朱哲坤，譚子涵，王帥杰，寧 楠，汪曼麗，王 蕾,2，侯永清,2*

（1.武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430023）

豬流行性腹瀉病毒感染（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）是造成豬流行性腹瀉的重要病原體之一，其傳染性對養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)造成巨大威脅。本課題組前期已成功建立PEDV感染仔豬腸道損傷模型，在此模型下，PEDV感染會造成仔豬嚴(yán)重腹瀉并破壞仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，進而影響仔豬小腸的屏障功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道、肝臟和血液代謝物之間能相互作用，這種相互作用稱為“腸肝軸”作用。而肝臟是多功能器官，參與脂代謝、消化、蛋白質(zhì)合成。如果肝臟受損，脂質(zhì)代謝功能將受到影響，所以尋找一種能有效保護肝臟的物質(zhì)非常重要。

單月桂酸甘油酯（Monolaurin，ML）可以通過化學(xué)合成，也天然存在于母乳和椰子油等物質(zhì)中。月桂酸的碳鏈長度為12，是中鏈脂肪酸的一種。動物生產(chǎn)中，ML可以為初生仔豬供能，提高仔豬生長性能，降低肉雞腹脂，調(diào)節(jié)脂肪代謝。ML有很強的抗病毒能力，如林觀誼研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加ML能有效防控PEDV的傳播，減少哺乳仔豬的發(fā)病率；在對藍耳病病毒帶毒母豬日糧中添加ML能夠有效改善母豬健康，且未檢測到仔豬帶毒；ML對單純性皰疹病毒、艾滋病毒也有明顯抑制作用。ML對調(diào)節(jié)體內(nèi)脂代謝同樣具有良好的作用，有研究表明日糧中添加ML可以改善仔豬脂肪代謝，ML還可以通過脂質(zhì)代謝和甘油磷脂代謝調(diào)節(jié)對高脂飲食的小鼠起到抗肥胖作用。本文旨在研究ML對PEDV感染仔豬肝臟的保護作用，為ML在早期斷奶仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 豬流行性腹瀉病毒（PEDV，YN株）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物重點實驗室饋贈；ML購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計 試驗選用24頭平均體重（2.35±0.16）kg的7日齡健康斷奶仔豬（杜×長×大），隨機分為3個處理組（對照組、PEDV組、PEDV+ML組），每組8個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。正試期8 d，各組基礎(chǔ)日糧一致。在試驗第0～7天，對PEDV+ML組仔豬進行口腔灌服ML（與人工乳配成懸濁液，每天灌服劑量為100 mg/kg·BW），對照組與PEDV組仔豬口腔灌服等體積的人工乳。于試驗第5天，用口腔灌服的方式對PEDV組與PEDV+ML組仔豬進行PEDV感染（劑量為：1×10TCID），對照組仔豬口腔灌服等體積的PBS溶液。于試驗第7天晚上斷水?dāng)嗔?，?天早上空腹稱重，然后用戊巴比妥鈉（50 mg/kg·BW）肌肉注射麻醉，麻醉完全后屠宰取樣。

1.3 試驗日糧 試驗日糧使用的市售奶粉（商品名：紐瑞滋全脂奶粉），日糧的組成及營養(yǎng)水平為每100 g含能量2131 KJ、蛋白質(zhì)24.2 g、脂肪28.6 g、碳水化合物38.9 g、鈉264 mg和鈣875 mg。

1.4 飼養(yǎng)管理 豬舍為密閉豬舍，試驗前對豬舍及豬籠徹底清洗并消毒。對照組仔豬飼養(yǎng)在一間豬舍，PEDV組與PEDV+ML組仔豬飼養(yǎng)在另一間豬舍的不同豬欄，兩個豬舍建筑設(shè)計與室內(nèi)環(huán)境控制完全一致，嚴(yán)格控制兩個豬舍不交叉感染。試驗期間每天清掃豬舍2次，并用聯(lián)滅、百盛、百毒殺等消毒液交替消毒。維持室溫在22～25℃；每天飼喂5次，分別在08:00、12:00、15:00、18:00、22:00飼喂，早中晚3個時間點各增喂1次溫水。

1.5 樣品采集 試驗結(jié)束當(dāng)天將仔豬麻醉后屠宰，迅速取出肝臟，切取0.5 cm左右的肝臟組織塊，用冷生理鹽水沖洗2～3次，放入4%的多聚甲醛溶液進行固定。經(jīng)石蠟包埋、蘇木素-伊紅（HE）染色后制成肝臟病理切片。此外，取肝臟邊緣部分并切成小塊，放入EP管立即置于液氮中冷卻，然后將其轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中凍存，待測。

