劉少貞，楊瓊，周俊亮，曹信瑜，陳越，劉青，王偉偉，宋晶

山西農業(yè)大學動物科學學院，太谷 030801

環(huán)境內分泌干擾物(environmental endocrine disrupting chemicals, EDCs)是一類存在于自然環(huán)境中的具有類激素效應的化學物質，EDCs可以干擾內源性激素的合成、分泌、轉運、結合和分解，內源性激素是維持生物體動態(tài)平衡、繁殖、發(fā)育和完整性的重要組成物質。大量使用EDCs會損傷生物體的生殖、發(fā)育、免疫、內分泌和神經系統(tǒng)，導致內分泌代謝失衡[1-2]。EDCs作為一類潛在危害性物質，大部分存在于水體環(huán)境中，對水生生物的影響較大。17α-甲基睪酮(17α-methyltestosterone, MT)作為一種常見的外源雄激素，對自然界中的生物有機體有很大的威脅，甲基睪酮易在魚類體內富集，從而發(fā)揮雄激素效應，對自然界魚類的種群造成結構平衡失調，影響自然界魚類的種群結構，因此我國從2001年開始禁止在水產養(yǎng)殖業(yè)使用甲基睪酮[3]。MT在環(huán)境中分布范圍十分廣泛，2010年在北京市區(qū)廢水檢測到MT，濃度為4.1～7.0 ng·L-1[4]，調查研究發(fā)現(xiàn)，2011年南京污水處理廠的MT檢測濃度為1.01～4.25 ng·L-1，在水體中檢測到雄激素總濃度為145.20 ng·L-1[5]。Backe等[3]的研究表明，在廢水處理廠附近的水域檢測到高達250 ng·L-1的MT，太平洋西北部的廢水處理設施的廢水中檢測到約2 000 ng·L-1的雄烯二酮。Rivero-Wendt等[6]研究發(fā)現(xiàn)，MT(99.9%純度)對斑馬魚具有潛在的遺傳毒性，同時會破壞魚體內正常生物酶活性代謝。Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，MT不同濃度的處理可以抑制鱖魚血清中類固醇相關激素睪酮(T)和雌二醇(E2)的合成，并且影響與之合成相關的基因的mRNA表達，在一定濃度范圍內會促進其生長發(fā)育速度，高濃度下則會抑制鱖魚的生長。以上研究表明，MT對魚類生長、代謝和發(fā)育等生理過程存在一定程度的影響，因此，筆者有意愿探究MT對稀有鮈鯽肝臟脂質代謝的影響，進而了解MT干擾魚類肝臟脂質代謝的作用途徑。

脂質代謝是生命有機體維持正常生命活動的必要代謝過程，而肝臟是動物進行脂質代謝的重要場所。研究表明，鄰苯二甲酸二異辛酯(diisooctyl phthalate, DEHP)可以提高大鼠脂肪和肝臟中脂質代謝相關基因的mRNA表達水平[8-9]，多溴聯(lián)苯醚(poly brominated diphenyl ethers, PBDEs)和壬基酚(nonyl phenol, NP)等作為飼料添加劑飼喂三刺魚(Gasterosteusaculeatus)和海鯛(Sparusaurata)，兩者體內脂質合成增加，脂質代謝相關基因表達顯著升高[10]。小鼠長期處于DEHP環(huán)境下會導致其肝臟脂質代謝相關mRNA水平顯著升高[11]。另外，外源性雄激素可以干擾褐鱒魚肝臟細胞的雌激素信號通路，進而影響其脂質代謝相關基因表達量[12]。研究表明，三氯生(triclosan, TCS)處理小鼠會導致小鼠肝臟功能紊亂，誘發(fā)肝細胞的結構性病變[13]。低劑量抗生素和鄰苯二甲酸酯(phthalic acid ester, PAEs)可以導致小鼠肝臟脂質代謝紊亂，引起脂肪沉積[14-16]。印度囊鰓鯰(Heteropeneustesfossilis)長時間處于氯化汞環(huán)境中，肝臟中的脂肪含量會顯著升高[17]。鱧(Ophiocephalusstriatus)生存在低濃度Cd2+環(huán)境中，其肝臟組織中脂質含量顯著降低，而在胡子鯰(Clarisfuscus)中則發(fā)現(xiàn)其肝臟中脂質含量顯著升高[18-20]。高濃度的雙酚A(bisphenol A, BPA)處理斑馬魚60 d可使得其肝臟脂質含量明顯升高[21]，17β-E2處理虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)可以引起其肝臟脂質含量顯著升高[22]。壬基酚(NP)處理的虹鱒魚會顯著增加虹鱒魚肝臟脂質積累[23]。BPA會干擾大鼠脂質代謝和合成過程，引起肝臟中脂質積累加劇[24]。金槍魚在多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyl, PCBs)處理下，肝臟出現(xiàn)明顯的細胞結構變化，出現(xiàn)了大量的組織空泡化等現(xiàn)象[25]。BPA會導致大鼠肝細胞萎縮，細胞胞漿呈現(xiàn)彌散狀，出現(xiàn)肉眼可見的脂滴[26]。二苯甲酮(benzophenone-3, BP-3)處理斑馬魚會導致其肝細胞出現(xiàn)排列高度紊亂、肝細胞分裂、細胞核肥大以及空泡化等現(xiàn)象出現(xiàn)，破壞肝臟的正常結構和生物學功能，引起脂質代謝紊亂[27]。氟化物可以對蟾蜍幼蟲的肝臟組織造成損傷，引起肝細胞結構紊亂，進而導致肝臟脂質代謝與合成過程發(fā)生紊亂，降低肝臟中脂質合成過程[28]。綜上所述，大量的EDCs會對動物肝臟脂質代謝造成不同程度的影響，在實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)稀有鮈鯽腹腔內存在大量脂肪沉積，因此我們推測MT也可能影響稀有鮈鯽肝臟脂質代謝過程。

