柯葉鑫， 陳晶偉，2， 肖 順， 楊小龍， 程 曦， 劉國(guó)坤*

1福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002； 2江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221131

水稻OryzasatiuaL.是全世界最重要的糧食作物之一，擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogynegraminicola(Golden and Birchfield)作為水稻上最嚴(yán)重的植物寄生性線蟲(chóng)，廣泛分布于世界熱帶和亞熱帶水稻產(chǎn)區(qū)，因其經(jīng)濟(jì)危害性，被許多國(guó)家列為檢疫性線蟲(chóng)(Mantelinetal.,2017)。擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)在中國(guó)最早發(fā)現(xiàn)于海南的蔥AlliumfistulosumL.上(趙洪海等，2001)，2011年在福建省政和縣發(fā)現(xiàn)其危害水稻(劉國(guó)坤等，2011)。近幾年來(lái)，該根結(jié)線蟲(chóng)在湖北(Wangetal.,2017)、江蘇(馮輝等，2017)、江西(葉夢(mèng)斐等，2018)、海南(羅激光等，2018)、湖南(呂軍等，2019)等水稻種植區(qū)相繼發(fā)生危害，備受?chē)?guó)內(nèi)植物線蟲(chóng)界關(guān)注(黃文坤等，2018)。2019年，福建省福清市和福安市的直播稻區(qū)，水稻苗期發(fā)生大面積的根結(jié)線蟲(chóng)病，稻苗生長(zhǎng)嚴(yán)重不良。本研究對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)種進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并基于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，以明確其種類(lèi)。

1 材料與方法

1.1 根結(jié)線蟲(chóng)種群的采集

2019年5月，在福建省福清市江鏡鎮(zhèn)玉侖村與福安市溪潭鎮(zhèn)的上百畝直播稻的稻苗根系發(fā)生嚴(yán)重的根結(jié)線蟲(chóng)病害，樣本采集采用隨機(jī)采樣方法，隨機(jī)拔取100株植株，觀察植株發(fā)病率。并將采集根結(jié)樣本分裝進(jìn)聚乙烯薄膜自封袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行處理。

1.2 線蟲(chóng)的分離與純化

將采集的病根清洗干凈，在體視顯微鏡下檢查根結(jié)。將根結(jié)中的單卵囊挑出，接種于提前在滅菌沙土中培植的3葉期水稻根部，在溫室條件下培養(yǎng)，接種2周后可見(jiàn)有根結(jié)產(chǎn)生，正常水肥管理保存種群。純化的種群用于形態(tài)測(cè)定及分子檢測(cè)。形態(tài)測(cè)定的雌蟲(chóng)剖離于根結(jié)中，雄蟲(chóng)挑自根結(jié)卵囊膠質(zhì)物，2齡幼蟲(chóng)通過(guò)根結(jié)內(nèi)挑取的卵囊在無(wú)菌水中孵化后收集獲得。

1.3 線蟲(chóng)的形態(tài)觀察和測(cè)量

通過(guò)配備N(xiāo)ikon相機(jī)(DS-Ri1)的顯微鏡(Eclipse Ni-U 931609)觀察制作的線蟲(chóng)玻片。線蟲(chóng)的殺死、TAF固定、會(huì)陰花紋等標(biāo)本制作均參照張紹升(1999)。使用相機(jī)的配套軟件進(jìn)行拍攝并記錄根結(jié)線蟲(chóng)各形態(tài)特征圖片；各形態(tài)測(cè)量值按照De Man公式利用軟件進(jìn)行測(cè)計(jì)。

