楊迷玲 楊金花 王 娜 徐憲偉 姜海波 郝義彬

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響人類健康[1]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素參與的過程，遺傳和環(huán)境因素是其發(fā)病機(jī)制的重要因素[2]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在包括胃癌在內(nèi)的上皮性惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。EMT是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，在細(xì)胞信號因子的刺激下上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)的改變使細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。有研究報(bào)道，Versican高表達(dá)與胃癌患者的生存相關(guān)，但是和胃癌患者的生存有兩種觀點(diǎn)， Versican與胃癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系尚未見報(bào)道[3,4]。因此，本研究運(yùn)用免疫組化和qRT-PCR檢測胃癌組織中Versican與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的表達(dá)，分析它們之間的相關(guān)性及與臨床病理特征的關(guān)系，并進(jìn)一步分析Versican蛋白表達(dá)對胃癌患者生存期的影響。

材料與方法

1.臨床資料：選取鄭州人民醫(yī)院病理科2012年1月～2016年12月病理診斷為胃癌的石蠟標(biāo)本167例，其中男性123例，女性44例，患者年齡25～88歲。按照WHO分類標(biāo)準(zhǔn)，高-中分化者76例，低-未分化者91例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期86例，Ⅲ～Ⅳ期81例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者94例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者73例；按1965年Lauren分型，腸型90例，彌漫型77例。同時(shí)收集相應(yīng)的癌旁正常胃黏膜組織(距腫瘤切緣>5cm)作為對照組。有完整5年隨訪資料的患者120例，患者無病生存期從手術(shù)之日開始計(jì)算，終止日期為腫瘤復(fù)發(fā)日期或末次隨訪日期。選取其中30例新鮮胃癌組織和相應(yīng)的癌旁胃黏膜組織于-196℃液氮保存，用于qRT-PCR檢測。所有病例術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療。本研究所有標(biāo)本的使用均經(jīng)患者知情同意，并通過鄭州人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批(倫理審批號：2018L02009)。

2.主要試劑：濃縮型兔抗人多克隆抗體Versican(克隆號：ab19345)購自英國Abcam公司；鼠抗人單克隆抗體E-cadherin和N-cadherin及ElivisionTM染色試劑盒均購自福州邁新公司；qRT-PCR檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司；引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0設(shè)計(jì)。

3.免疫組織化學(xué)：組織標(biāo)本由10%甲醛溶液固定，取材，脫水，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片、烤片、脫蠟并水化，采用枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓修復(fù)，然后用免疫組織化學(xué)EliVision法染色。免疫組化操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)，脫水，透明，封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。

4.免疫組化結(jié)果判定：所有指標(biāo)的結(jié)果均由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生經(jīng)雙盲法獨(dú)立評估。Versican的陽性著色為癌細(xì)胞周圍的癌相關(guān)纖維母細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色。參照文獻(xiàn)[5]的判定標(biāo)準(zhǔn)，據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量判定分為3個(gè)等級：弱陽性為1級；中等陽性為2級；強(qiáng)陽性為3級。根據(jù)間質(zhì)陽性細(xì)胞的百分比判定：0～100%，然后根據(jù)平均百分比(30%)及染色強(qiáng)度綜合判定：間質(zhì)陽性細(xì)胞數(shù)<30%且染色強(qiáng)度為強(qiáng)陽性判定為低表達(dá)，間質(zhì)陽性細(xì)胞數(shù)≥30%且染色強(qiáng)度為強(qiáng)陽性判定高表達(dá)。E-cadherin主要表達(dá)于細(xì)胞膜，>50%的細(xì)胞呈棕黃色顆粒定義為陽性； N-cadherin表達(dá)于細(xì)胞膜，>10%的細(xì)胞呈棕黃色顆粒定義為陽性。