1.6 檢測指標(biāo)與方法

1.6.1 肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)對肝細(xì)胞密度和規(guī)則程度等形態(tài)特征進行觀察。

1.6.2 肝臟蛋白質(zhì)代謝指標(biāo) 用John Chandler法提取組織勻漿液中的DNA和RNA，用紫外吸收法測定提取液中RNA和DNA水平。使用總蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定肝臟總蛋白。

1.6.3 肝臟抗氧化指標(biāo) 肝臟過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫（HO）和丙二醛（MDA）含量均使用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測。

1.6.3 肝臟抗氧化和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因相對表達量的檢測 采用TRIzol（TaKaRa，大連）一步抽提法，提取肝臟研磨樣品中的總RNA，在保證RNA純度合格（A260：A280=1.7～2.1，且A260：A230＞2）且未降解的前提下，根據(jù)PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連）試劑盒的方法步驟對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，然后再采用實時熒光定量PCR（qPCR）的方法，以核糖體蛋白L4（）基因為內(nèi)參，對肝臟Ke IcH 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（）、肝臟核因子E2 相關(guān)因子 2（）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶2（）、血紅素加氧酶1（）、脂肪酸結(jié)合蛋白1（）、載脂蛋白A4（）、載脂蛋白C2（）、脂肪酸合成酶基因（）基因進行檢測。各個基因qPCR的數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)一參照Fu等的方法進行統(tǒng)計分析。檢測的基因序列見表1。

表1 檢測基因?qū)?yīng)的上下游引物序列

1.7 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中的Duncan′s法進行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 ML對PEDV感染仔豬肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 如圖1所示，對照組肝小葉分支清楚，小葉結(jié)構(gòu)明顯，大小一致，排列規(guī)則，中央靜脈及中央帶肝細(xì)胞清晰可見，肝細(xì)胞以中央呈放射狀排列，清晰的肝血竇少見，肝竇中的橢圓形黑色的為竇性細(xì)胞，周邊帶細(xì)胞正常排列，界限清晰，同時可以看到有少量炎性細(xì)胞浸潤。PEDV組肝細(xì)胞排列不規(guī)則，出現(xiàn)大面積的細(xì)胞空泡化，脂肪變性，部分細(xì)胞細(xì)胞核變形、溶解。與PEDV組相比，PEDV+ML組肝細(xì)胞大小一致，排列規(guī)則，且肝臟空泡化程度明顯減輕。

圖1 ML對PEDV感染仔豬肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.2 ML對PEDV感染仔豬肝臟核酸和蛋白質(zhì)水平的影響 從表2可以看出，與對照組相比，PEDV組的肝臟蛋白質(zhì)含量提高（＜0.05）；與PEDV組相比，PEDV+ML組肝臟蛋白質(zhì)和DNA含量提高（＜0.05）。

表2 ML對PEDV感染仔豬肝臟核酸和蛋白質(zhì)水平的影響

2.3 ML對PEDV感染仔豬肝臟抗氧化能力的影響 從表3可以看出，與對照組相比，PEDV組的肝臟CAT和SOD活性降低（＜0.05）；與PEDV組相比，PEDV+ML組肝臟SOD的活性提高（＜0.05），肝臟HO和MDA含量降低（＜0.05）。

表3 ML對PEDV感染仔豬肝臟抗氧化能力的影響

2.4 ML對PEDV感染仔豬肝臟相關(guān)基因相對表達量的影響 由表4可知，與對照組相比，PEDV組肝臟和基因的相對表達量上調(diào)（＜0.05）；與PEDV組相比，PEDV+ML組和基因的相對表達量上調(diào)（＜0.05），和基因的相對表達量下調(diào)（＜0.05）。

表4 ML對PEDV感染仔豬肝臟氧化和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因相對表達量的影響

