孫海超 于洪杰 陳德強

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種以骨小梁數(shù)量減少、骨質(zhì)密度降低、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞和骨脆性增加為主要特征的全身性骨骼疾病[1]，成骨細胞促進骨的形成與重建作用同破骨細胞促進骨的修復(fù)與重建作用之間的失衡是其主要的病理因素。美國NIH將OP定義為以骨強度下降和骨折風險增加為特征的骨骼疾病, 指出骨量降低是OP發(fā)生的主要因素，同時也存在其他因素增加患病風險。

各年齡段骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率都在增加，但更多見于絕經(jīng)后女性和老年人。隨著社會的發(fā)展，中國已經(jīng)進入老齡化社會，本病的發(fā)病率在持續(xù)升高，據(jù)不完全統(tǒng)計，2020年中國老齡化比例在17.7%左右，大大超出國際標準的10%，而因老年人肝腎虧虛，?；加蠴P，骨質(zhì)疏松導(dǎo)致骨脆性增加大大限制了老年人的日常生活，骨脆性的增加同時會導(dǎo)致骨折的頻發(fā)，嚴重影響生活質(zhì)量[2]。因此，在我國OP的預(yù)防與治療就顯得極為重要。臨床上OP主要以雙膦酸鹽類作為一線治療藥物，其次是核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化因子配體(RANKL)抑制劑[3]。中醫(yī)學雖未有骨質(zhì)疏松這一名詞，但類似于骨質(zhì)疏松癥狀的記載則可追溯至《黃帝內(nèi)經(jīng)》時期，并散見于歷代名家所著醫(yī)案中，如對“痹證”“骨傷” “痿病”等病證的記載。中醫(yī)學目前認為OP的發(fā)生主要與腎、脾、肝的功能密切相關(guān)，肝腎虧虛和脾虛等是發(fā)病的重要原因[4]。

補髓丹最早記載見于《是齋百一選方》，原文描述補髓丹如下：升神水于百會，降神火于涌泉，還淳返樸，體合自然，骨正筋柔，益壽延年。體現(xiàn)補髓丹補髓生精、和血順氣的作用，主治老年腎虛，腰痛，臂痛，久癆愈后，髓干精竭，血枯氣少，疲憊未復(fù)。因此本人認為補髓丹在治療肝脾腎虧虛所致的骨質(zhì)疏松方面有較好的預(yù)期作用，但中藥復(fù)方有著多成分、多靶點、藥物之間存在復(fù)雜的協(xié)同作用等特點，導(dǎo)致其具體作用機制尚不明確，本次研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學將藥物靶點網(wǎng)絡(luò)與生物信息網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，探討補髓丹治療OP的分子機制，為補髓丹后續(xù)探究以及臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 補髓丹的成分收集本次研究依托中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)[5]檢索補髓丹組成(補骨脂、杜仲、鹿茸、沒藥)的全部化學成分。

1.2 活性化合物及靶標蛋白的篩選中藥在人體內(nèi)會通過吸收、分布、代謝、排泄(ADME)的過程最終達到靶標器官及組織發(fā)揮其相應(yīng)作用，根據(jù)藥代動力學提供的標準，在TCMSP中選擇吸收、分布、代謝、排泄方面的藥物相似度(Druglikeness，DL)和口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)作為篩選標準，選擇同時滿足DL≥0.18和OB≥30%條件的成分并下載其mol格式的2D結(jié)構(gòu)和經(jīng)典化學結(jié)構(gòu)(SMILE結(jié)構(gòu))以用于靶點預(yù)測。將收集到的相關(guān)活性成分使用蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫Uniprot(http://www.uniprot.org)[6]確認預(yù)測的目標信息，得出補髓丹全部已知靶點。

將上述下載的MOL結(jié)構(gòu)輸入PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)[7]中，該平臺會自動根據(jù)輸入的MOL結(jié)構(gòu)相似度匹配預(yù)測靶點并發(fā)送到預(yù)先輸入的郵箱，篩選后可獲得補髓丹全部預(yù)測靶點。