1.4 線蟲(chóng)分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 DNA提取方法 凍融裂解法(Liuetal.,2011)：把挑到的單條2齡幼蟲(chóng)在ddH2O清洗干凈之后，轉(zhuǎn)移至裝有15 μL線蟲(chóng)裂解液WLB (50 mmol·L-1KCl、10 mmol·L-1Tris pH 8.3、2.5 mmol·L-1MgCl2、0.45% NP40、4.5% Tween 20，pH=8.3)的PCR管內(nèi)，將PCR管在小型離心機(jī)快速離心后在液氮中浸泡約1 min，然后加1.5 μL蛋白酶K(1.0 mg·mL-1)到管內(nèi)。將PCR管放置于PCR儀中處理(65 ℃溫育1 h，95 ℃ 10 min)。

1.4.2 rDNA ITS區(qū)片段的擴(kuò)增和測(cè)序 使用25 μL反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，上游引物(10 μmol·L-1)1 μL，下游引物(10 μmol·L-1)1 μL，PCR Mix(Premix TaqTM， TAKARA)12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。

ITS區(qū)(ITS1-5.8S-ITS2)采用引物TW81(5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′)和AB28(5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′)擴(kuò)增(Maafietal.,2003)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃、4 min；94 ℃、30 s、55 ℃，30 s，72 ℃、60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃、5 min。

用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,確定目的性條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物寄送廣州擎科公司回收、純化、克隆，獲得目靶標(biāo)基因序列。

1.4.3 序列提交、分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 按照相應(yīng)序列提交步驟將得到的序列上傳至Genebank，獲取序列號(hào)。采用MAFFT比對(duì)，選擇G-INS-I模型進(jìn)行多序列比對(duì)分析(Katohetal.,2019)。將獲得的FASTA文件在網(wǎng)址http:∥sing.ei.uvigo.es/ALTER/中轉(zhuǎn)換格式，選擇Mrbayes轉(zhuǎn)換nexus格式，選擇RAxML轉(zhuǎn)換PHYLIP格式。在CIPRES Science Gateway(www.pholy.org)平臺(tái)上進(jìn)行在線序列分析(Milleretal.,2010)。分別使用MrBayes 3.2.6 on XSEDE (Ronquist & Huelsenbeck,2003)和RAxML-HPC2 on XSEDE (Stamatakisetal.,2017)進(jìn)行貝葉斯法與最大似然法分析。貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析采用GTR+I+G模式，運(yùn)算5000000代，每運(yùn)算100代對(duì)樹(shù)形進(jìn)行Markov chains采樣，剔除初始25%采樣；極大似然法分析采用GTRCAT模型，完成1000次自展重復(fù)。采用Figtree v1.4.3 (Page,1996)和dobe Illustrator CC在貝葉斯50%多數(shù)原則一致樹(shù)上標(biāo)注自展值和后驗(yàn)概率。

1.4.4 特異性引物檢測(cè) 在福清市與福安市的水稻區(qū)隨機(jī)各采集8只雌蟲(chóng)，使用擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物Mg-F/Mg-R(5′-TTATCGCATCATTTTATTTG-3′，5′-CGCTTTGTTAGAAAATGACCCT-3′)隨機(jī)擴(kuò)增單條雌蟲(chóng)(Htayetal.,2016)，PCR反應(yīng)程序：95 ℃，4 min; 94 ℃，30 s，51 ℃，30 s，72 ℃，30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min; 4 ℃保存。以實(shí)驗(yàn)室番茄LycopersiconesculentumMill.上保存的南方根結(jié)線蟲(chóng)為對(duì)照，以單條雌蟲(chóng)進(jìn)行擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

福清市與福安市的水稻區(qū)水稻根部根結(jié)線蟲(chóng)株發(fā)病率分別為68%與75%；經(jīng)形態(tài)與分子鑒定，均為擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)。

2.1 水稻根結(jié)線蟲(chóng)病主要癥狀特點(diǎn)