5.qRT-PCR檢測：總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR擴(kuò)增，分析數(shù)據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在PCR儀上96孔板中進(jìn)行，重復(fù)做3次平行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)中的Ct值數(shù)據(jù)的采用校正的閾值設(shè)定，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量。β-actin正向引物：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反向引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′；Versican正向引物：5′-CAAGCTGCTGGCAAGTGATG-3′，反向引物：5′-GCCGCCCTGTAGTGAAACAC-3′；E-cadherin正向引物：5′-AAAGAGCCCTTACTGCCCCC-3′，反向引物：5′-TGTGCAGCTGGCTCAAGTCA-3′；N-cadherin正向引物：5′-CTGCAGCAGCCTGACACTGT-3′，反向引物：5′-CAGATCGGACCGGATACTGG-3′。

結(jié) 果

1.Versican、E-cadherin和N-cadherin蛋白在癌旁胃黏膜和胃癌中的表達(dá)：Versican在癌旁正常胃黏膜中的陽性率為19.76%(33/167)，顯著低于在胃癌組織中的陽性率為72.46%(121/167，χ2=61.084，P=0.000)。Versican主要表達(dá)于胃癌細(xì)胞周圍的癌相關(guān)纖維母細(xì)胞的胞質(zhì)。E-cadherin在胃癌及癌旁胃黏膜組織中主要定位于細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒狀，胃癌中E-cadherin的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁胃黏膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.066，P=0.002)。N-cadherin在胃癌及癌旁胃黏膜組織中主要表達(dá)于細(xì)胞膜，棕黃色顆粒狀，胃癌中N-cadherin的陽性率明顯高于癌旁胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.365，P=0.037，圖1、表1)。

圖1 Versican、E-cadherin和N-cadherin在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)(免疫組化染色，×100)A～C.癌旁組織; D～F.胃癌組織

表1 胃癌和癌旁胃黏膜組織中Versican、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)[n(%)]

2.Versican、E-cadherin和N-cadherin mRNA在癌旁胃黏膜和胃癌中的表達(dá)：胃癌中Versican和N-cadherin mRNA的表達(dá)水平顯著高于癌旁胃黏膜(P<0.001)，E-cadherin mRNA的表達(dá)水平顯著低于癌旁胃黏膜(P<0.001，圖2)。

圖2 胃癌組織及癌旁組織中Versican、E-cadherin和N-cadherin mRNA的相對表達(dá)水平

3.Versican、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)與胃癌各臨床病理參數(shù)的關(guān)系：Versican蛋白在低-未分化胃癌中的表達(dá)顯著高于高-中分化胃癌，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期，浸潤深度達(dá)漿膜及淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)Versican的表達(dá)增加(P均<0.05)。E-cadherin蛋白的表達(dá)與胃癌的Lauren分型、分化程度、浸潤深度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)，即隨著胃癌浸潤深度的加深、臨床分期的進(jìn)展及淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)，E-cadherin蛋白的表達(dá)逐漸減少，在低-未分化組的表達(dá)率低于高-中分化組，在彌漫型胃癌中的表達(dá)率低于腸型胃癌。N-cadherin在胃癌組織中與胃癌的Lauren分型、浸潤深度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)，當(dāng)胃癌浸潤深度達(dá)漿膜，臨床分期達(dá)Ⅲ、Ⅳ期及淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)，N-cadherin蛋白的表達(dá)逐漸增加，詳見表2。

表2 Versican、E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)與167例胃癌各臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

4.胃癌組織中Versican與E-cadherin和N-cadherin之間的相關(guān)性分析：Spearman等級相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Versican的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.638，P=0.000)，Versican的表達(dá)與N-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.313，P=0.000，表3)。

表3 胃癌中Versican與E-cadherin和N-cadherin的Spearman相關(guān)性分析(n)

5.胃癌組織中Versican蛋白的表達(dá)與患者生存期的關(guān)系：有5年完整隨訪資料的120例胃癌患者的無病生存率為54.2%(65/120)。Versican蛋白高表達(dá)者的無病生存率49.2%(32/65)低于Versican低表達(dá)者60.0%(33/55)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rank=8.805，P=0.003，圖3)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果顯示，Versican高表達(dá)(Wald=8.552，P=0.003)是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表4)。

表4 胃癌患者多因素生存分析(n=120)

圖3 胃癌組織中Versican蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的Kaplan-Meier生存曲線

