閔逸飛，應(yīng)小燕

0 引 言

子宮內(nèi)膜異位癥是一種良性的婦科炎癥性疾病，子宮內(nèi)膜組織異常，育齡婦女發(fā)病率高，高達(dá)10%[1]。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，育齡婦女子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病率高達(dá)15%，全球患者數(shù)量超過2億，近年來發(fā)病率逐年上升。治療方案主要是藥物治療和手術(shù)治療，但藥物治療的不良反應(yīng)普遍比較大，手術(shù)治療風(fēng)險高，并發(fā)癥多[2]。有文獻(xiàn)報道，miRNAs在乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等多種婦科疾病中起調(diào)控作用，但在子宮內(nèi)膜異位癥中的研究較少[3-5]。miR-205-5p在子宮內(nèi)膜異位癥患者中表達(dá)降低，且通過靶向子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的 ANGPT2 抑制人類子宮內(nèi)膜異位癥的進(jìn)展[6]，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。眾所周知，miRNAs通常與其靶mRNA共同作用，通過mRNA的降解影響癌癥的發(fā)生發(fā)展[7]。血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)屬于血小板衍生生長因子(PDGF)/血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族，以二硫鍵連接的同二聚體形式存在[8]。此外，VEGFA可誘導(dǎo)血管生成，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞凋亡，并參與內(nèi)皮細(xì)胞的生理和病理生物學(xué)過程[7]。本研究旨在探討miR-205-5p通過靶向VEGFA對子宮內(nèi)膜異位癥患者異常表達(dá)的影響機(jī)制，為子宮內(nèi)膜異位癥的治療提供理論的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集2019年8月-2020年12月因良性婦科疾病在南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院60例行子宮切除術(shù)患者的組織和血清樣本，將患者樣本分為子宮內(nèi)膜異位癥(EC)組(n=30)與正常子宮內(nèi)膜(EN)組(n=30)，接受激素治療或同時患有惡性腫瘤的患者被排除在外。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號：[2019]YLB016)。

1.2 主要試劑與設(shè)備RIPA裂解液(KL131008250)和雙熒光素酶報告試劑盒(RG027)及Tunel試劑盒(C1098)均購自上海碧云天生物科技有限公司。Trizol試劑盒(15596-026)購自Invitroge。熒光定量PCR儀(7300)購自美國ABI公司，顯微鏡是上海光學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

1.3 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞獲取及處理收集子宮內(nèi)膜組織，用PBS沖洗3次，用無菌眼剪切破碎，加入5 mLI型膠原酶(1 mg/mL)，在37 ℃培養(yǎng)箱中消化60 min，每20 min攪拌一次。然后將混合的細(xì)胞懸液通過200和400目不銹鋼細(xì)胞過濾器進(jìn)行過濾。然后在DMEM/F-12培養(yǎng)基和37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

使用免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色鑒定子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞純度。用0.3%Triton-X-100 37 ℃孵育30 min，4%甲醛固定30 min，用5%牛血清白蛋白室溫封閉20 min，然后用波形蛋白一抗(ab8978和Abcam)抗體4 ℃過夜。使用一抗孵育之后，分別采用0.3%Triton-X-100和PBS沖洗3～4次，加入一抗所對應(yīng)的二抗，37 ℃的環(huán)境下孵育40 min。最后，加入100 μL 4,6-生物胺-2-苯甲酰(DAPI)15 min，沖洗，甘油密封，熒光顯微鏡觀察。

使用轉(zhuǎn)染技術(shù)在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-205-5p模擬，將細(xì)胞分為NC模擬組、miR-205-5p模擬組、NC模擬+質(zhì)粒組、miR-205-5p模擬+質(zhì)粒組和miR-205-5p模擬+VEGFA組。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測mRNA的表達(dá)量利用RT-PCR技術(shù)檢測組織、細(xì)胞和血液樣本中miR-205-5p的表達(dá)。使用Trizol試劑提取組織、細(xì)胞和血液樣本中的總RNA。使用SYBRGreen定量PCR試劑盒完成PCR反應(yīng)，反應(yīng)的體系及反應(yīng)的條件，均按照試劑盒的說明進(jìn)行實驗，并放置實時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，并采用2-ΔΔCt計算相關(guān)因子的表達(dá)量。