1.3 補髓丹化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建目前得到的補髓丹化合物及其對應(yīng)目標之間均為零散狀態(tài)，為在系統(tǒng)水平上了解其相互之間復(fù)雜的關(guān)系，可利用Cytoscape 3.2.1軟件(http://cytoscape.org/)構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 疾病靶點的篩選通過人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫OMIM(https://omim.org/)[8、治療靶標數(shù)據(jù)庫TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[9]、人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards(https://www.genecards.org/)[10]、綜合型藥物數(shù)據(jù)庫Drugbank(https://go.drugbank.com/)[11]和疾病基因數(shù)據(jù)庫Disgenet(https://www.disgenet.org/)[12]，以O(shè)steoporosis(骨質(zhì)疏松)為關(guān)鍵詞搜索已知疾病靶點，利用uniprot數(shù)據(jù)庫對獲得的疾病相關(guān)靶點信息進行驗證篩選及補充。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建及其核心網(wǎng)絡(luò)的篩選利用Cytoscape 3.2.1中插件功能導(dǎo)入已整理的補髓丹全部靶點和骨質(zhì)疏松全部靶點，對兩網(wǎng)絡(luò)取交集,利用LAC、DC、Degree、Betweenness、Closeness等值對交集進行篩選，最終得出核心網(wǎng)絡(luò)。并利用Cytoscape 3.2.1對網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析，并進行插件網(wǎng)絡(luò)分析，分析網(wǎng)絡(luò)拓撲特性。

1.6 核心靶點的通路分析為了深入了解上述核心靶點通過何種通路以及生物過程和分子功能對預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松起作用，將核心靶點導(dǎo)入Metascape(https://metascape.org/)[13]數(shù)據(jù)庫分別進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和GO(Gene Ontology)分析，選擇物種為人類(Homo Sapiens)，閾值為P<0.05，并對富集分析結(jié)果進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選通過TCMSP平臺可檢索到杜仲147個、沒藥276個化合物信息，補骨脂以及鹿茸的相關(guān)成分在TCMSP中尚未收錄，因此采用BATMAN-TCM(a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)平臺[14]對其相關(guān)成分進行檢索，設(shè)置Score cutoff為20，P≥0.05為標準進行篩選，得出補骨脂14個、鹿茸15個化合物信息，將其返回TCMSP平臺搜索以保持與杜仲和沒藥相關(guān)化合物成分的數(shù)據(jù)一致性，根據(jù)設(shè)置的篩選條件(OB≥30%， DL≥0.18)進行篩選，最終獲得補骨脂3個、鹿茸2個、沒藥29個、杜仲23個，共計57個化合物，其中3個化合物為共有化合物。見表1。

表1 共有化合物一覽表

2.2 化合物靶點篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建上述總計54個化合物在TCMSP中Target選項卡中可查詢其已知靶點，取已驗證靶點，其中杜仲221個、補骨脂46個、沒藥198個、鹿茸28個。為保證數(shù)據(jù)的準確性，同時在PharmMapper網(wǎng)站基于MOL結(jié)構(gòu)對上述4種主要成分進行靶點預(yù)測，以Norm Fit≥0.85且靶點信息已驗證為標準進行篩選，獲得杜仲125個、補骨脂43個、沒藥108個、鹿茸24個。對以上靶點分類合并且在Excel中進行去重，最終獲得杜仲294個、補骨脂72個、沒藥268個、鹿茸48個靶點，為了在系統(tǒng)層面上了解各成分之間的相互作用，將上述數(shù)據(jù)重新整理，構(gòu)建network及type文件導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1中進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建并進行優(yōu)化。見圖1。