脂質代謝過程是在多種酶的共同作用催化完成，其中主要包括乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA-carboxylase, ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)、肉毒堿棕櫚?；D移酶(carnitine palmitoyl transferase, CPT)和3磷酸甘油酰基轉移酶(glyceryl transferase 3 phosphate 1, GPAT)等。乙酰輔酶A(acetyl CoA)是脂肪酸從頭合成的底物，主要來源是經ATP檸檬酸裂解酶(ATP citrate lyase，ACLY)催化檸檬酸產生的。在ACC的催化作用下，乙酰輔酶A會生成丙二酰輔酶A(malonyl-CoA, MA)，ACC是脂肪酸從頭合成的限速酶，它有2種亞型，ACC1和ACC2分別由acaca和acacb基因編碼合成[28]。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)是脂肪酸合成的關鍵酶[29-30]，脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)是由7種不同功能的酶與1種酰基載體蛋白(acyl carrier protein, ACP)聚合而成的多酶復合體，它被fasn基因編碼合成，主要在肝臟和脂肪組織中表達[31]。FASN是將小分子碳單元聚合成長鏈脂肪酸的關鍵酶[32-33]，因此可以通過調控fasn基因表達以及FASN的酶活性從而達到調控脂肪酸的合成效率，進而改變脂肪沉積效率[34]。肉堿脂酰轉移酶1(CPT1)是脂肪酸β氧化過程中的限速酶。不同組織中的CPT1的活性不同，其中肝臟中的CPT1活性最強[35-36]。GPAT1可以催化脂肪酸中間產物脂酰輔酶A和外源攝取的脂肪酸形成溶血磷脂酸，而后進一步在多種酶復合反應下形成甘油三酯，是甘油三酯形成過程中重要的催化酶[37]。

研究發(fā)現(xiàn)，雄激素睪酮可以直接影響脂肪細胞關鍵功能，作為一種外源調節(jié)物質參與脂質代謝過程[38-39]。甲基睪酮可以減少雌倉鼠膽汁酸的分泌，促進膽固醇和磷脂合成[40]。甲基睪酮可以干擾脂質代謝過程紊亂增加其腹部脂肪積累，促進極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)合成，從而引起脂質代謝紊亂[41]。注射不同形式和水平的睪酮和睪酮類似物可以顯著增加肝臟中甘油三脂含量，而甘油三酯是脂質代謝過程中的重要組成物質，其含量變化會導致動物肝臟脂質代謝紊亂，引起脂肪沉積[42-43]。

本文選擇稀有鮈鯽作為試驗動物，探究MT對稀有鮈鯽肝臟脂質代謝的影響，可以為評估水生環(huán)境健康風險提供實驗指導，為闡明MT在稀有鮈鯽體內的作用機理提供理論依據(jù)，同時為推進稀有鮈鯽成為我國特有水生模式生物提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 暴露實驗

實驗用魚為實驗室繁殖的同一批8月齡稀有鮈鯽，平均體長(4.34±0.39) cm；平均體質量：雌魚(1.4840±0.3875) g，雄魚(1.3228±0.3557) g。每天9:00投喂紅蟲1次，投喂量為試驗魚體質量的3%，每次投喂的餌料試驗組魚都會在5 min內攝食完畢，在其攝食1 h后待其排泄后進行換水加藥。水溫控制在(25±1) ℃，光∶暗周期為14 h∶10 h。實驗設置對照組和處理組，MT分別為0、25、50和100 ng·L-1[44-45]，每組3個重復，雌雄魚分開，共24個水族箱，每個水族箱中60 L水，36尾稀有鮈鯽，采用半靜水暴露試驗[46]。換水為曝氣和過濾24 h的自來水，溫度與水族箱中水的溫度保持一致；換水一半后在水族箱中加入相應量的MT溶液，使同一濃度實驗組的所有水族箱中MT濃度保持一致。取樣前1 d停止投餌。稀有鮈鯽暴露于MT中7、14和21 d，每缸隨機選取8尾魚，每個處理組共24尾魚，12尾魚摘取肝臟置于波恩試液中，用于石蠟組織切片觀察，另外4尾魚肝臟用Trizol研磨充分裂解后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 石蠟組織切片制備

取出固定24 h后的組織，放置于組織包埋盒中，自來水緩沖12～14 h，將組織包埋盒取出脫水(50%、70%、80%、95%和100%乙醇中進行)，二甲苯進行透明處理；將透明好的組織浸蠟包埋(多次熬制去除大部分雜質的石蠟)，用鑷子把組織放于石蠟模具中，去除氣泡，放于65 ℃烘箱中透蠟30～60 min，取出后除去組織旁邊的氣泡自然降溫凝固；修整石蠟模塊，使用切片機將組織石蠟切成6 μm厚的組織切片，H-E染色法染色，中性樹脂膠封片處理，置于顯微鏡下觀察肝臟組織病理學變化。