1.5 CCK-8細(xì)胞增殖實驗將不同方法處理的細(xì)胞接種于96孔的反應(yīng)板中，接種后，分別于24 h、48 h、72 h后加入CCK-8的溶液，并放置酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測。

1.6 采用5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(Edu)法檢測細(xì)胞增殖情況將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×106/mL，以每孔500 μL接種于，預(yù)覆蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)基每3 d更換一次。在每個設(shè)定時間點前2 h，加入50 μLEdU培養(yǎng)物，沖洗細(xì)胞，加入細(xì)胞固定液。按照EdU試劑盒的說明書進(jìn)行染色，并拍照并計數(shù)。

1.7 蛋白印跡法檢測增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)采用蛋白印跡法檢測增殖[增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、Ki67]相關(guān)蛋白和凋亡(Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。加入含PMSF(Bio-Rad)的細(xì)胞裂解液，冰下裂解細(xì)胞20 min，4 ℃，離心5 min，收集上清液，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度，進(jìn)行蛋白定量。10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜上，5%的脫脂奶粉封閉，加入一抗，4 ℃孵育過夜。加入一抗對應(yīng)的二抗孵育2 h，用TBST洗滌顯影。利用ImageJ軟件對其灰度值進(jìn)行分析。

1.8 細(xì)胞凋亡根據(jù)凋亡試劑盒說明，在不同方法處理的細(xì)胞中加入緩沖液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含有5 μL AnnexinV/FITC和10 μL碘化丙啶的流動管中，室溫孵育0.5 h，流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.9 劃痕實驗將不同方法處理的細(xì)胞接種于6個孔的反應(yīng)板中，培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞滿85%時，使用微采樣器垂直交叉，PBS洗滌，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察并記錄了細(xì)胞的遷移情況。使用ImageJ軟件從6～8條水平線中計算細(xì)胞間距離的平均值。

1.10 Transwell實驗在Transwell上室中加入200 μL不同方法處理的細(xì)胞懸液，下室中加入600 μL10%胎牛血清培養(yǎng)基。孵育24 h后，固定中性甲醛，染色1%結(jié)晶紫，顯微鏡下計算NC模擬組、miR-205-5p模擬組、NC模擬+質(zhì)粒組、miR-205-5p模擬+質(zhì)粒組和miR-205-5p模擬+VEGFA組細(xì)胞數(shù)量。

1.11 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炇褂秒p熒光素酶檢測試劑盒(Promega)檢測細(xì)胞中熒光素酶的反應(yīng)強(qiáng)度，使用相對熒光素酶活性(%)表示絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)基因的表達(dá)水平。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用配對t檢驗比較miR-205-5p在正常和異位子宮內(nèi)膜組織和血清中的表達(dá)差異。使用非配對t檢驗比較兩組獨立樣本之間的差異性。使用單因素方差分析兩組及以上的差異性。使用雙因素方差分析CCK-8實驗不同組間的差異性。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-205-5p在組織和血液中的表達(dá)與正常子宮內(nèi)膜(EN)組相比，子宮內(nèi)膜異位癥(EC)組患者的組織和血液中miR-205-5p的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，見圖1。

a：組織樣本；b：血液樣本

2.2 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞純度檢測培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞大多數(shù)呈梭形，細(xì)胞生長達(dá)滿視野需要7 d，傳代后細(xì)胞生長達(dá)滿視野需要3 d。通過免疫熒光鑒定出兩種細(xì)胞的特性，波形蛋白(vimentin)陽性是基質(zhì)細(xì)胞，角蛋白(cytokeratin)陽性是上皮細(xì)胞，見圖2。