圖1 復(fù)方成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 骨質(zhì)疏松靶點篩選分別從OMIM、TTD、GeneCards、Drugbank和Disgenet數(shù)據(jù)庫中以O(shè)steoporosis(骨質(zhì)疏松)為關(guān)鍵詞獲取相關(guān)骨質(zhì)疏松靶點，舍棄未驗證靶點并去重后得到2480個骨質(zhì)疏松相關(guān)靶點，對上述靶點進行Uniprot編碼轉(zhuǎn)換，其中未被Uniprot收錄的靶點有214個，舍棄這部分未收錄靶點后得到骨質(zhì)疏松相關(guān)靶點共計2266個。

2.4 骨質(zhì)疏松與補髓丹的靶點交集利用Cytoscape 3.2.1中插件功能BisoGenet-Create a new network新建網(wǎng)絡(luò)并分別導(dǎo)入已整理的補髓丹全部靶點和骨質(zhì)疏松全部靶點，在彈出對話框中 Identifiers選項卡均選擇基因型為人類基因型(Homo sapiens)，映射對象為僅基因標識符(Gene identifiers only)，Data Settings選項卡中僅選擇蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-Protein Interaction)。最后點擊確定，系統(tǒng)自動根據(jù)導(dǎo)入數(shù)據(jù)分別生成補髓丹全部靶點網(wǎng)絡(luò)和骨質(zhì)疏松全部靶點網(wǎng)絡(luò)。對自動生成的兩網(wǎng)絡(luò)進行非矢量網(wǎng)絡(luò)分析(Analyze Network)后利用Merge-Network中取交集的功能對兩網(wǎng)絡(luò)取交集，獲得交集網(wǎng)絡(luò)共5002個節(jié)點，133268條相互關(guān)系。

2.5 補髓丹與骨質(zhì)疏松蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與篩選利用插件功能CytoNCA分析交集網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)屬性，利用Degree值中位數(shù)的2倍為初始條件篩選出初步核心網(wǎng)絡(luò)，用LAC、DC、Degree、Betweenness、Closeness等值進一步篩選，最終得出核心網(wǎng)絡(luò)，含有166個節(jié)點及2769條相互關(guān)系。見圖2。利用Cytoscape 3.2.1對網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析，并進行插件網(wǎng)絡(luò)分析，分析網(wǎng)絡(luò)拓撲特性?？芍狤GFR、JUN、MAPK1、SRC、TP53、ESR1、TP53、EP300、HDAC1、UBC和AKT1等為關(guān)鍵節(jié)點。

圖2 核心靶點篩選流程圖

2.6 靶點通路分析利用MetaScape數(shù)據(jù)庫對篩選出來的166個核心靶點分別進行GO和KEGG通路富集分析，其中GO分析過程應(yīng)分別對GOCC(Cell component 細胞成分)、GOBP(Biological process 生物過程)以及GOMF(Molecular function分子功能)進行分析。KEGG分析得出關(guān)鍵通路為癌癥通路，腫瘤轉(zhuǎn)錄失調(diào)，內(nèi)分泌抵抗，甲狀腺激素通路，胰島素抵抗信號通路，MAPK信號通路， PI3K-Akt信號通路，凋亡信號通路等。GOBP分析得出蛋白質(zhì)去泛素化，泛素依賴性蛋白分解過程，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)，對生長因子的反應(yīng)。GOMF分析得出泛素蛋白連接酶結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，轉(zhuǎn)錄調(diào)控空激酶結(jié)合，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合GOCC分析得出核染色體，轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體，蛋白酶體復(fù)合體，蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物?；谖⑸牌脚_(http://www.bioinformatics.com.cn/)將富集分析結(jié)果前20條制作成氣泡圖。見圖3、圖4。