田間發(fā)病的水稻植株葉片萎蔫黃化，根系分蘗減少，與正常水稻比明顯矮小(圖1A)。受害水稻根系生長(zhǎng)嚴(yán)重衰退(圖1B)，很多根尖膨大后發(fā)生扭曲變形，呈現(xiàn)典型的勾狀結(jié)構(gòu)，也有部分根為不規(guī)則狀隆起或錘狀。根結(jié)處生長(zhǎng)出較細(xì)的側(cè)根也會(huì)被根結(jié)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)再次侵染，形成新根結(jié)(圖1C、D)。在體視鏡下鏡檢，雌蟲(chóng)和大多數(shù)卵囊包埋在根結(jié)內(nèi)，少數(shù)根表面有開(kāi)裂，露出卵囊，卵囊膠質(zhì)薄，卵粒松散。

圖1 擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)侵染水稻的癥狀特點(diǎn)

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

2.2.1 形態(tài)描述 雌蟲(chóng)球形或梨形，蟲(chóng)體大多尾尖突出明顯(圖2A)?？卺樌w細(xì)，針錐向背面彎曲，中食道球發(fā)達(dá)，排泄孔位于中食道球后(圖2D)。會(huì)陰花紋整體近似圓形，背弓中等或低，無(wú)側(cè)線。整體線紋連續(xù)且較為平滑，但在側(cè)區(qū)常見(jiàn)細(xì)碎紋路，這些細(xì)碎紋將平滑連續(xù)的線紋截?cái)啵纬刹灰?guī)則的條溝，通常成對(duì)出現(xiàn)，分布在背面或兩側(cè)面，花紋形狀顯得不自然，似人為撕裂一般；多數(shù)會(huì)陰花紋腹線連續(xù)平滑，或有彎曲。尾端陰門(mén)區(qū)，無(wú)或有少量紋路。側(cè)尾線孔小而明顯，其之間距離相對(duì)較近，小于陰門(mén)裂長(zhǎng)度(圖2B、C)。

雄蟲(chóng):蟲(chóng)體蠕蟲(chóng)狀，體環(huán)明顯；頭區(qū)低平，與體部無(wú)明顯縊縮，骨化明顯，有環(huán)紋?？卺槾謮?，針錐針桿界限明顯，與口針基部球連接處稍變窄，基部球近圓形。中食道球明顯，食道腺覆蓋腸于腹面，排泄孔位于半月體下約3個(gè)體環(huán)處(圖2E)。精巢單條，前伸，精巢內(nèi)充滿(mǎn)精子(圖2F)。蟲(chóng)體中部側(cè)區(qū)具有4條側(cè)線(圖2G)。交合刺發(fā)達(dá)，尾端窄圓(圖2H)。

2齡幼蟲(chóng)(second juvenile,J2):蟲(chóng)體細(xì)小，頭部頂端平截，頭區(qū)縊縮不明顯；口針纖細(xì)，基部球近橢圓形。中食道球清晰，排泄孔緊靠半月體(圖2I)。尾部細(xì)長(zhǎng)，末端尖細(xì)，有明顯缺刻，可見(jiàn)狹長(zhǎng)的透明區(qū)(圖2J、K)。體中部側(cè)區(qū)可見(jiàn)4條間距不同的側(cè)線(圖2L)。

圖2 擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)、2齡幼蟲(chóng)形態(tài)特征

2.2.2 形態(tài)測(cè)量 福安水稻與福清水稻上的根結(jié)線蟲(chóng)種群形態(tài)測(cè)量值見(jiàn)表1。從兩地采集的根結(jié)線蟲(chóng)種群形態(tài)特征與測(cè)量值均符合原始描述種(Golden & Birchfield,1965)。

表1 福安與福清水稻擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)種群雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)、2齡幼蟲(chóng)的形態(tài)測(cè)量值

