賈鑫林 毛遠(yuǎn)青

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)已被廣泛用于治療終末期關(guān)節(jié)疾病，如嚴(yán)重創(chuàng)傷、骨關(guān)節(jié)炎和股骨頭壞死等[1,2]。當(dāng)前制約人工關(guān)節(jié)置換術(shù)中遠(yuǎn)期臨床效果的主要問題仍是假體無菌性松動，但造成假體無菌性松動的病理機制尚不明確。目前大量研究證實，假體表面的磨損顆粒會激活局部的破骨細(xì)胞，促進(jìn)其分化成熟和功能亢進(jìn)，同時磨損顆粒會抑制成骨細(xì)胞的分化和成骨作用，最終引起假體周圍骨重建失衡和骨溶解，導(dǎo)致假體無菌性松動[3～10]。因此，如果能在早期阻斷磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解，則能夠有效避免關(guān)節(jié)翻修術(shù)產(chǎn)生的并發(fā)癥多、失敗率高等問題，同時還能有效減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，避免二次手術(shù)所造成的患者心理創(chuàng)傷。

去亞甲基小檗堿(demethyleneberberine，DMB)是一種從中藥黃柏中提取的異喹啉生物堿，具有抗炎、抗纖維化、抗氧化等多種藥理活性[11～13]。既往研究表明，其是一種天然的線粒體靶向抗氧化劑，可以抑制酒精性肝病模型中的氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和脂肪變性、減輕小鼠炎癥性腸病等作用[14～16]。然而DMB對破骨細(xì)胞分化的影響鮮見報道。因此，本研究通過巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)和核因子-κB受體激活因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)刺激C57BL/6小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(bone marrow derived macrophages，BMMs)向破骨細(xì)胞分化成熟，并以此為基礎(chǔ)探討DMB在小鼠BMMs細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中的作用，同時通過建立鈦(Ti)顆粒誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠顱骨骨溶解動物模型探究DMB對骨溶解的影響。

材料與方法

1.實驗試劑：DMB(批號：25459-91-0)購自上海藍(lán)木化工有限公司；細(xì)胞因子M-CSF、RANKL購自美國R&D Systems公司；Ti顆粒購自美國Johnson Matthey公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo Molecular Technology公司；TRAP染色試劑盒、Trizol試劑購自美國Sigma-Aldrich公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Master Mix、qPCR試劑盒SYBR PreMix Ex Taq Kit購自日本TaKaRa公司；NFATc1、TRAP、CTSK、C-Fos、Dc-stamp、GAPDH引物購自生工生物(上海)股份有限公司。

2.實驗動物與分組：4～6周齡雄性C57BL/6小鼠，購自上海市實驗動物中心西普爾-必凱實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2013-0016；使用許可證號：SYXK(滬)2018-0026]。小鼠飼養(yǎng)及動物實驗均在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動物中心進(jìn)行，動物實驗方案通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審批(倫理審批號：SH9H-2020-A434-1)。將20只6～8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為4組(每組5只)。小鼠腹腔注射舒泰(65mg/kg)與鹽酸賽拉嗪(10mg/kg)麻醉。備皮后，將小鼠固定于手術(shù)臺，在顱骨正中矢狀縫處切開皮膚，切口長約1cm，以人字縫與矢狀縫的交點為原點，暴露1.0cm×1.0cm面積的顱骨外膜，使用刀片刮去顱骨外骨膜后，在假手術(shù)組的顱骨表面注射100μl的無菌0.9% NaCl溶液后關(guān)閉切口，在Ti顆粒組、Ti顆粒+低劑量組(1mg/kg DMB)(簡稱低劑量組)、Ti顆粒+高劑量組(10mg/kg DMB)(簡稱高劑量組)的小鼠顱骨表面，將30mg無菌Ti顆粒懸液緩慢均勻滴散在顱骨表面后縫合傷口。根據(jù)產(chǎn)品說明書，將DMB重新懸浮在DMSO中，直到完全溶解，然后在磷酸鹽緩沖液中稀釋。低劑量組和高劑量組小鼠按照隔日1次，腹腔注射相應(yīng)濃度的DMB，連續(xù)2周，其余各組均注射相同劑量的0.9%NaCl溶液。2周后對動物進(jìn)行安樂死，取出顱骨固定，用于后續(xù)實驗分析。

