg/ml的CCK-8溶液，5%CO2培養(yǎng)4 h，棄去CCK-8溶液，加入200 μl DMSO溶液，震蕩10 min，使其完全溶解，全自動(dòng)酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IGF-1和PGE2濃度 取各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

1.7蛋白免疫印跡檢測(cè)MMP13、Wnt2、p-GSK-3p、β-catenin、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的表達(dá) 加入細(xì)胞裂解液，冰上放置20～30 min，超聲裂解30 s，12 000 r/min，4℃離心10 min，收集上清，置于-20℃保存。BCA定量法檢測(cè)蛋白濃度，待測(cè)樣品和上樣緩沖液混合，100℃水域變性5 min，然后加入制備好的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，濃縮膠時(shí)調(diào)整電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結(jié)束后取出凝膠，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h，加入一抗，4℃過(guò)夜，TBST洗膜后加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h。加入電化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影，采用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH作為內(nèi)參，分析蛋白水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，制圖采用Graphpad5.01軟件。

2 結(jié) 果

2.1各組軟骨細(xì)胞對(duì)比及鑒定 空白組軟骨細(xì)胞基質(zhì)呈淺棕色、排列整齊，著色均勻，而細(xì)胞核無(wú)著色；模型組軟骨細(xì)胞基質(zhì)著色深，出現(xiàn)嚴(yán)重變形或排列紊亂，孔隙不均勻增大，細(xì)胞核均著色；與模型組相比，低劑量組及高劑量組軟骨細(xì)胞基質(zhì)著色較淺，部分細(xì)胞核著色，尤其是高劑量組改善明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 空白組軟骨細(xì)胞和模型組OA軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(DAB，×200)

2.2FA對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠OA軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 空白組軟骨細(xì)胞呈卵圓形，細(xì)胞膜及細(xì)胞核完整，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)完整線(xiàn)粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體；模型組細(xì)胞大部分呈現(xiàn)腫脹狀態(tài)，細(xì)胞核形態(tài)異常，胞質(zhì)內(nèi)脂滴增多，線(xiàn)粒體數(shù)目明顯減少，大部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度擴(kuò)張，部分溶解斷裂；低劑量組軟骨細(xì)胞部分呈現(xiàn)腫脹形態(tài)，細(xì)胞質(zhì)空泡化，可見(jiàn)脂滴，線(xiàn)粒體數(shù)目減少，且明顯變形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯；高劑量組軟骨細(xì)胞少部分腫脹，細(xì)胞核基本正常，線(xiàn)粒體空泡化，線(xiàn)粒體嵴較模糊，可見(jiàn)輕度擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。見(jiàn)圖2。

圖2 FA對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠OA軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響(×20 000)

2.3FA對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠OA軟骨細(xì)胞增殖的影響 模型組軟骨細(xì)胞增殖率(19.6%)顯著低于空白組(98.5%)，低劑量組(52.6%)、高劑量組軟骨細(xì)胞增殖率(75.1%)顯著高于模型組，且高劑量組軟骨細(xì)胞的增殖水平更高(均P<0.05)。

2.3FA對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠OA軟骨細(xì)胞IGF-1和PGE2水平的影響 模型組IGF-1水平明顯低于空白組，而低劑量組和高劑量組IGF-1水平明顯高于模型組(P<0.05)。模型組PGE2水平明顯高于空白組，而低劑量組和高劑量組PGE2水平明顯低于模型組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 FA對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞IGF-1和PGE2水平的影響

2.4FA對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠OA軟骨細(xì)胞MMP13表達(dá)的影響 模型組MMP13蛋白表達(dá)(3.85±0.41)明顯高于空白組(1.04±0.08，P<0.05)，而低劑量組(2.82±0.33)和高劑量組IGF-1水平(2.05±0.18)明顯低于模型組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 Western印跡檢測(cè)MMP13蛋白表達(dá)

2.5FA對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠OA軟骨細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的影響 與空白組相比，模型組Bcl-2明顯降低，Bax顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組、高劑量組Bcl-2明顯升高，Bax明顯降低(P<0.05)，且高劑量組的變化更明顯(P<0.05)，見(jiàn)圖4，表2。