1.3 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

參照RNAiso Plus試劑盒說明書對稀有鮈鯽肝臟組織樣本進行總RNA的提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，Nanodrop ND1000分光光度計測定其純度和濃度。取1 000 ng RNA，使用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time, TaKaRa)反轉錄合成cDNA第一鏈，獲得cDNA模板，合成后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實時熒光定量PCR引物

參考文獻[34, 47-48]中內參基因引物和脂質代謝相關基因引物(表1)。上海生工(Sangon Biotech)生物工程股份有限公司合成，為降低設計的引物的特異性以及引物二聚體和非特異性擴增產物對qRT-PCR的影響，對內參基因的普通PCR擴增產物進行凝膠電泳檢測，凝膠電泳條帶單一，清晰可見。

1.5 內參基因篩選

進行qRT-PCR之前，需要對稀有鮈鯽肝臟內參基因進行篩選，確定MT脅迫下稀有鮈鯽肝臟最穩(wěn)定內參基因，選擇β-actin、ef1a、gapdh、tuba1和g6pd作為候選內參基因，采用geNorm、NormFinder和BestKeeper這3種方法對內參基因數(shù)據(jù)進行分析評估。

1.6 實時熒光定量PCR

qRT-PCR檢測肝臟脂質代謝相關基因(acaca、acacb、fasn、gpat1和cpt1a)相對表達量以及稀有鮈鯽qRT-PCR引物參考，送上海生工(Sangon Biotech)生物工程股份有限公司合成。

實驗采用TB Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNase H Plus)試劑盒(TaKaRa，大連)進行qRT-PCR實驗，每個組織設置3個重復，qPCR為20 μL體系(上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL(100 ng)，熒光染料SYBR Green Ⅱ 10 μL，滅菌超純水ddH2O補充至20 μL)，混合均勻，置于冰上快速加到八連管中。PCR程序為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃復性30 s；40個循環(huán)；熔解曲線(95 ℃ 10 s，52 ℃，0.5 ℃)。

1.7 甘油三酯含量測定

將肝臟組織從-80 ℃取出，按照組織質量與預冷磷酸緩沖液(PBS)體積1∶9的比例將肝臟研磨勻漿，勻漿過程中保持在冰上操作，同時保證組織研磨充分，確保組織中的蛋白充分釋放，勻漿液呈均勻分布。制備好的10%組織勻漿液使用高速低溫離心機離心，2 000 g·min-1、4 ℃、10 min，取上清液，棄掉下面的沉淀，使用全功能微孔板檢測儀進行預試驗，確定組織勻漿是否需要稀釋，若濃度過高則稀釋1倍～10倍，作為使用液測定其蛋白含量，使用甘油三酯試劑盒(GPO-PAP酶法，南京建成生物工程研究所)測定，ELISA方法測定其OD值，蛋白定量(TP)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定，BCA微板法校準蛋白濃度，根據(jù)說明書公式，乘以稀釋倍數(shù)計算其最終樣本濃度。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

按照geNorm、NormFinder和BestKeeper這3種方法[49]的數(shù)據(jù)處理要求，對Cq值進行處理，對內參基因的表達穩(wěn)定性進行評估，最終確定最合適的內參基因。RT-qPCR數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCq，計算公式為F=2-ΔΔCq，ΔCq處理組=(Cq目的基因處理組平均值-Cq內參)；ΔCq對照組=(Cq目的基因對照組平均值-Cq內參)，ΔΔCq=ΔCq處理組-ΔCq對照組[50-51]。用SPSS 24.0軟件One-way ANOVE方法分析組間差異，并利用GraphPad Prism 8.0制作統(tǒng)計分析表，用Duncan's多重比較來確定組間差異，P<0.05、P<0.01為差異顯著。

表1 稀有鮈鯽基因引物合成序列Table 1 Sequence of primers for gene synthesis in G. rarus

2 結果(Results)

2.1 肝臟組織變化

2.1.1 MT對稀有鮈鯽雌魚肝臟組織學影響

石蠟組織切片結果顯示，對照組稀有鮈鯽雌魚肝臟組織結構完好，細胞呈現(xiàn)正常肝細胞索，排列整齊，細胞核完好，結構完整(圖1A、1A1和1A2)；MT不同濃度處理組均出現(xiàn)了不同程度的組織結構損傷。25 ng·L-1MT處理稀有鮈鯽7 d，稀有鮈鯽肝臟組織細胞發(fā)生了細胞核溶解和細胞核偏移，細胞排列散亂，細胞間隙明顯增大(圖1B)；延長處理至14 d，肝臟組織細胞出現(xiàn)大量水樣變性、空泡化、核溶解以及肝細胞腫脹，胞漿內有大小不等的空泡等(圖1B1)；延長處理至21 d，組織細胞出現(xiàn)核溶解、肝血竇淤血以及細胞核固縮等情況，細胞不規(guī)則的散亂排列(圖1B2)。50 ng·L-1MT處理稀有鮈鯽7 d，組織細胞結構出現(xiàn)空泡化、細胞核大量溶解，圖中細胞明顯變少(圖1C)；延長處理至14 d，組織細胞出現(xiàn)了大量的空泡化和肝臟組織細胞脂肪變性，細胞核溶解增多(圖1C1)；延長處理至21 d，組織大面積的細胞核消失，脂肪變性和顆粒細胞變性和肝血竇淤血，組織呈現(xiàn)明顯的病理變化(圖1C2)。100 ng·L-1MT處理稀有鮈鯽7 d，肝臟組織變化明顯，組織出現(xiàn)了區(qū)域性壞死、肝細胞脂肪變性以及細胞核溶解(圖1D)；延長處理至14 d，肝臟顆粒變性、肝脂肪變性、細胞溶解、細胞縮小、細胞核偏移以及細胞結構散亂，組織的結構完整性被破壞(圖1D1)；延長處理至21 d，出現(xiàn)了肝顆粒細胞變性、核固縮、肝脂肪變化和肝血竇淤血等(圖1D2)。