3.微計算機斷層掃描(micro computed tomography，Micro-CT)：用4%甲醛固定48h后，仔細(xì)清除顱骨表面殘留的鈦顆粒，避免在Micro-CT掃描過程中出現(xiàn)金屬偽影。各組顱骨樣本分別進(jìn)行Micro-CT掃描，設(shè)定參數(shù)X線能量分別設(shè)置成 80kV及80mA，掃描厚度設(shè)置成 9μm，曝光時間設(shè)置到100ms。將掃描所得到的二維斷層圖像導(dǎo)出。使用NRecom 對二維斷層圖像進(jìn)行三維重建，確定范圍為以矢狀縫、人字縫的交點為中心，半徑5mm進(jìn)行進(jìn)一步的定量分析。用CT Analyser軟件(SkyScan)測量骨密度(bone mineral density，BMD，mg/cc)和每個樣本的骨體積與組織體積的比值百分比(BV/TV)。

4.細(xì)胞提取與誘導(dǎo)分化：取4～6周齡C57BL/6小鼠，安樂死后浸泡在75%乙醇溶液中消毒20min。隨后分離小鼠的股骨和脛骨，剪斷干骺端后，使用1ml注射器吸取細(xì)胞培養(yǎng)基反復(fù)沖洗股骨和脛骨的骨髓腔。將沖洗獲得的含有骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)基離心后，使用含有30ng/ml的M-CSF完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，期間更換培養(yǎng)液1次，所得的貼壁細(xì)胞即為原代BMMs細(xì)胞。

5.細(xì)胞毒性分析：將BMMs細(xì)胞按照1×104個/孔的密度種植于96孔板中，在孔中加入含有不同濃度的DMB的培養(yǎng)基(0、5、10、15、20、30、40、50μmol/L)進(jìn)行一定時間的培養(yǎng)。分別于48、96h后，吸除孔中的培養(yǎng)基，每孔加入100μl含有10%CCK-8試劑的無血清培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)箱中內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2h，隨后使用酶標(biāo)儀檢測在450nm波長下孔內(nèi)的吸光度(A)值。

6.抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色：將培養(yǎng)得到的BMMs細(xì)胞利用胰酶消化后重懸、計數(shù)，按照每孔8×103個/孔的密度接種于96孔板中，使用含有30ng/ml的M-CSF完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。24h后，使用含有30ng/ml的M-CSF和50ng/ml的RANKL的完全培養(yǎng)基，并添加不同濃度的DMB(0、10、20、40μmol/L)，培養(yǎng)5天進(jìn)行鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)空白對照組內(nèi)的BMMs細(xì)胞融合成為多核巨細(xì)胞時，使用TRAP染色試劑盒進(jìn)行染色。具體染色方法為：吸除96孔板內(nèi)殘留的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液清洗3次充分取出殘留的培養(yǎng)基；隨后每孔加入30μl的4%多聚甲醛，于室溫下固定細(xì)胞10min；10min后吸除孔內(nèi)的固定液，并使用磷酸鹽緩沖液清洗3次，去除孔內(nèi)殘留的固定液；按照TRAP染色試劑盒，每孔加入100μl染色液，在避光條加下37℃恒溫箱中孵育2h；2h后吸除染色液，再次使用磷酸鹽緩沖液清洗3次。最后，于光學(xué)顯微鏡下觀察統(tǒng)計，細(xì)胞核≥3個的即為TRAP染色陽性細(xì)胞。