圖2 Vimentin/Cytokeratin免疫熒光染色鑒定分離的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(×400)

2.3 miR-205-5p對異位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-205-5p模擬后，miR-205-5p的表達(dá)顯著提高(P<0.01)。CCK8、EdU和Western Blot實驗結(jié)果表明，與NC模擬組相比，miR-205-5p模擬組細(xì)胞活力和增殖下降(P<0.01)，細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白(PCNA、Ki67)水平降低(P<0.01)。提示miR-205-5p顯著抑制子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和活力。見圖3。

a：RT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率；b：CCK-8檢測細(xì)胞活力；c：EdU檢測細(xì)胞增殖；d：Western blot檢測增殖相關(guān)蛋白

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與NC模擬組相比，miR-205-5p模擬組細(xì)胞凋亡增加(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9)表達(dá)升高(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)降低(P<0.01)。提示miR-205-5p促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡。見圖4。

a:流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡；b:Western blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

2.4 miR-205-5p對異位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移侵襲的影響進(jìn)一步使用劃痕實驗和Transwell來檢測miRi-205-5p過表達(dá)對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。結(jié)果顯示，miR-205-5p模擬組子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低(P<0.01)。與NC模擬組相比，miR-205-5p組的遷移和侵襲相關(guān)蛋白(Cox-2、MMP-2和MMP-9)的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。提示miR-205-5p可抑制子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移和侵襲。見圖5。

a：遷移實驗檢測細(xì)胞的遷移能力;b:Transwell檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力;c:Western blot實驗檢測遷移與侵襲相關(guān)蛋白

2.5 miR-205-5p的下游靶基因篩選及鑒定結(jié)果使用生物信息學(xué)來預(yù)測miR-205-5p的結(jié)合位點，見圖6。并使用雙熒光素酶報告基因分析來驗證VEGFA是miR-205-5p的靶點，見圖7。與健康個體相比，子宮內(nèi)膜異位癥組織中VEGFA的表達(dá)明顯增加(P<0.01)，見圖8，提示miR-205-5p可能負(fù)調(diào)控VEGFA。RT-PCR和免疫印跡檢測顯示，過表達(dá)miR-205-5p后，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中VEGF的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，見圖9、圖10。這表明VEGFA是miR-205-5p的一個靶點，并受到負(fù)調(diào)控。

圖6 生物信息學(xué)預(yù)測miR-205-5p 的靶標(biāo)

*P<0.01

*P<0.01

*P<0.01

*P<0.01

2.6 拯救實驗探索miR-205-5p和VEGFA對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的影響的結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染過表達(dá)VEGFA質(zhì)粒后，VEGFA在細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高;CCK8和EdU實驗結(jié)果表明，與miR-205-5p模擬+質(zhì)粒組相比，miR-205-5p模擬+VEGFA組的細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖顯著升高(P<0.01);見圖11。

a:RT-PCR檢測VEGFA的表達(dá);b:CCK-8檢測細(xì)胞活力;c:EdU檢測細(xì)胞增殖

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與miR-205-5p模擬+質(zhì)粒組相比，miR-205-5p模擬+VEGFA組的細(xì)胞的凋亡顯著降低(P<0.01)，見圖12。提示VEGFA的過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-205-5p過表達(dá)引起的細(xì)胞的凋亡升高。