圖1 稀有鮈鯽雌魚肝臟組織病理變化注：A、B、C和D為17α-甲基睪酮(MT)(對照組、25、50和100 ng·L-1)處理雌魚7 d肝臟組織；A1、B1、C1和D1為MT(對照組、25、50 和100 ng·L-1)處理雌魚14 d肝臟組織；A2、B2、C2和D2為MT(對照組、25、50和100 ng·L-1)處理雌魚21 d肝臟組織；HE為正常的 肝細胞，KL為細胞核溶解，NM為細胞核偏移，Voc為空泡化，NA為組織細胞壞死區(qū)域，PN為細胞核固縮，F(xiàn)DL為肝脂肪變性， GVD為顆粒空泡變性， CLS為肝血竇淤血，F(xiàn)D為脂肪變性。Fig. 1 The histopathological changes in the liver of female G. rarusNote: A, B, C, and D respectively represent the liver tissue changes of the control group, 25, 50, and 100 ng·L-1 17α-methyltestosterone (MT) treatment groups of female fish for 7 d; A1, B1, C1, and D1 respectively represent the liver tissue changes of the control group, 25, 50 and 100 ng·L-1 MT treatment groups of female fish for 14 d; A2, B2, C2, and D2 respectively represent the liver tissue changes of the control group, 25, 50 and 100 ng·L-1 MT treatment groups of female fish for 21 d; HE stands for normal nucleus; KL stands for nuclear lysis; NM stands for nuclear shift; Voc stands for vacuolation; NA stands for necrotic area of tissue cell; PN stands for nucleus pyknosis; FDL stands for fatty degeneration of liver; GVD stands for granular-vacuolar degeneration; CLS stands for congestion of liver sinusoids; FD stands for fatty degeneration.

2.1.2 MT對稀有鮈鯽雄魚肝臟組織學影響

石蠟組織切片結果顯示，對照組稀有鮈鯽雄魚肝臟組織結構完好(圖2A、A1和A2)。MT(25 ng·L-1和50 ng·L-1)處理稀有鮈鯽雄魚7 d，肝臟組織出現(xiàn)大量的空泡化，細胞核溶解、肝臟細胞水泡變性以及肝血竇淤血(圖2B和2C)。100 ng·L-1MT處理稀有鮈鯽7 d，肝臟組織細胞出現(xiàn)了顆?？张葑冃院透沃咀冃?圖2D)。25 ng·L-1MT處理稀有鮈鯽雄魚14 d，稀有鮈鯽肝臟組織細胞排列散亂，肝細胞索出現(xiàn)排列不整齊，出現(xiàn)細胞溶解、細胞核溶解以及細胞核固縮等變化(圖2B1)。50 ng·L-1MT處理稀有鮈鯽雄魚14 d，組織細胞出現(xiàn)了大面積肝顆?？张葑冃院图毎巳芙猓毎尸F(xiàn)不規(guī)則形態(tài)(圖2C1)。100 ng·L-1MT處理稀有鮈鯽雄魚14 d，細胞核溶解，細胞部分溶解，細胞所占比例較少(圖2D1)。25 ng·L-1MT處理稀有鮈鯽雄魚21 d，組織細胞間存在較大的間隙，細胞與細胞之間聯(lián)系散亂，存在細胞核溶解現(xiàn)象(圖2B2)，MT(50 ng·L-1和100 ng·L-1)處理稀有鮈鯽雄魚14 d，組織細胞的變化明顯，組織細胞顆粒變性嚴重，細胞出現(xiàn)水泡變性和細胞溶解現(xiàn)象(圖2C2和2D2)。