7.實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測：將重懸計數(shù)獲得的BMMs細(xì)胞，按照1×105個/孔的密度種植于6孔板中，加入含有不同濃度的DMB破骨細(xì)胞誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基(30ng/ml的M-CSF和50ng/ml的RANKL)，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5天，提取RNA。提取方法：首先吸除6孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，并用磷酸鹽緩沖液清洗3次，隨后每孔加入1ml 的Trizol裂解液，用移液槍反復(fù)吹打孔中細(xì)胞，并放置于冰上再充分裂解5min；將充分裂解的樣品轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管中，加入0.2ml的氯仿，漩渦震蕩混勻15秒，室溫放置2～3min；按照4℃、12000×g條件，離心15min后，吸取上清，加入0.5ml異丙醇混合均勻，隨后4℃、12000×g條件下，離心15min，舍棄上清液；加入75%乙醇，4℃、7500×g條件下，離心5min，棄上清，靜置5min；每個離心管中加入20μl的DEPC水溶解RNA；最后用微量核酸濃度測定儀來測定RNA的濃度和純度，A260/A280在1.8～2.0為最佳。隨后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(37℃ 15min；70℃ 10min)，得到cDNA。使用cDNA與破骨分化相關(guān)基因引物(NFATc1、TRAP、CTSK、C-Fos、Dc-stamp)進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并使用GADPH作為內(nèi)參基因。引物序列如下：TRAP上游引物：5′-CTGGAGTGCACGATGCCAGCGACA-3′，下游引物：5′-TCCGTGCTCGGCGATGGACCAGA-3′；NFATc1上游引物：5′-CCGTTGCTTCCAGAAAA-TAACA-3′，下游引物：5′-TGTGGGATGTGAACTCGGAA-3′；C-Fos上游引物：5′-CCAGTCAAGAGCATCAGCAA-3′，下游引物：5′-AAGTAGTGCAGCCCGGAGTA-3′;CTSK上游引物：5′-CTTCCAATACGTGCAGCAGA-3′，下游引物：5′-TCTTCAGGGCTTTCTCGTTC-3′;Dc-stamp上游引物：5′-GTGGAGAGCAAGGAACCCAA-3′，下游引物：5′-TCAGACACACTGAGACGTGG-3′；GAPDH上游引物：5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游引物5：′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′。

8.統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行作圖，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.DMB在Ti顆粒誘導(dǎo)的骨溶解中的治療作用：Micro-CT三維重建圖像顯示(圖1A)，假手術(shù)組小鼠顱骨表面光滑無侵蝕，而Ti顆粒組，小鼠顱骨被廣泛侵蝕，甚至部分骨連接中斷。而低劑量組和高劑量組小鼠顱骨表面侵蝕逐漸減輕。此外，與假手術(shù)組比較，Ti顆粒組骨密度和BV/TV百分比顯著降低(圖1B和圖1C)，低劑量組和高劑量組小鼠顱骨的骨密度、BV/TV百分比均有提高(圖1B和圖1C)。由此可知DMB能夠抑制Ti顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨骨溶解。

圖1 Ti顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解Micro-CT掃描三維結(jié)果A.Micro-CT三維重建圖像；B.骨密度結(jié)果;C.BV/TV的百分比。*P<0.001

2.DMB對BMMs細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性：CCK-8檢測結(jié)果表明，DMB對BMMs細(xì)胞的增殖無明顯的抑制作用。雖然在48h(圖2A)的CCK-8檢測結(jié)果DMB在濃度為40、50μmol/L對BMMs細(xì)胞有輕微毒性，但72h和96h(圖2中B和C)檢測結(jié)果表明，DMB濃度在50μmol/L以下不會對BMMs細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，因此DMB也不會在破骨細(xì)胞分化成熟過程產(chǎn)生干擾。

圖2 CCK-8檢測DMB對BMMs的細(xì)胞毒性A.48h破骨細(xì)胞吸光度值;B.72h破骨細(xì)胞吸光度值;C.96h破骨細(xì)胞吸光度值。與0μmol/L組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3.DMB體外抑制BMMs細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化：BMMs細(xì)胞在M-CSF和RANKL的誘導(dǎo)下能夠分化并融合成為破骨細(xì)胞，表現(xiàn)為TRAP染色陽性(圖3 A)。然而在DMB的作用下，BMMs細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程被明顯抑制，具體表現(xiàn)為TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)目減少和破骨細(xì)胞面積百分比降低，并且這一抑制作用隨著DMB濃度的提高而增強(圖3)。值得注意的是，DMB 不僅在低濃度下對破骨細(xì)胞分化有抑制作用，在高濃度下(40μmol/L)DMB對破骨細(xì)胞分化抑制作用顯著增強，TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)量和面積都顯著性下降(P<0.001，圖3)。因此，根據(jù)TRAP染色結(jié)果可以得出，DMB能夠有效抑制破骨細(xì)胞的分化成熟。

圖3 不同濃度DMB下BMMs細(xì)胞TRAP染色A.0μmol/L DMB；B.10μmol/L DMB；C.20μmol/L DMB；D.40μmol/L DMB；E.每孔破骨細(xì)胞數(shù)量； F.每孔破骨細(xì)胞面積百分比。與0μmol/L組比較，*P<0.01，**P<0.001