2.3 分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 基于ITS-rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 將福清水稻與福安水稻上的擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)種群ITS區(qū)測(cè)序結(jié)果上傳至GeneBank，獲得福安市溪潭鎮(zhèn)水稻種群序列號(hào)(MT159689/579 bp)和福清市江鏡鎮(zhèn)水稻種群序列號(hào)(MT159690/579 bp、MT159691/579 bp)，通過(guò)NCBI中BLAST進(jìn)行比對(duì)，與其他擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)分離種群相似性在99%～100%。如圖3所示，依據(jù)比對(duì)結(jié)果挑選數(shù)據(jù)庫(kù)中29條序列，加上試驗(yàn)獲得序列3條，共32條序列，外群種設(shè)為Pratylenchusthornei(KR002683)，采用貝葉斯和極大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)將福清水稻和福安水稻群體與福建南平(HQ420902、HQ420903)、廣東(KR604732)、廣西(MN647545)、浙江(KY660543)、海南(KR604733)、緬甸(KR604734、KR604736)和印度(HM623442)種群歸為一個(gè)分支，表明實(shí)驗(yàn)室分離獲得的福清水稻和福安水稻群體與其他擬禾本根結(jié)線蟲(chóng)分離種群形成一個(gè)支持值高的支系(PP/BS=0.99/96)，可以確定其為擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)。

圖3 基于擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng) rDNA-ITS構(gòu)建的貝葉斯一致樹(shù)

2.3.2 特異性引物檢測(cè) 從福清水稻根部與福安水稻根部分離的根結(jié)線蟲(chóng)種群內(nèi)隨機(jī)挑取單雌蟲(chóng),經(jīng)提取DNA后，使用特異性引物Mg-F/Mg-R進(jìn)行擴(kuò)增，均得到369 bp的目的條帶(圖4)；南方根結(jié)線蟲(chóng)對(duì)照組無(wú)條帶，確定其種群為單一種群，均為擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)。

圖4 擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物Mg-F/Mg-R擴(kuò)增結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本次在福清與福安地區(qū)的直播稻苗期上發(fā)現(xiàn)的根結(jié)線蟲(chóng)病，經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定為擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)，這是福建省首次在直播稻上發(fā)現(xiàn)擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)危害。擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)能侵染旱稻、低洼地水稻、灌溉稻、深水稻，嚴(yán)重制約亞洲部分國(guó)家或地區(qū)的水稻產(chǎn)量(Mantelinetal.,2017)。該線蟲(chóng)能在多種稻田生態(tài)環(huán)境存活，但主要針對(duì)田間濕潤(rùn)或沙漏田、旱田等，長(zhǎng)期淹水條件不利其侵染與繁殖(黃文坤等，2018)。近年來(lái)，擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)在中國(guó)多個(gè)省份稻區(qū)相繼發(fā)生，與水稻栽培模式改變，特別與直播稻栽培技術(shù)推廣有關(guān)。直播稻的優(yōu)勢(shì)在于節(jié)省勞動(dòng)力，但直播稻芽期水層薄、根系淺、透氣性好，適合該線蟲(chóng)侵染、繁殖、傳播。針對(duì)我國(guó)直播稻種植面積的擴(kuò)大，擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)病應(yīng)引起足夠重視。

擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)寄主范圍廣，可在禾本科、十字花科、茄科等90多種作物物和雜草上侵染危害，其中，田間或野外禾本科雜草可能是其最主要的初侵染來(lái)源。如擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)在福建省最早于2011年發(fā)現(xiàn)于南平市政和縣的一溪床改造的沙漏田發(fā)現(xiàn)，田間調(diào)查表明，其侵染源為水溝中的雜草寄主油芒SpodiopogonsibiricusTrin.、早熟禾PoaannuaL.、莎草CyperusrotundusL.等雜草寄主(劉國(guó)坤等,2011)。Zhouetal.(2015)在福建漳州地區(qū)的香蕉MusananaLour.上，Chenetal.(2019)在福建莆田的韭菜AlliumtuberosumRottler ex Sprengle上均發(fā)現(xiàn)擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)，這2個(gè)新寄主上的擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)均可侵染水稻。這些結(jié)果都預(yù)示著擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)在福建省野外雜草或一些作物寄主上可能廣泛存在。鑒于擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)的經(jīng)濟(jì)危害性，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)該線蟲(chóng)的寄主范圍，特別是其野外寄主與分布的調(diào)研。