圖2 稀有鮈鯽雄魚肝臟組織病理變化注：A、B、C和D為MT(對照組、25、50和100 ng·L-1)處理雄魚7 d肝臟組織；A1、B1、C1和D1為MT(對照組、25、50和100 ng·L-1) 處理雄魚14 d肝臟組織；A2、B2、C2和D2為MT(對照組、25、50和100 ng·L-1)處理雄魚21 d肝臟組織；HE為正常的肝細胞，KL為細胞 核溶解，Voc為空泡化，PN為細胞核固縮，HC為細胞核消失，F(xiàn)DL為肝脂肪變性，GVD為顆?？张葑冃?，CL為細胞溶解，CLS為肝血竇淤血， VD為空泡變性，KH為核溢血，GD為顆粒變性。Fig. 2 The histopathological changes in the liver of male G. rarusNote: A, B, C, and D respectively represent the liver tissue changes of the control group, 25, 50, and 100 ng·L-1 MT treatment groups of male fish for 7 d; A1, B1, C1, and D1 respectively represent the liver tissue changes of the control group, 25, 50 and 100 ng·L-1 MT treatment groups of male fish for 14 d; A2, B2, C2, and D2 respectively represent the liver tissue changes of the control group, 25, 50 and 100 ng·L-1 MT treatment groups of male fish for 21 d; HE stands for normal nucleus; KL stands for nuclear lysis; Voc stands for vacuolation; PN stands for nucleus pyknosis; HC stands for disappearance of nucleus; FDL stands for fatty degeneration of liver; GVD stands for granular-vacuolar degeneration; CL stands for cell lysis; CLS stands for congestion of liver sinusoids; VD stands for vacuolar degeneration; KH stands for nuclear hemorrhage; GD stands for granular degeneration.

2.2 geNorm、NormFinder和BestKeeper方法分析內參基因穩(wěn)定性結果

如geNorm結果所示，基因的相對表達量的平均穩(wěn)定值(M)的大小依次為tuba1 (1.64)>g6pd(1.41)>gapdh(1.14)>β-actin和ef1a(0.92)。M值越小，則基因的穩(wěn)定性越大，反之，則越不穩(wěn)定。以M值以1.5為界限，若M>1.5，則基因在體內不能穩(wěn)定表達(圖3A)。NormFinder結果顯示，內參基因M值分別為β-actin(0.314)、ef1a(0.354)、tuba1 (0.516)、g6pd(0.404)和gapdh(0.383)，由此可知，5個候選內參基因穩(wěn)定性大小排序為：β-actin>ef1a>gapdh>g6pd>tuba1，表明β-actin的表達穩(wěn)定性最高，tuba1的表達穩(wěn)定性最低(圖3B)。BestKeeper分析結果顯示，β-actin和gapdh的標準差和變異系數(shù)最低，β-actin的標準誤差最小，β-actin的相關系數(shù)最大，其算數(shù)平均值和幾何平均值都最小，其相對表達量較高。因此，基因的穩(wěn)定性大小為β-actin>gapdh>ef1a>g6pd>tuba1(表2)。

圖3 MT處理稀有鮈鯽肝臟內參基因穩(wěn)定性注：(a) GeNorm方法分析MT誘導稀有鮈鯽內參基因的表達穩(wěn)定值(M)； (b) Normfinder方法分析MT脅迫下稀有鮈鯽內參基因的表達穩(wěn)定值(M)。Fig. 3 Stability of reference genes in liver of G. rarus exposed to MTNote: (a) shows GeNorm method analysis of expression stability value (M) of each internal reference gene of G. rarus induced by MT; (b) shows Normfinder method analysis of expression stability value (M) of each internal reference gene of G. rarus induced by MT.

表2 Bestkeeper分析MT誘導下稀有鮈鯽內參基因表達穩(wěn)定性Table 2 The expression stability of reference genes under MT exposure in G. rarus by Bestkeeper

根據(jù)上述3種方法對所有內參基因的分析評估，分別確定了不同的排序，在此基礎上，對其進行加權平均值的計算，β-actin基因在3種方法中表達最穩(wěn)定，可以確定為最穩(wěn)定的基因。其余3個基因gapdh、g6pd和tuba1表達量和穩(wěn)定性均不高，不推薦作為內參基因使用。內參基因穩(wěn)定性綜合排序為，β-actin>ef1a>gapdh>g6pd>tuba1，確定β-actin為最適合的內參基因(表3)。

2.3 MT對稀有鮈鯽肝臟acaca、acacb、fasn、gpat1和cpt1α mRNA相對表達量的影響

通過上述試驗篩選出的最佳內參基因，對肝臟中5個脂質代謝相關基因做熒光定量PCR實驗，確定基因在肝臟中的相對表達量的變化，進而根據(jù)肝臟組織學的變化聯(lián)合基因相對表達量的變化情況分析MT對稀有鮈鯽肝臟脂質代謝的影響。