4.DMB體外抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)：破骨細(xì)胞相關(guān)基因的上調(diào)在破骨細(xì)胞分化過程中起著重要作用。為了進(jìn)一步評估DMB對破骨細(xì)胞生成的影響，筆者探究DMB能否抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，包括NFATc1、C-Fos、TRAP、CTSK和Dc-Stamp。熒光定量PCR結(jié)果顯示，在RANKL刺激后，上述相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量升高。然而，RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞相關(guān)基因的作用被DMB以劑量依賴的方式明顯抑制(圖4)，這與TRAP染色結(jié)果一致，表明DMB在體外對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)具有抑制作用。

圖4 BMMs在RANKL和不同濃度的DMB誘導(dǎo)后的相關(guān)基因表達(dá)情況A.C-Fos mRNA；B.CTSK mRNA；C.NFATc1mRNA；D.Dc-Stamp mRNA；E.TRAP mRNA。與DMB 0μmol/L組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

討 論

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療終末期關(guān)節(jié)疾病的有效方法[1]。然而，繼發(fā)于假體周圍骨溶解(peri-implant osteolysis，PIO)的無菌性松動是人工關(guān)節(jié)置換失敗的主要原因[2～4]。雖然植入物的設(shè)計和材料已有很大改進(jìn)，但并不能有效減少假體植入后磨粒顆粒的產(chǎn)生。相關(guān)研究證實，磨損顆粒引起的局部炎性反應(yīng)會激活假體周圍的破骨細(xì)胞，促進(jìn)其分化成熟和功能增強，進(jìn)而導(dǎo)致假體周圍骨溶解增加[17, 18]。因此，抑制破骨細(xì)胞的功能是治療假體周圍骨溶解的有效手段。目前，許多已知的能夠抑制破骨細(xì)胞功能的藥物，如雙膦酸鹽，雷尼酸鍶和紅霉素，已被證明可緩解磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解[19]。然而這些藥物會造成許多不良反應(yīng)，如發(fā)熱、胃潰瘍、下頜骨壞死等，同時由于上述藥物生物利用度的局限性，阻礙了它們長期用于PIO的治療。DMB作為一種從中藥黃柏中提取的異喹啉生物堿，已被證實具有良好的抗炎和抗氧化作用[20]。鑒于此，筆者認(rèn)為DMB能夠通過其抗炎作用抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化成熟和骨溶解。

本研究通過提取C57BL/6小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞，利用M-CSF誘導(dǎo)其分化為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，并在RANKL的作用下誘導(dǎo)其分化為成熟的破骨細(xì)胞，隨后利用DMB研究其對破骨細(xì)胞分化影響，并通過腹腔注射不同劑量的DMB研究其對Ti顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨的骨溶解抑制作用。CCK-8實驗結(jié)果表明DMB具有良好的生物相容性，對小鼠BMMs細(xì)胞無明顯的毒性不良反應(yīng)。通過TRAP染色結(jié)果表明，DMB能夠明顯抑制破骨細(xì)胞的分化和破骨細(xì)胞數(shù)目，并且隨著DMB使用濃度的提高，這一抑制作用明顯增強。隨后通過RT-qPCR進(jìn)一步驗證了DMB能夠抑制破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，從而表面DMB能夠從基因水平上抑制破骨細(xì)胞分化。最后，通過體內(nèi)建立Ti顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨骨溶解模型，在使用不同劑量的DMB治療2周后，Micro-CT掃描及分析結(jié)果證明DMB能夠抑制Ti顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨骨溶解。綜合以上結(jié)果，證明DMB能夠抑制破骨細(xì)胞分化和Ti顆粒誘導(dǎo)的骨溶解。

綜上所述，骨代謝是破骨細(xì)胞性骨吸收和成骨細(xì)胞性骨形成之間的平衡，骨形成在治療骨溶解方面也起著重要作用。目前尚未探索DMB對成骨細(xì)胞是否存在一定的作用，進(jìn)而影響骨形成，這些將在未來的研究中予以進(jìn)一步探索。本研究只初步探索了DMB對破骨細(xì)胞的抑制作用，其抑制破骨細(xì)胞的具體機制有待于進(jìn)一步研究，期待其能夠在未來成為治療骨關(guān)節(jié)疾病的一種新型中藥藥物。