討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境相互作用的過程，腫瘤的微環(huán)境包括各種細(xì)胞群、細(xì)胞外基質(zhì)、激素、生長因子等。在腫瘤微環(huán)境中，細(xì)胞外基質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能。多功能蛋白聚糖(Versican)屬于蛋白聚糖家族，是一種硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPG)，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，是腫瘤微環(huán)境的必要成分，Versican由3個(gè)不同的區(qū)域組成，有5個(gè)亞單位，不同的亞單位有不同的功能[6]。Versican在胚胎發(fā)育和疾病發(fā)展中起重要作用，在細(xì)胞的黏附、增殖、遷移和血管生成中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[7～9]。Versican在腫瘤的進(jìn)展中起重要作用，在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，包括上皮源性腫瘤和間葉源性腫瘤[10～14]。

有人通過基因檢測研究認(rèn)為，與正常胃黏膜比較，Versican在胃癌中高表達(dá)，高表達(dá)的Versican與胃癌患者的不良預(yù)后有關(guān)[3]。本研究分別采用RT-PCR法和免疫組織化學(xué)法在基因水平和蛋白水平上均證實(shí)了Versican在胃癌組織中表達(dá)升高，與上述研究結(jié)果一致。免疫組化結(jié)果顯示，Versican蛋白在胃癌的間質(zhì)纖維母細(xì)胞中高表達(dá)，且其表達(dá)水平在分化程度越低、臨床分期越晚、淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)越高，說明Versican與胃癌的進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。在膀胱癌和葡萄膜黑色素瘤中Versican mRNA高表達(dá)，并且Versican mRNA高表達(dá)者患者預(yù)后不良[11,12]。在食管鱗癌間質(zhì)纖維母細(xì)胞中高表達(dá)的Versican與患者的無病生存率有關(guān)，是食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[13]。本研究運(yùn)用Kaplan-Meier分析顯示，Versican高表達(dá)者患者的無病生存率低于低表達(dá)者，COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析顯示Versican高表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移與胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT有關(guān)。EMT是上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的現(xiàn)象。在這個(gè)過程中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，上皮細(xì)胞的特性和行為受到抑制，同時(shí)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)上調(diào)，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特點(diǎn)，細(xì)胞變成梭形，運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，因此，EMT是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制之一[15,16]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中Versican和N-cadherin的陽性率顯著高于正常胃黏膜，而E-cadherin的陽性率則顯著低于正常胃黏膜，并且均與分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明Versican、E-cadherin和N-cadherin共同參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn)，Versican在乳腺癌、肝細(xì)胞癌和白血病中表達(dá)均升高，并且可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而促進(jìn)腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移[17～19]。本研究通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)Versican與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與N-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)，表明胃癌中高表達(dá)的Versican可能通過使胃癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，失去上皮細(xì)胞的形態(tài)，獲得間質(zhì)細(xì)胞表型，即E-cadherin表達(dá)減少，N-cadherin表達(dá)增高，細(xì)胞的黏附能力降低，運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。本研究顯示，胃癌中Versican高表達(dá)者，臨床上患者處于進(jìn)展期，更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并且5年無病生存率較低。但也有研究認(rèn)為胃癌上皮細(xì)胞中Versican高表達(dá)者患者預(yù)后較好[20]。這與本研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)橛^察目標(biāo)不同，本研究觀察的是胃癌細(xì)胞周圍的間質(zhì)纖維母細(xì)胞中的Versican，胃癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化后，上皮成分減少，間質(zhì)成分增多，間質(zhì)中的Versican表達(dá)也增多，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，形成惡性循環(huán)。

綜上所述，胃癌組織中Versican和N-cadherin的表達(dá)均增高，而E-cadherin的表達(dá)則減少，并且Versican與N-cadherin呈正相關(guān)，與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)，Versican是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這提示Versican可能是通過調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來促進(jìn)胃癌發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移的，Versican有望成為判斷胃癌預(yù)后的標(biāo)志物，其具體機(jī)制需開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)予以進(jìn)一步證實(shí)。