圖4 FA對(duì)LPS誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的影響

表2 細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2和Bax相對(duì)表達(dá)量

2.6FA對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠OA軟骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，模型組Wnt2、p-GSK-3β、β-catenin水平明顯升高，與模型組比較，低劑量組、高劑量組wnt2、p-GSK-3β、β-catenin水平明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)A呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖5，表3。

圖5 FA LPS誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量

3 討 論

OA是一種常見(jiàn)的關(guān)節(jié)軟骨病變，以繼發(fā)性骨質(zhì)增生為主要病理表現(xiàn)，致病原因多為過(guò)度勞損、衰老損傷、先天關(guān)節(jié)畸形等原因?qū)е玛P(guān)節(jié)軟骨破壞、關(guān)節(jié)間隙狹窄、滑膜增生等〔11〕。文獻(xiàn)報(bào)道〔12〕稱(chēng)OA最先出現(xiàn)骨細(xì)胞增殖障礙，細(xì)胞活性降低，隨著病情的發(fā)展會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)細(xì)胞壞死，最終引起骨關(guān)節(jié)代謝性增生。FA具有降血脂、抗血栓、抗氧化等生物活性，能夠減少機(jī)體合成IL-1β，提高機(jī)體超氧化歧化酶的活性，減少丙二醛的含量緩解OA患者的臨床癥狀，對(duì)OA引發(fā)并發(fā)癥具有良好的改善作用〔13〕。本研究結(jié)果說(shuō)明FA具有保護(hù)OA軟骨細(xì)胞的功能。IGF-1作為軟骨細(xì)胞合成因子，在促進(jìn)細(xì)胞生存代謝過(guò)程中起著重要作用，其分泌減少和OA發(fā)生密切相關(guān)。PGE2是骨關(guān)節(jié)炎促炎癥因子和分解代謝介質(zhì)，文獻(xiàn)報(bào)道〔14，15〕稱(chēng)其能夠促進(jìn)MMPs的合成，MMP13是由軟骨細(xì)胞合成分泌的一種膠原酶，主要溶解Ⅱ型膠原蛋白，發(fā)生OA時(shí)，細(xì)胞碎片上調(diào)MMP13的表達(dá)，阻礙Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)，加速骨蛋白的多糖的流失，使軟骨細(xì)胞遭受損害。本研究結(jié)果說(shuō)明FA能夠抑制MMP13表達(dá)和PGE2水平來(lái)保護(hù)骨關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)。細(xì)胞Bax作為促凋亡基因，主要通過(guò)與線(xiàn)粒體結(jié)合，促進(jìn)其釋放促凋亡蛋白誘導(dǎo)凋亡，而B(niǎo)cl-2則會(huì)阻止Bax與線(xiàn)粒體結(jié)合，從而抑制細(xì)胞凋亡〔16〕，本研究結(jié)果提示FA能夠抑制軟骨細(xì)胞的凋亡。

文獻(xiàn)報(bào)道〔17〕稱(chēng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路與骨細(xì)胞的移行、黏附、分化、骨關(guān)節(jié)正常生長(zhǎng)、損傷修復(fù)過(guò)程有關(guān)，該信號(hào)通路激活會(huì)加重OA的發(fā)展，經(jīng)典的β-catenin信號(hào)通路活化表現(xiàn)為β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并移向細(xì)胞核，與T細(xì)胞核因子和淋巴增強(qiáng)因子共同作用，啟動(dòng)Wnt下游轉(zhuǎn)錄。研究表明〔18〕GSK-3β能夠促進(jìn)β-catenin的降解，在多種腫瘤模型中已經(jīng)證實(shí)抑制GSK-3β能夠促進(jìn)β-catenin信號(hào)通路激活。研究人員〔19〕將新型沒(méi)食子酸作用于軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該沒(méi)食子酸能激活Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示大強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)構(gòu)建OA模型后，Wnt2、β-catenin水平明顯升高，且促進(jìn)了GSK-3β的磷酸化，從而提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路參與了OA的發(fā)生發(fā)展，采用FA處理后，Wnt2、β-catenin及p-GSK-3p水平明顯降低，說(shuō)明FA可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，起到保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用。