acaca基因mRNA表達量在50 ng·L-1濃度組處理7 d時雄魚表達量顯著升高(P<0.05，圖4A1)；雌魚和雄魚在100 ng·L-1處理7 d時都顯著升高(P<0.05，圖4A和4A1)；延長處理至14 d時，雄魚在3個處理組都表現(xiàn)為顯著升高；延長處理至21 d，只有100 ng·L-1實驗組雄魚表達量顯著下降(P<0.05，圖4A1)。acacb基因mRNA表達量在處理7 d后，雌魚在25 ng·L-1和50 ng·L-1組中的表達量顯著降低(P<0.05，圖4B)，而雄魚在100 ng·L-1處理組則表現(xiàn)為顯著升高(P<0.05，圖4B1)；處理延長至14 d時，雄魚在25 ng·L-1和50 ng·L-1處理組表達量顯著降低(P<0.05，圖4B1)。fasn基因mRNA表達量在處理7 d后，雌魚在100 ng·L-1處理組表達量顯著升高，而延長處理至21 d，25 ng·L-1處理組表達量顯著升高(P<0.05，圖4C)。雄魚在處理7 d時，50 ng·L-1處理組fasn基因mRNA表達量顯著升高，延長處理至14 d，3個處理組表達量均顯著下降(P<0.05，圖4C1)。3個處理組中雌魚gpat1基因mRNA表達量并未發(fā)生顯著變化(P>0.05，圖4D)；25 ng·L-1處理7 d后雄魚表達量顯著下降；延長處理至14 d，25 ng·L-1和50 ng·L-1處理組表達量顯著下降；在處理21 d后，25 ng·L-1和50 ng·L-1處理組表達量顯著升高，100 ng·L-1處理組表達量顯著降低(P<0.05，圖4D1)。cpt1α基因mRNA表達量在處理7 d后，25 ng·L-1處理組雌魚表達量顯著降低，50 ng·L-1和100 ng·L-1處理組顯著升高；延長處理至14 d，25 ng·L-1和50 ng·L-1處理組顯著升高，100 ng·L-1處理組顯著降低(P<0.05，圖4E)。雄魚在25 ng·L-1和50 ng·L-1處理組處理7 d，表達量顯著降低；延長處理至14 d，25 ng·L-1處理組顯著升高；處理21 d時，50 ng·L-1和100 ng·L-1處理組表達量顯著降低(P<0.05，圖4E1)。

2.4 稀有鮈鯽肝臟甘油三脂含量變化

MT處理稀有鮈鯽雌魚7 d，100 ng·L-1處理組中甘油三脂含量顯著低于對照組；延長處理至21 d，50 ng·L-1處理組甘油三酯含量顯著高于對照組(P<0.05，圖5A)。MT處理稀有鮈鯽雄魚14 d，50 ng·L-1處理組甘油三酯含量顯著高于對照組，延長處理至21 d，3個處理組甘油三酯含量無顯著變化(P>0.05，圖5B)。

3 討論(Discussion)

肝臟參與全身代謝活動，參與機體的脂質代謝和糖代謝等生命活動[52]，脂質代謝是三大基本代謝之一，脂質種類繁多，可以作為能量代謝物質，而且作為細胞結構的支撐物質，脂質骨架結構是維持人體正常生命活動的重要組成物質[53]。脂質組學是檢測脂質變化的重要手段，可以全面對環(huán)境中存在的脂質進行含量測定[54]。肝臟對脂質代謝的穩(wěn)態(tài)對于所有生物都是至關重要的作用，肝臟在污染物積累和解毒過程中起著不可替代的作用。氟化物損傷中華蟾蜍幼體肝臟組織，降低肝臟中脂質合成以及脂質相關基因mRNA表達，造成蟾蜍幼體脂質代謝紊亂[28]。BPA顯著抑制稀有鮈鯽肝臟acaca、acacb、fasn、gapt1和cpt1α基因的表達[34]。FAS是產生脂肪酸的主要細胞質酶[55]，在肝臟中高度表達，是由fasn基因參與調控合成的，在所有生物膜中具有重要的作用，也是能量代謝的重要結構物質[56-58]。本研究表明MT干擾稀有鮈鯽肝臟中脂質代謝相關基因的mRNA表達，MT在稀有鮈鯽雌雄魚肝臟內的作用方式存在一定差異，因此推測MT通過干擾脂質合成與代謝相關基因與酶類，影響脂質合成與代謝，進而損傷肝臟組織與細胞。

表3 MT誘導下稀有鮈鯽候選內參基因表達穩(wěn)定性排名Table 3 Stability ranking of gene expression in G. rarus candidate reference under MT exposure

圖4 稀有鮈鯽肝臟脂質代謝相關基因mRNA表達量變化注：A、A1為acaca基因在稀有鮈鯽雌魚和雄魚中的mRNA表達量；B、B1為acacb基因在稀有鮈鯽雌魚和雄魚中的mRNA表達量； C、C1為fasn基因在稀有鮈鯽雌魚和雄魚中的mRNA表達量；D、D1為gpat1基因在稀有鮈鯽雌魚和雄魚中的mRNA表達量；E、E1 為cpt1α基因在稀有鮈鯽雌魚和雄魚中的mRNA表達量，*表示顯著(P<0.05)，**表示顯著(P<0.01)，與對照組相比。Fig. 4 Changes of mRNA expression levels of genes related to lipid metabolism in liver of G. rarusNote: A, A1 show the mRNA expression of acaca gene in females and males of G. rarus; B, B1 show the mRNA expression of acacb gene in females and males of G. rarus; C, C1 show the mRNA expression of fasn gene in females and males of G. rarus; D, D1 show the mRNA expression of gpat1 gene in females and males of G. rarus; E, E1 show the mRNA expression of cpt1a gene in females and males of G. rarus; *indicates significant difference (P<0.05), **indicates significant difference (P<0.01), compared with the control.

圖5 MT對稀有鮈鯽肝臟甘油三酯影響注：(a)展示稀有鮈鯽雌魚肝臟甘油三酯含量；(b)展示稀有鮈鯽雄魚肝臟甘油三酯含量；*表示與對照組相比，差異顯著(P<0.05)。Fig. 5 Effects of MT on triglyceride of liver in G. rarusNote: (a) shows the content of triglyceride in the liver of female G. rarus; (b) shows the content of triglyceride in the liver of male G. rarus; *indicates significant difference compared with the control (P<0.05).