3 討 論

3.1 ML對PEDV感染仔豬肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 Jphn等于1998年提出“腸肝軸”的概念，腸肝軸的各種細(xì)胞炎癥介質(zhì)相互作用，相互影響，構(gòu)成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。研究表明，PEDV感染嚴(yán)重影響仔豬腸道健康，使機體產(chǎn)生大量的氧自由基使腸道處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致腸道屏障功能受損，同時使腸道促炎細(xì)胞因子增加。而肝臟和腸道通過門靜脈循環(huán)和膽管樹相連，肝臟中70%血液是由腸道通過門靜脈循環(huán)來供應(yīng)，肝臟會持續(xù)暴露于腸道代謝產(chǎn)物中，故PEDV可能可以通過腸肝軸來影響仔豬肝臟的正常結(jié)構(gòu)功能。本試驗仔豬肝臟切片顯示，對照組肝臟細(xì)胞出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤，可能是由于小豬7 d斷奶改用人工飼喂導(dǎo)致的應(yīng)激；PEDV導(dǎo)致肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞空泡化，且部分細(xì)胞細(xì)胞核變形、溶解，而添加ML緩解了肝細(xì)胞的這些病變，使細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常。PEDV使仔豬肝臟受到損傷可能是由于PEDV影響腸道脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)基因，再通過腸肝軸來影響肝臟的脂質(zhì)代謝，而補充ML能通過防止控制肝臟代謝的核轉(zhuǎn)錄因子PPAR（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor，過氧化物酶體增殖物激活受體）的上調(diào)來改善肝臟脂質(zhì)代謝，在一定程度上緩解仔豬因PEDV處理導(dǎo)致的肝臟損傷。

3.2 ML對PEDV感染仔豬肝臟核酸和蛋白質(zhì)水平的影響 蛋白質(zhì)影響各種酶的合成、細(xì)胞生長，是生命活動的重要承擔(dān)者等。DNA濃度和蛋白/DNA比值的變化表明轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的改變。DNA濃度反映有絲分裂產(chǎn)生新的細(xì)胞的速度，RNA/DNA比值可以衡量細(xì)胞的增長速率。本試驗結(jié)果表明，口腔灌服ML提高了PEDV仔豬肝臟蛋白質(zhì)和DNA含量，說明添加ML可以促進肝細(xì)胞的蛋白合成，代謝加快。

3.3 ML對PEDV感染仔豬肝臟抗氧化能力的影響 肝臟MDA是酶與非酶脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，生物體內(nèi)自由基的指示物，廣泛地作為各種氧自由基損傷機體的指標(biāo)。SOD活力間接反映了機體清除氧自由基的能力，CAT反映了肝臟清除HO的能力。本試驗結(jié)果表明，PEDV刺激提高了仔豬肝臟HO含量，降低了CAT和SOD活性，表明PEDV刺激破壞了氧化還原狀態(tài)的平衡；日糧中添加ML提高了PEDV仔豬肝臟SOD活性，降低了HO和MDA含量，說明ML有提高PEDV仔豬的抗氧化能力。ML可能通過降低氧化產(chǎn)物含量和提高抗氧化相關(guān)酶活性來改善仔豬抗氧化能力。有關(guān)ML對仔豬肝臟抗氧化能力影響的研究較少，但有研究表明，同為中鏈脂肪酸的褐藻多糖硫酸酯可以增強體內(nèi)SOD活性，降低脂質(zhì)的過氧化程度，清除過多的自由基。Senthilkumar等試驗發(fā)現(xiàn)魚肝油萜可以在環(huán)磷酰胺引起毒性后使酶類和非酶類抗氧化劑正常化。故ML可以提高PEDV感染仔豬肝臟抗氧化能力。

3.4 ML對PEDV感染仔豬肝臟氧化和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因相對表達量的影響信號通路已被證明在抗氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著重要作用。本試驗研究表明，PEDV感染顯著上調(diào)了肝臟的相對表達量，而添加ML顯著上調(diào)了的相對表達量。Luo等研究表明，通過和的激活抑制組織的氧化應(yīng)激，從而可以減輕由過量服用醋氨酚引起的氧化應(yīng)激和肝損傷。本試驗結(jié)果顯示，添加ML顯著緩解了因PEDV刺激引起的肝臟和基因相對表達量的上調(diào)。參與調(diào)節(jié)脂代謝、糖代謝等多種代謝途徑并具有抗氧化和抗炎特性，有研究表明高脂肪飲食或脂肪變性可增加肝臟基因相對表達量。同樣的，是一種小的可交換性載脂蛋白，存在于富含甘油三酯的脂蛋白上，其基因表達隨著脂質(zhì)的增加而增加?？赡苁怯捎赑EDV感染仔豬造成仔豬肝臟脂質(zhì)代謝異常導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)積累，進而使得和基因的相對表達量上調(diào)，而ML則通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝功能來恢復(fù)肝臟和基因相對表達量。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果顯示，PEDV感染仔豬會出現(xiàn)肝臟組織形態(tài)異常并降低肝臟抗氧化和影響脂代謝相關(guān)基因表達，而ML可有效緩解PEDV感染仔豬肝臟細(xì)胞損傷，并提高仔豬肝臟抗氧化和改善脂代謝相關(guān)基因表達。