圖3 KEGG分析前20位氣泡圖

圖4 GO分析前20位氣泡圖

3 討論

根據(jù)復(fù)方-靶點PPI交互圖可得沒藥和杜仲的共有成分β-谷甾醇和槲皮素以及補骨脂和沒藥的共有成分豆甾醇起到主要作用，查閱文獻可知豆甾醇具有抗氧化，抗腫瘤，抗炎癥，降低膽固醇以及鎮(zhèn)痛的作用[15]，這些作用同時在抗骨質(zhì)疏松方面起到重要作用；β-谷甾醇除具有與豆甾醇相似作用外，還具有更關(guān)鍵的調(diào)節(jié)骨代謝平衡的作用[16]，而骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制最重要的就是成骨細胞與破骨細胞之間的骨代謝平衡失調(diào)；槲皮素是一種黃酮類化合物,可有效促進MC3T3-E1細胞的成骨細胞分化[17],可抑制RAW264.7細胞中的破骨細胞生成。從調(diào)節(jié)骨代謝平衡方面骨小梁結(jié)構(gòu)的數(shù)量顯著增加,從而增強骨密度,預(yù)防骨質(zhì)疏松[18]。

KEGG富集分析表明補髓丹主要成分治療骨質(zhì)疏松主要涉及的通路有癌癥信號通路，胰島素信號通路，內(nèi)分泌抵抗信號通路，腫瘤轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號通路，凋亡信號通路，MAPK信號通路和 PI3K-Akt信號通路等多條通路。核心靶點中的TP53存在于凋亡通路中，主要作用為調(diào)控細胞周期和細胞分裂。MAPK1是MAPK的一個亞型，是MAPK信號通路的重要組成部分，許多胞外信號通過MAPK信號通路，參與成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化和凋亡，在骨質(zhì)疏松的發(fā)生中具有重要作用[19]而AKT1 則是 P13K/Akt 信號通路的重要組成部分，AKT1可在多種組織中表達，參與調(diào)節(jié)細胞的生長和增殖，有研究顯示，增強AKT 的激酶活性，可調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 4(Glucose Transporter 4，GLUT4)的表達和轉(zhuǎn)位，促進骨骼肌細胞對糖的消耗，這可能是促進機體糖代謝的重要過程。而葡萄糖可直接刺激破骨細胞的活性，促使骨量丟失[20]。同時TP53,MAPK,ESR1與AKT1均存在于內(nèi)分泌抵抗信號通路、癌癥信號通路和腫瘤轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號通路等多條與癌癥相關(guān)的通路，通過調(diào)控細胞生長分化分裂與凋亡，抑制癌癥基因的表達從而與骨質(zhì)疏松的發(fā)病密切相關(guān)[21]，同時內(nèi)分泌抵抗信號通路和胰島素信號通路還參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。有研究[22]表明，大約有23%的男性和18%的女性因骨質(zhì)疏松而導(dǎo)致非椎體骨折，而此比例在代謝綜合征患者中尤甚。目前已知肥胖、高血脂、高血糖和高血壓病等代謝異常狀態(tài)是與OP發(fā)生密切相關(guān)的因素[23]，因此糖尿病并發(fā)癥的通路也參與骨質(zhì)疏松的發(fā)病。而從Go富集分析中則可以看出補髓丹主要成分治療骨質(zhì)疏松主要可能與凋亡信號通路，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，轉(zhuǎn)錄激活因子，蛋白質(zhì)去泛素化，泛素依賴性蛋白分解過程，泛素蛋白連接酶以及核染色體，轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體，蛋白酶復(fù)合體等相關(guān)，提示補髓丹可能通過以上相關(guān)作用預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松。

綜上所述，補髓丹的有效成分通過多個途徑參與成骨與破骨過程，并且通過部分代謝通路參與骨質(zhì)疏松的發(fā)病。體現(xiàn)了補髓丹治療骨質(zhì)疏松多成分、多靶點、整體作用參與骨質(zhì)疏松進程，同時也警惕了我們某些發(fā)病不僅與疾病本身相關(guān)，代謝類疾病仍是我們需要關(guān)注的重點。本研究目前僅從網(wǎng)絡(luò)藥理學方面初步探究補髓丹預(yù)防與治療骨質(zhì)疏松的成分-靶點網(wǎng)絡(luò)途徑，從生物信息學方面闡述了補髓丹的作用機制，為后續(xù)臨床研究提供了理論支持。