石蠟組織切片結果表明，MT對稀有鮈鯽肝臟組織產生不可逆轉的損傷，造成肝臟細胞大量的顆粒細胞變性、水泡變性、細胞溶解和肝脂肪變性等病理現(xiàn)象，ELISA結果顯示，脂質代謝與合成相關酶表達量發(fā)生了變化，F(xiàn)ASN、GPAT1和CPT1α等表達量的變化影響肝臟脂質沉積和甘油三酯代謝過程，從而引起了肝組織病變。MT會對主要在肝臟中合成的基因及其編碼合成的蛋白產生影響，從而導致組織細胞發(fā)生病變，使其失去了部分維持正常代謝的功能，破壞了細胞的正常結構功能。研究表明，MT會引起雌倉鼠脂質代謝相關基因mRNA表達量發(fā)生變化，進而導致調控維持細胞結構的脂質結構和磷脂含量等發(fā)生變化，引起細胞結構的病變[40]。在研究MT對稀有鮈鯽的毒性效應時發(fā)現(xiàn)，MT會在一定濃度內發(fā)揮雄激素效應，當其濃度過高后會出現(xiàn)MT代謝轉化為甲基雌二醇[59-61]。另外，在自然界中雄激素作用于雌激素受體，可能是由于雄激素在代謝過程中發(fā)生了芳香化，結合雌激素受體在體內發(fā)揮作用[62-63]。脂質結構是維持細胞正常形態(tài)的重要部分，其相關基因的表達量發(fā)生變化時，其編碼的蛋白會隨之發(fā)生變化，進而導致組織學病變。脂質代謝相關基因gpat1表達量發(fā)生變化，會影響其編碼合成的蛋白表達，前人的研究表明，GPAT1可以調節(jié)脂質代謝過程中的磷脂酸合成[37]，引起肝細胞的脂質分布及含量發(fā)生改變，引發(fā)脂肪變性和肝細胞顆粒變性。線粒體損傷是誘導肝細胞病變的主要原因，與肝臟脂質代謝紊亂有關，可以通過外部藥物誘導，抑制線粒體脂肪酸氧化酶影響脂質代謝過程，從而引起肝臟細胞的空泡化[64]。CPT1是線粒體內的重要限制酶，因此，其表達量的變化會引起組織細胞結構的變化。在羅非魚日糧中加入銅元素，可以嚴重破壞肝臟組織結構，表現(xiàn)出明顯的肝臟細胞組織結構發(fā)生脂肪變性和濁腫變性[65]?？R西平(carbamazepine, CBZ)引起脂質代系紊亂可能是由線粒體功能障礙引起[66]。在研究TCS對斑馬魚的影響時發(fā)現(xiàn)，TCS可以對斑馬魚的脂質代謝過程產生影響[67]。脂質代謝紊亂可以誘導肝臟細胞空泡化和脂肪變性等[68-70]。本研究結果表明，MT處理稀有鮈鯽7～21 d，肝臟組織細胞發(fā)生了空泡化和肝脂肪細胞變性以及細胞核溶解等現(xiàn)象，因此推測MT通過干擾cpt1a和gpat1基因表達引起稀有鮈鯽肝臟脂質代謝過程紊亂，進而致使肝臟組織學發(fā)生病變。

Bhattacharjee等[71]的研究表明，acaca和acacb基因編碼ACCα和ACCβ這2個蛋白，在脂質代謝過程中發(fā)揮重要的作用。McClintick等[72]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中缺乏VA會導致小鼠肝臟中fasnmRNA表達量顯著降低；VA可以顯著提高FAS酶活性，從而提高fasnmRNA的表達量，促進肝臟脂質代謝的合成和積累[73]。紫蘇和魚油顯著降低大鼠肝臟脂肪酸合成酶基因的mRNA表達[74]。HNF1α可以抑制肝臟脂質合成與代謝，促進脂肪分解，并促進胰島素信號通路的激活[75]。肝臟miR-146a的過表達可以促進脂肪酸的氧化代謝，進而改善了葡萄糖和胰島素耐受性以及肝臟中脂質的積累[76]。斑馬魚長期暴露在啶酰菌胺下，可以對斑馬魚肝臟造成損傷，啶酰菌胺可以顯著降低肝臟中甘油三脂含量以及FAS和ACC酶活性，引起脂質代謝紊亂[77]。ZnO誘導鯽魚(Carassiusauratusauratus)肝臟產生自由基，大量自由基會破壞細胞脂質結構，引起肝細胞結構功能異常，從而引起脂質代謝紊亂[78]。這說明了內分泌干擾物可以干擾脂質代謝過程，引起脂質合成和分解異常，對水生動物的肝臟造成一定程度的損傷。這與本研究結果相似，MT處理稀有鮈鯽的過程中，隨著時間的延長，造成肝臟的脂質代謝異常以及相關基因mRNA表達量的變化，從而調控脂質代謝相關酶的合成和分解，造成肝臟脂質沉積。