與NC模擬+質(zhì)粒組相比，*P<0.01；與miR-205-5p模擬+質(zhì)粒組相比，#P<0.01

Transwell和劃痕實驗結(jié)果表明，與miR-205-5p模擬+質(zhì)粒組相比，miR-205-5p模擬+VEGFA組的細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低，見圖13。提示VEGFA的過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-205-5p過表達(dá)引起的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的降低，以及細(xì)胞凋亡的升高。即miR-205-5p通過負(fù)調(diào)控VEGFA抑制細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，降低細(xì)胞的活力，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

a:Transwell實驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲；b:劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥(EM)是一種與雌激素相關(guān)的慢性良性婦科疾病，主要癥狀為痛經(jīng)、盆腔疼痛，可引起不孕，育齡婦女較高，易復(fù)發(fā)，并發(fā)癥較多[9]。EM具有生長迅速、侵襲性強(qiáng)、多器官轉(zhuǎn)移等類似惡性腫瘤的特點。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制有多種理論，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚[10-11]。

微小RNA(miRNA)是一組由18～25個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控后水平調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)中起關(guān)鍵作用[12]。有文獻(xiàn)報道m(xù)iRNA在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，影響腫瘤細(xì)胞的分化、凋亡、遷移[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，肺癌、肝癌、乳腺癌等常見的惡性腫瘤的發(fā)生可能與miRNA的異常表達(dá)有關(guān)[1]。有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜異位癥患者中，miR-34a-5p和AKT1基因的表達(dá)水平在子宮內(nèi)膜組織中呈負(fù)相關(guān)，提示miR-34a-5p可能通過靶向AKT1基因影響子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和自噬，并影響細(xì)胞的遷移及侵襲能力，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病[15-16]。miR-205-5p在子宮內(nèi)膜異位癥患者的組織和血清中的表達(dá)與健康者相比顯著降低[6]。

為了進(jìn)一步研究miR-205-5p對基質(zhì)細(xì)胞的增殖凋亡的影響。本研究采用轉(zhuǎn)染技術(shù)，以子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞為研究對象，轉(zhuǎn)染miR-205-5p模擬，過表達(dá)miR-205-5p。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-205-5p后，細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖降低，相反，細(xì)胞的凋亡增加。Ki67和PCNA屬于腫瘤細(xì)胞的增殖因子[17-18]，可以作為指標(biāo)來評估細(xì)胞的增殖狀態(tài)[19-20]。Bcl-2、Bax、裂解半胱天冬3和裂解半胱天冬9蛋白是細(xì)胞凋亡的重要因素，Bcl-2表達(dá)升高提示抑制凋亡，而Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表達(dá)升高可促進(jìn)凋亡[21-22]。過表達(dá)miR-205-5p后細(xì)胞的增殖相關(guān)蛋白(PCNA、Ki67)水平降低，凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9)的表達(dá)升高，Bcl-2的表達(dá)下降。提示miR-205-5p促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖和活力。

細(xì)胞的遷移和侵襲是一個復(fù)雜過程，受黏附因子的調(diào)控，從而實現(xiàn)在體內(nèi)的遷移和侵襲[23-24]。文獻(xiàn)報道表明，環(huán)氧化物酶Cox-2可上調(diào)MMPs的表達(dá)，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[25]。在子宮內(nèi)膜異位癥的研究中，MMP-9和 MMP-2可以作為子宮內(nèi)膜異位癥組織或者細(xì)胞侵襲能力檢測指標(biāo)之一[26]。本研究結(jié)果表明，miR-205-5p過表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移與侵襲相關(guān)蛋白(Cox-2、MMP-2、MMP-9)的表達(dá)。提示miR-205-5p降低子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

先前研究發(fā)現(xiàn)VEGFA在子宮內(nèi)膜異位癥組織和細(xì)胞中顯著高表達(dá)，miR-17-5p可以通過負(fù)調(diào)控VEGFA的表達(dá)來抑制子宮內(nèi)膜異位癥中的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[7]。本研究進(jìn)一步研究證實VEGFA的過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-205-5p過表達(dá)引起的細(xì)胞增殖的降低，細(xì)胞遷移和侵襲能力的降低。

綜述所述，miR-205-5p通過負(fù)調(diào)控VEGFA抑制細(xì)胞的增殖，降低細(xì)胞的活力，促進(jìn)其凋亡，同樣降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。