acaca基因編碼ACC1蛋白主要在肝臟和脂肪中表達，是參與脂肪酸的從頭合成過程的重要酶，其催化產生的MA可促進脂肪合成和儲存組織中脂肪酸[79]。acacb基因編碼線粒體外膜蛋白ACC2，ACC2催化產生的MA可抑制CPT1，而CPT1是將長鏈脂肪酸轉移進入線粒體的必需酶，因此，ACC2在抑制脂肪酸的氧化分解供能過程中發(fā)揮主要作用[80]。研究表明，在小鼠的肝臟細胞中，CPT1表達量的增加使甘油三酯的積累降低35%，同時也引起其分泌量降低了60%。同時體內試驗也表明，CPT1表達量的升高導致瘦弱和肥胖小鼠中甘油三酯含量顯著降低[81]。本研究結果顯示，100 ng·L-1MT處理稀有鮈鯽雌魚7 d，甘油三酯含量顯著下降，而cpt1a基因mRNA表達量顯著升高。這與前人研究結果相同。同時，acacb編碼合成的ACC2(ACCβ)在催化過程中會產生MA，可以抑制CPT1的產生，而GPAT1會競爭性抑制CPT1，而CPT1是β-脂肪酸氧化過程中的限速酶，因此，CPT1酶的基因表達量會與acacb和gpat1基因的mRNA表達量成反比。RT-qPCR結果顯示，acacb基因表達量與cpt1α基因表達量在雄魚中呈負相關，但是gpat1基因表達量在50 ng·L-1MT處理14 d時，出現(xiàn)了相反情況，這表明MT對稀有鮈鯽產生催化作用改變其原有的作用方式，調節(jié)cpt1a基因的表達方式發(fā)生了改變，促使其表達量顯著升高。FASN表達水平的升高能夠顯著地增加甘油三酯在體內的沉積而導致肥胖[27, 82]。MT處理稀有鮈鯽后，雌雄魚的fasn基因mRNA表達量呈現(xiàn)出不同的變化趨勢，雌魚在高濃度MT處理7 d和低濃度MT處理21 d，其mRNA相對表達量顯著升高。中濃度處理雄魚7 d，fasn基因表達量顯著升高，處理14 d時，所有處理組均表現(xiàn)為顯著下降趨勢，結合甘油三脂含量的變化趨勢可知，fasn基因mRNA表達量與甘油三酯含量呈負相關，因為FASN是脂質代謝合成過程中的關鍵酶，這表明MT會降低稀有鮈鯽雄魚肝臟FASN的合成，從而降低機體對甘油三脂的代謝，使得雄魚肝臟甘油三酯含量顯著升高。

GPAT1是催化甘油三脂形成過程中的重要酶，GPAT1主要在肝臟中表達，GPAT1位于線粒體中，參與脂肪酸的合成和酯化過程，并且可以競爭性地抑制CPT1的合成，從而在脂肪酸含量增加的情況下，確保脂肪酸進行酯化反應。同時，GPAT1參與甘油三酯和磷脂的從頭合成過程，可以通過調控磷脂和甘油二酯的水平來調控脂質代謝信號[37, 83]。本研究發(fā)現(xiàn)，MT處理組雌魚肝臟gpat1基因均未變化。MT處理雄魚7 d，25 ng·L-1處理組gpat1表達量顯著下降；延長處理時間至14 d，25 ng·L-1和50 ng·L-1雄魚處理組表達量顯著下降；處理21 d，25 ng·L-1和50 ng·L-1處理組表達量顯著升高，100 ng·L-1處理組表達量顯著降低。MT處理14 d，稀有鮈鯽雄魚3個處理組fasn基因mRNA表達量均顯著下降，而雌魚基因表達量無顯著變化。這說明，在MT處理下，雌魚并沒有受到影響，而雄魚在中低濃度處理組隨著時間的延長，所受影響呈現(xiàn)顯著性(P<0.05)。這一結果不同于前人的研究，由此結果推測，MT可以通過對肝臟脂質代謝合成過程中相關基因mRNA表達量的調控，改變脂質代謝過程中相關酶活性的表達，進而改變肝臟脂質的沉積效率。前人的研究表明，體內雄激素在脂肪組織中的代謝途徑呈性別特異性[41]，外源性激素對稀有鮈鯽脂質代謝與合成的影響存在性別依賴性[34]。因此推測，MT在稀有鮈鯽雌雄魚肝臟內代謝途徑存在性別差異，在稀有鮈鯽雌魚肝臟內MT被芳香化酶芳香化成雌激素，發(fā)揮雌激素作用。因此，MT對稀有鮈鯽脂質代謝影響存在性別差異性。

綜上所述，MT可以通過影響肝臟脂質代謝相關基因mRNA表達量以及脂質合成代謝相關酶類活性，進而干擾稀有鮈鯽體內肝臟脂質代謝過程，從而調控相關脂質的合成，干擾稀有鮈鯽肝臟脂質合成與甘油三酯水平，造成肝臟脂質代謝異常，損傷稀有鮈鯽肝臟組織及細胞形態(tài)。稀有鮈鯽肝臟脂質代謝相關基因gpat1和cpt1a對環(huán)境中MT較為敏感，可以作為檢測EDCs的有效生物標志物。我們將進一步深入研究MT對稀有鮈鯽脂肪組織脂質代謝相關轉錄因子影響及其調控機制，試圖闡明MT對稀有鮈鯽脂質代謝影響機制。